Name: isolation of primary mouse hepatocytes for nascent protein synthesis analysis by non-radioactive l-azidohomoalanine labeling method
Uploaded: 2018-10-23T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Primary Mouse Hepatocytes for Nascent Protein Synthesis Analysis by Non-radioactive L-azidohomoalanine Labeling Method at JoVE.com

אנו מודים ד"ר Joonbae Seo ו ויויאן Hwa עבור קלט מדעי ודיון שלהם. עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי לבריאות (NIH) (R01DK107530). T.N. נתמכה על ידי אוטם יפן המדע, הטכנולוגיה הסוכנות. חלק של מחקר זה נתמך על ידי מענק של NIH (P30DK078392) עבור מרכז הליבה המחקר של מחלות העיכול בסינסינטי.

פרוטוקול זה מכיל את השימוש עכברי מעבדה. טיפול בבעלי חיים ונהלים ניסיוני בוצעו על פי הנהלים אושרו על ידי הוועדות טיפול בבעלי חיים של המרכז הרפואי של בית החולים לילדים בסינסינטי.
1. בידוד של העכבר הראשי Hepatocytes
<ol><li>הכנות קדם בידוד<ol>
<li>להכין 450 מ ל 40% צפיפות מאגר הדרגתי כפי שמתוא...

למרות מספר שורות תאי הכבד מונצחים יש כבר הציע והשתמשת לחקור פונקציות הכבד49,50,51,52, תאים אלה חסרים בדרך כלל חשוב ובסיסי פונקציות של hepatocytes רגיל, כגון הביטוי של אלבומין (איור 3). זה מוכר ברבים, לכן, כי ניצול hepat...

חלבון הוא מרכיב תזונתי חשוב, כ-50% מהמשקל היבש של גוף האדם מורכב של חלבונים אשר יש מספר תכונות ביולוגיות, פונקציות1. כתוצאה מכך, סינתזת החלבון הוא אחד האירועים רב רוב האנרגיה, שינוי חלבון מטבוליזם קשורה מאוד להתפתחות של מחלות, כולל מחלות מטבוליות-2,-3,-4. בכבד, חלבון ביוסינטזה חשבונות עבור 20-30% מכלל האנרגיה הכוללת צריכת5,6. בנוסף, הפונקציה חלבונים לא רק פסיבי או בניית בלוקים של הכבד, אבל גורמים מתווכים-אות פעיל גם intracellularly או extracellularly כדי לווסת את חילוף החומרים מערכתית7. למשל, הפחתת רמות של אלבומין, אשר מסונתז והוא מופרש על ידי הכבד ואת החלבון הנפוץ ביותר של פלזמה8, מגביר את הסיכון של סוג 2 סוכרת פיתוח9,10, 11, ואילו ריכוז גבוה יותר של אלבומין הוא מגן מפני לפתח תסמונת מטבולית12. יתר על כן, להפריע או שיבוש חלבונים הכבד הפרשה או מאוגד-ממברנה, אשר לווסת את הכולסטרול הומאוסטזיס, לרבות lipoproteins, LDLR LRP1, יכול להוביל להתפתחות של תנגודת לאינסולין, היפרליפידמיה או טרשת עורקים 13. לכן, הזיהוי של המנגנונים המולקולריים הקשורים pathophysiological המעורבים חלבון הפרעה מטבוליזם בכבד, סיבוכים מטבוליים המשויכת שלו עשוי להיות שימושי עבור גילוי הרומן תרופתי גישות מפגר תחילת או לטפל במחלות מטבוליות כגון עמידות לאינסולין, סוכרת, כבד שומני אלכוהוליים.
סינתזה של חלבון מקושר באופן הדוק למצב האנרגיה התאית (למשל, היווצרות של קשר פפטידי אחד במהלך השלב התארכות של סינתזת חלבונים דורש phosphodiester 4 אג ח14) הוא מוסדר על ידי מסלולים מולקולריים המרגישות אינטר - ו intra - cellular זמינות חומרי הזנה15,16. מופעל כח פרוטאין קינאז (AMPK) הוא אחד חיישנים תאיים אנרגיה לשמור על הומאוסטזיס אנרגיה17. ברגע AMPK מופעל כאשר רמות האנרגיה התאית הופכים התחתון, AMPK ותערובות יישוב שלה לפעול כדי לעורר מסלולים קטבולי ומעכבות התהליכים האנאבוליים כולל חלבון סינתזה18,19. התקנון של סינתזת חלבונים מתווך על ידי זירחון של מספר חלבונים ribosomal20וגורמי תרגום. ראוי לציין, בתרבית של היעד של rapamycin 1 מורכבים (mTORC1), מנהל התקן הגדולות של סינתזת חלבונים, היא אחת המטרות המרכזיות של AMPK21. הפעלה של הנתיב mTORC1 משפר את צמיחת תאים והתפשטות על ידי גירוי חלבון autophagy ותרגום20,21. לכן זה הגיוני כי הפעלה של AMPK יכול לעכב סינתזת חלבון בתיווך mTORC122. אכן, הפעלה של AMPK מנטרל, ישירות phosphorylates mTORC1 על שאריות תראונין 2446 (חמישי2446) המוביל שלה איון23 דיכוי חלבון ביוסינטזה24. יתר על כן, AMPK בעקיפין יכול לעכב mTORC1 פונקציה על ידי זרחון והפעלה של tuberous טרשת נפוצה מורכבים 2 (TSC2)25 המהווה הרגולטור במעלה הזרם של המפל איתות mTORC1. בקיצור, dysregulation של המסלולים הללו בכבד קשורה פעמים רבות התפתחות מחלות מטבוליות, ולכן אין צורך חיוני בהקמת יעיל ניסוי כלים לחקור את התפקיד של המסלולים הללו בוויסות של אנרגיה, חלבון מטבוליזם ב hepatocytes.
יש דמיון חזק בין מאפייני hepatocytes העיקרי מבודד פונקציונלי ויוו hepatocytes מאשר עם במבחנה הכבד-derived תא קווים26,27,28. הוכח כי ראשי hepatocytes האנושי לשתף 77% דמיון עם זה של ביופסיות כבד, בעוד HepG2 תאים, אשר הינם תאים סרטניים הכבד היטב הבדיל בשימוש נרחב כדי לחקור פונקציות הכבד, להציג פחות מ- 48% בהקשר של ביטוי גנים פרופילי29. לכן, ניצול hepatocytes הראשית, יותר מאשר מונצחים התרבות תאים, הוא בעל חשיבות בחקירת תפקוד הכבד, פיזיולוגיה, מספר פרוטוקולים זמינים עבור הבידוד והתרבות של ראשי hepatocytes במיוחד של חולדות30,31. אמנם hepatocytes עכברוש שימושיים עם תשואה גבוהה יחסית של תאים, hepatocytes העכבר יש פוטנציאל גדול בהיבטים מדעיים רבים בגלל הזמינות רחב של עכברים גנטית מאופנן. עם זאת, ישנם מספר אתגרים טכניים לבודד בריא ושופע hepatocytes העיקרי של עכברים עבור הערכות סלולאריים מולקולריים מבוססות: ראשית, בצינורית ההכנסה כדי perfuse את הכבד עם ריאגנטים מאגר קשה מאוד להתמודד עם בשל וריד שער קטן ורזה העכבר או הכלילי; שנית, זמן רב יותר מניפולציה של תאים בתקופת הבידוד יכול לגרום להפחתת תא בכמות ובאיכות; שיטות הפרדה מכניות השלישי, שאינם אנזימטי יכול לגרום נזק חמור ומפיקים תשואה נמוכה של קיימא hepatocytes העיקרי מבודד32,33. בשנות ה-80, טכניקה זלוף collagenase הוצג לבידוד hepatocytes מ הכבדים של חיות34. שיטה זו מבוססת על collagenase זלוף של הכבד35,36,37, אינפוזיה של הכבד עם סידן chelator פתרון38,39, עיכול אנזימטי, דיסוציאציה מכני של הכבד parenchyma35. בשלב הראשון, כבד עכבר הוא perfused עם סידן [Ca2 +] מאגר חינם המכילה [Ca2 +] chelator (חומצה tetraacetic ethylenediamine, EDTA). בשלב השני, הכבד העכבר הוא perfused עם מאגר המכיל collagenase כדי hydrolyze את האינטראקציות מטריצה חוץ-תאית הסלולר. בניגוד המאגר המשמש בשלב אחד, הנוכחות של יונים [Ca2 +] במאגר של השלב השני נדרשת לפעילות יעילה collagenase, לאחר מכן את הכבד מתעכל יש נוספת מכנית ובעדינות יופרדו באמצעות מלקחיים בין כמוסת הכבד ורקמות parenchymatous. לבסוף, רקמת חיבור מוסר על-ידי סינון, ומפריד צנטריפוגה עוקבות hepatocytes קיימא מתאי parenchymal הן, שאינם חיים hepatocyte עם השימוש של צפיפות מאגר הדרגתיות40,41 ,42. במחקר הנוכחי, אנו מראים טכניקה זלוף collagenase שני שלבים ששונה כדי לבודד hepatocytes העיקרי של כבד עכבר לניתוח של סינתזת החלבון.
Radiolabeling של חלבונים נעשה שימוש נרחב כדי לכמת את רמות הביטוי, שיעורי מחזור, לקבוע את התפלגות הביולוגי של חלבונים43 עקב הרגישות הגבוהה של גילוי הרדיואקטיביות44. עם זאת, השימוש של איזוטופים רדיואקטיביים דורש מחקר מבוקרת מאוד הנסיבות והנהלים45. שיטות אלטרנטיביות שאינו רדיואקטיבי פותחו, יש יותר ויותר זכו לפופולריות רבה. התגובה מצדו הכימותרפיה סלקטיבית עם שיטת זיהוי החלבון Tetramethylrhodamine (טמרה) הוא אחד מהם, והוא מבוסס על התגובה הכימותרפיה סלקטיבית בין אלקין ו קבוצות46, אשר יכול להיות מנוצל כדי לנתח הסלולר אירועים כגון זיהוי סינתזה של חלבון המתהווה, מחלקות של glycoproteins ששינה עם קבוצה אזיד. סינתזה של חלבון המתהווה, L-Azidohomoalanine (L-AHA, חומצת אמינו אזיד-השתנה) יכול להיות סמויה משולבים לחלבונים, שאותרו על-ידי שימוש בשיטת47זיהוי חלבונים טמרה. על-ידי שימוש assay הזה hepatocytes העכבר הראשי, אנו מראים כי קצב סינתזת חלבון nascent בחוזקה קשורה בזמינות של ATP מ מיטוכונדריאלי AMPK ההפעלה (איור 1).
לסיכום, ניצול של העכבר הראשי hepatocytes חיוני כדי לחקור את חילוף החומרים חלבון ואנרגיה, לכימות סינתזה של חלבון nascent יקר, להשגת תובנות תפקיד פיזיולוגי המסלולים הרלוונטיים לפיתוח ו לרפא מחלות הקשורות hepatocyte.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>HEPES buffer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP310-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D16-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene glycol-bis(&#946;-aminoethyl ether)-tetraacetic acid</td>
			<td>AmericanBio</td>
			<td>AB00505-00025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS (10X) no calcium, magnesium, phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14185-052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride Dihydrate (CaCl2.2H2O)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C79-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Density gradient buffer</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0891-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium) low glucose, pyruvate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11885-084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30910.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS) (1X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>1897141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Williams medium E, no glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12551-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-alanyl-L-glutamine dipeptide supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type X</td>
			<td>Wako Pure Chemical Industries</td>
			<td>039-17864</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion pump</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>Masterflex L/S</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IV administration set</td>
			<td>EXELINT</td>
			<td>29081</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A water bath</td>
			<td>REVSCI</td>
			<td>RS-PB-200</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube heater</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Isotemp</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Decon Lab, Inc</td>
			<td>0-39613</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>PHOENIX</td>
			<td>10250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclaved Cotton Tips</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>23-400-124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm Petri Dish</td>
			<td>TPP</td>
			<td>93100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Connector (Male Luer Lock Ring)</td>
			<td>Cole-Parmer instrument</td>
			<td>EW-4551807</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24G catheters</td>
			<td>TERUMO</td>
			<td>Surflo 24Gx3/4&#39;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#956;m Filter (CELL STRAINERS)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10199-658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml conical-bottom centrifuge tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89039-666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml conical-bottom centrifuge tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89039-658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemoselective ligation reaction PROTEIN ANALYSIS DETECTION KIT, TAMRA ALKYNE</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C33370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AHA (L-azidohomoalanine)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (methionine free)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21013024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Cystine Dihydrochloride</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>C2526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laemmli sample buffer</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>161-0737</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>P9599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS solution (20%)</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>161-0418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCL (1M)</td>
			<td>American Bioanalytical</td>
			<td>AB14044-01000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatase Inhibitor Cocktail</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>P5726</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein concentration measuring Kit (Bovin Serum Albumin-BSA)</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>500-0207</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well tissue culture plate</td>
			<td>TPP</td>
			<td>92006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Heatblock</td>
			<td>VWR</td>
			<td>12621-092</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-Rotator</td>
			<td>Grant-bio</td>
			<td>PTR-60</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic Sonicator</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>GE130PB</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Heavy-Duty Vortex Mixer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97043-566</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A variable mode laser scanner</td>
			<td>GE Healthcare Life Science</td>
			<td>FLA 9500</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie-dye reagent</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>24594</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>CKX53</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Western Blotting apparatus</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1658004</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5424R</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated cell counter</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>TC20</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluorChem R system</td>
			<td>proteinsimple</td>
			<td>-</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-Ampka (T172) antibody</td>
			<td>Cell signaling</td>
			<td>2535</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Total-AMPK antibody</td>
			<td>Cell signaling</td>
			<td>5832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin antibody</td>
			<td>Cell signaling</td>
			<td>4929</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>beta actin antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-130656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine scissors and forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of primary mouse hepatocytes for nascent protein synthesis analysis by non-radioactive l-azidohomoalanine labeling method

Hepatocytes הם תאים parenchymal של הכבד וקיום מספר פונקציות מטבוליות, כולל סינתזה הפרשת חלבונים חיוניים עבור אנרגיה מערכתית הומאוסטזיס. ראשי hepatocytes בודד מהכבד מאתר מהווים כלי ביולוגי חשוב להבין את מאפייני תפקודית או שינויים המתרחשים בכבד. בזאת אנחנו מתארים שיטה הבידוד והתרבות של העכבר הראשי hepatocytes על-ידי ביצוע טכניקה זלוף collagenase שני שלבים ולדון שלהם ניצול של חוקר חלבונים. הכבד של העכבר למבוגרים ברצף perfused עם אתילן גליקול-bis tetraacetic חומצה (EGTA) ו- collagenase, ואחריו את ניתוקה של hepatocytes עם המאגר הדרגתיות צפיפות. אלה hepatocytes מבודד קיימא על תרבות צלחות, לשמור על הרוב המכריע של מאפייני hepatocytes מצויד. אלה hepatocytes יכול לשמש עבור הערכות של חלבון מטבוליזם כולל סינתזה של חלבון המתהווה עם ריאגנטים שאינו רדיואקטיבי. אנחנו מראים כי hepatocytes מבודד נשלטים בקלות, מהווים יציבות איכות ונפח גבוה יותר של סינתזת חלבונים קשורה לחילוף חומרים של אנרגיה על-ידי ניצול התגובה מצדו הכימותרפיה סלקטיבית עם חלבון Tetramethylrhodamine (טמרה) שיטת זיהוי וניתוחים המערבי סופג. לכן, בשיטה זו הוא יקר עבור חוקר סינתזה של חלבון nascent הכבד קשור אנרגיה הומאוסטזיס. להלן כללי התנהגות מתווה של חומרים ושיטות על בידודו של העכבר הראשי באיכות גבוהה hepatocytes וזיהוי של סינתזת חלבונים המתהווה.

העכבר הראשי hepatocytes בידוד תוצאות תשואה של 20 x 106 הכולל תאים/עכבר. בהיסטולוגיה, hepatocytes העיקרי בשידור חי ומצורפים להופיע מצולע או אופייני משושה במצב עם המתוארים בבירור גבולות עלי הלוואי קרומיים לאחר דגירה 24 שעות (איור 2).
?...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Primary Mouse Hepatocytes for Nascent Protein Synthesis Analysis by Non-radioactive L-azidohomoalanine Labeling Method at JoVE.com

Isolation of Primary Mouse Hepatocytes for Nascent Protein Synthesis Analysis by Non-radioactive L-azidohomoalanine Labeling Method

בידוד של העכבר הראשי Hepatocytes לניתוח סינתזת חלבון Nascent בשיטה תיוג L שאינו רדיואקטיבי-azidohomoalanine

כאן, אנו מציגים עבור בידודו של העכבר הראשי בריא ופונקציונליים hepatocytes פרוטוקול. הוראות לגילוי סינתזה של חלבון nascent הכבד על ידי המצע תיוג לא רדיואקטיבי נמסרו כדי לעזור להבין את המנגנונים שבבסיס סינתזת החלבון בהקשר של הומאוסטזיס אנרגיה-מטבוליזם בכבד.

Hepatocytes are parenchymal cells of the liver and engage multiple metabolic functions, including synthesis and secretion of proteins essential for ...

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחומים שונים של מחקר מחלות מטבוליות על שינויים מולקולריים של אנרגיה כבד וביוסינתזה של חלבון בהשמנת יתר, כבד שומני לא אלכוהולי וסוכרת מסוג 2. היתרונות העיקריים של טכניקה זו הם שהיא מקלה על הבידוד של hepatocytes עכבר ראשוני פונקציונלי וזיהוי חלבונים בהיפטי המתהווה באמצעות מצע תיוג לא רדיואקטיבי. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית כמו שלב חליטה קשה ללמוד בגלל כלי הדם עכבר קטן ודק.עבור זיוף בכבד, בזהירות להכניס קטטר מד 24 לתוך Vena Cava נחות או IVC רק על bifurcation עם וריד הכליה הנכון. הסר את מחט הקטטר שמירה על המיקום של הצינורית בתוך IVC ולחבר צינור 24 מד עם צינור זיוף באמצעות המחבר. התחל לתפארת הכבד עם HBSS חם מינוס בקצב זרימה קבוע ארבעה מיליליטר במהירות חיתוך וריד הטחול כדי לנקז את הדם הפנימי.לאחר 10 דקות, לבלבל את הכבד העכבר עם 35 מיליליטר של HBSS בתוספת עם קולגנס סוג X בקצב זרימה של ארבעה מיליליטר לדקה, הידוק וריד הטחול במשך כ 10 שניות כל כמה דקות כדי להקל על הפצה של perfusate ברחבי הכבד. כאשר כל הקולגנס כבר חדור, להעביר את הכבד על רקמת מעבדה לפני עצירת המשאבה, כדי למנוע זרימת דם בחזרה לתוך הכבד. השתמש מדפים כדי להסיר את כיס המרה בעדינות לנגב את הכבד עם רקמת מעבדה טרייה כדי להסיר כל דם.מניחים את הכבד בצלחת פטרי 100 מילימטר המכיל חמישה מיליליטר של HBSS חם טרי בתוספת קולגן ולהשתמש מטלטולים תועים כדי להסיר בעדינות את כמוסת הכבד. השתמש במלקחיים כדי לפזר בזהירות את הרקמה הפרנצ'ימלית ולהוסיף 15 מיליליטר DMEM קר לצלחת פטרי. לנער את הכבד הקרוע בעדינות כדי לשחרר את התאים parenchymal שיורית לתוך המדיום ולהוסיף עוד 15 מיליליטר של DMEM קר לצלחת לרכוש את שאר התאים.ואז לסנן את תרחיף הרקמה דרך מסננת תא 100 מיקרון לתוך צינור חרוט 50 מיליליטר על קרח. כדי לבודד את hepatocytes העכבר הראשי, לאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה ו resuspend גלולה ב 10 מיליליטר של DMEM טרי. בזהירות שכבת התאים מעל מאגר הדרגתי 40%density עבור הפרדת הדרגתי צפיפות, השלכת התאים מהשכבות העליונות והאמצעיות לאחר צנטריפוגה.תן מחדש את גלולת ההפטוציט הפרנצ'ימלית העיקרית עם שניים עד שלושה מיליליטר של ה-E הבינוני של וויליאם כדי להימנע מאיסוף תאים מתים מקיר הצינור ולהעביר את התאים לצינור חדש של 50 מיליליטר. מערבבים את התאים עם שבעה עד שמונה מיליליטר נוספים של מדיום E של ויליאם לפני צנטריפוגה מחדש את גלולה ב 10, 20, או 30 מיליליטר של טרי ויליאם בינוני E בהתאם לגודל של גלולה. לאחר הספירה, זרע שש פעמים 10 לתאים החמישיים לכל באר של צלחת שש באר עבור דגירה של שעתיים עד שלוש שעות ב 37 מעלות צלזיוס.בסוף הדגירה, החלף את המדיום ב- DMEM בתוספת 10% סרום בובין עוברי ואנטי אנטי כדי להסיר את התאים המתים והבלתי מחוברים ולהחזיר את התאים לאנקובטור בן לילה. לתיוג חלבונים המתהווה שעבר שינוי אזיד, הוסיפו 20 עד 40 מיקרוגרם של ליסנט תאים ל-50 מיקרוליטר של מאגר תגובה 2X. הביאו את הנפח ל-80 מיקרוליטר עם מים מזוקקים ומערבולת את תווי החלבון למשך חמש שניות.הוסף חמישה מיקרוליטרים של נחושת סולפט לתאים למערבולת נוספת של חמש שניות, ואחריו חמישה מיקרוליטרים של תוסף חיץ תגובה אחד עם חמש שניות של מערבולת. לאחר דגירה של שלוש דקות, הוסיפו 10 מיקרוליטרים של תוסף מאגר תגובה משוחזר שניים לתאים למערבולת נוספת של חמש שניות וסובבו את המדגם במשך 20 דקות בארבע מעלות צלזיוס במכונה מרובת מסובבים המוגנת מפני אור. בסוף הסיבוב, להוסיף 300 microliters של מתנול לליסט, ואחריו 75 microliters של כלורופורם, ו 200 microliters של מים מזוקקים כפולים.לאסוף את החלבון שכותרתו על ידי צנטריפוגה ולהוסיף 250 microliters של מתנול טרי גלולה. לאחר מערבולת, צנטריפוגה lysate שוב לכסות את גלולה חשופה עם רקמה ללא מוך במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. לניתוח PAGE, מנומשים את גלולה מיובשת ב 20 microliters של חיץ טעינה ללא בטא-mercaptoethanol ומערבולת גלולה במשך 10 דקות.לאחר מכן, מחממים את החלבון בבלוק חום של 70 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות ומטענים את הדגימה על ג'ל דודסיל סולפט 10% לגילוי טתרמתיל-רודאמין. לאחר מכן השתמשו בסורק לייזר במצב משתנה לכמות המדויק של החלבונים המתהווים המסווים ב-AHA. מבחינה היסטולוגית, hepatocytes ראשי חי ומצורף מופיעים בדרך כלל מצולע או משושה בצורת עם גבול קרום קווי המתאר בבירור לאחר 24 שעות של תרבות.כדי לאשר אם התאים המבודדים הם hepatocytes העיקרי, בניסוי זה, רמות ביטוי חלבון אלבומין הושוו פיברובלסטים עוברי עכבר, קו תא hepatoma העכבר, hepatocytes העכבר הראשי מבודד, וכבדי עכבר. ביטוי חלבון אלבומין זוהה hepatocytes העכבר הראשי וכבדי עכבר, אבל לא היה ניתן לזהות לא פיברובלסטים עובריים עכבר או תאי קו התא hepatoma. טיפול hepatocyte העיקרי עם 10 micromolar רוטנונה במשך ארבע עד שש שעות חשף אינדוקציה חזקה של קינאז חלבון המופעל על ידי AMP בהיפוכיה כפי שזוהה על ידי רמות זרחון מוגברות על חלבון מופעל על ידי AMP בהיפוכיה T172 דומה לאלה שנצפו vivo.ואכן, חמש שעות של טיפול רוטנונה micromolar 10 היו השפעות מעכבות עמוקות על סינתזת החלבון המתהווה ב hepatocytes העיקרי מטופלים לעומת תאי בקרה מטופלים כפי שהוכח על ידי מוצג תגובת קשירה כימוסאלקטיבית. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור להכין מראש את כל הריג'ים והממדיום הנדרשים. טכניקה זו סללה את הדרך עבור החוקר בתחום הפתופיזיולוגיה המטבולית בהפטית לחקור את המנגנון המולקולרי של ויסות חלבון אנרגיה בהשמנת יתר וסוכרת מסוג 2 בהפטוציטים עכבר ראשוני מבודד.

Research

JoVE Journal

Medicine

A Model of Disturbed Flow-Induced Atherosclerosis in Mouse Carotid Artery by Partial Ligation and a Simple Method of RNA Isolation from Carotid Endothelium

המודל של טרשת עורקים Flow-induced מופרע על העורק הראשי עכבר ידי קשירת חלקי שיטה פשוטה של ​​בידוד RNA מן התרדמה האנדותל

Despite the well-known close association, direct evidence linking disturbed flow to atherogenesis has been lacking. We have recently used a modified ...

In vitro Organoid Culture of Primary Mouse Colon Tumors

In vitro Organoid Culture of Primary Mouse Colon Tumors

בתרבות Organoid מבחנה של גידולים במעי גס עכבר העיקרי

Several  human and murine colon cancer cell lines have been established, physiologic  integrity of colon tumors such as multiple cell layers, basal-apical ...

Coculture Analysis of Extracellular Protein Interactions Affecting Insulin Secretion by Pancreatic Beta Cells

ניתוח Coculture של אינטראקציות חלבון תאיות המשפיעות על הפרשת אינסולין על ידי תאים בטא בלבלב

Interactions between cell-surface proteins help coordinate the function of neighboring cells. Pancreatic beta cells are clustered together within ...

A Modified Method for Heterotopic Mouse Heart Transplantion

שיטה שונה לHeterotopic מאוס לב Transplantion

Mice are often used as heart transplant donors and recipients in studies of transplant immunology due to the wide range of transgenic mice and reagents ...

Method for Obtaining Primary Ovarian Cancer Cells From Solid Specimens

שיטה לקבלת תאי סרטן השחלות ראשיים מתוך דגימות מוצקים

Reliable tools for investigating ovarian cancer initiation and progression are urgently needed. While the use of ovarian cancer cell lines remains a ...

Isolation and Culture of Primary Endothelial Cells from Canine Arteries and Veins

בידוד והתרבות של תאי האנדותל ראשיים מן העורקים וורידים לכלבים

Cardiovascular disease is studied in both human and veterinary medicine. Endothelial cells have been used extensively as an in vitro model to study ...

Fluorescent Dye Labeling of Erythrocytes and Leukocytes for Studying the Flow Dynamics in Mouse Retinal Circulation

פלואורסצנטי Dye תיוג של Erythrocytes ו leukocytes ללימוד דינמיקה זרימה של זרימת עכבר הרשתית

The retinal and choroidal blood flow dynamics may provide insight into the pathophysiology and sequelae of various ocular diseases, such as glaucoma, ...

Lentiviral Vector-mediated Gene Therapy of Hepatocytes Ex Vivo for Autologous Transplantation in Swine

Lentiviral Vector-mediated Gene Therapy of Hepatocytes Ex Vivo for Autologous Transplantation in Swine

Lentiviral בתיווך וקטור ריפוי גנטי של Hepatocytes לשעבר Vivo עבור השתלת עצמיים של החזירים

Gene therapy is an ideal choice to cure many inborn errors of metabolism of the liver. Ex-vivo, lentiviral vectors have been used successfully in the ...

Ultrasonic-augmented Primary Adult Fibroblast Isolation

אולטרה סאונד-מוגבר למבוגרים בידוד פיברוהפיצוץ

Primary adult fibroblasts have become an important tool to study fibrosis, fibroblast interactions and inflammation in all body tissues. Since primary ...

A Non-Invasive Method for Generating the Cyclic Loading-Induced Intra-Articular Cartilage Lesion Model of the Rat Knee

שיטה לא פולשנית ליצירת מודל סחוס תוך מפרקי הנגרם על ידי העמסה מחזורית של ברך החולדה

The pathophysiology of primary osteoarthritis (OA) remains unclear. However, a specific subclassification of OA in relatively younger age groups is likely ...