Name: isolation of primary mouse hepatocytes for nascent protein synthesis analysis by non-radioactive l-azidohomoalanine labeling method
Uploaded: 2018-10-23T13:30:00
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हम डीआरएस को धंयवाद । Joonbae एसईओ और विवियन Hwa उनके वैज्ञानिक इनपुट और चर्चा के लिए । इस काम को नेशनल इंस्टिट्यूट ऑफ हेल्थ (NIH) (R01DK107530) ने सपोर्ट किया था । T.N. को जापान की साइंस एंड टेक्नोलॉजी एजेंसी से सफ़ाई ने सपोर्ट किया था । इस अध्ययन का एक हिस्सा NIH (P30DK078392) से सिनसिनाटी में पाचन रोग अनुसंधान कोर सेंटर के लिए एक अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था ।

इस प्रोटोकॉल प्रयोगशाला चूहों का उपयोग होता है । पशु देखभाल और प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं सिनसिनाटी बच्चों अस्पताल चिकित्सा केंद्र की पशु देखभाल समितियों द्वारा अनुमोदित प्रक्रियाओं के अनुसार प्रदर...

हालांकि कई अमर यकृत कोशिका लाइनों का प्रस्ताव किया गया है और जिगर कार्यों की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया४९,५०,५१,५२, इन कोशिकाओं को आम तौर पर महत्वपूर...

प्रोटीन एक महत्वपूर्ण पोषण तत्व है और एक मानव शरीर के शुष्क वजन के लगभग ५०% प्रोटीन है जो कई जैविक लक्षण और1कार्य किया है से बना है । नतीजतन, प्रोटीन संश्लेषण सबसे अधिक ऊर्जा लेने वाली घटनाओं में से एक है और प्रोटीन चयापचय में परिवर्तन अत्यधिक चयापचय रोगों2,3,4सहित रोगों के विकास के साथ जुड़ा हुआ है । जिगर में, लगभग 20 के लिए प्रोटीन संश्लेषण खातों-कुल ऊर्जा की खपत का 30%5,6. इसके अलावा, प्रोटीन न केवल निष्क्रिय या इमारत जिगर के ब्लॉकों के रूप में कार्य करते हैं, लेकिन यह भी सक्रिय संकेत मध्यस्थता कारकों intracellularly या extracellularly प्रणालीगत चयापचय को विनियमित करने के लिए7. उदाहरण के लिए, सीरम एल्ब्युमिन के कम स्तर, जो संश्लेषित और जिगर द्वारा स्रावित और8प्लाज्मा में सबसे प्रचुर मात्रा में प्रोटीन है, प्रकार का खतरा बढ़ जाता है 2 मधुमेह विकास9,10, 11, जबकि सीरम एल्ब्युमिन की एक उच्च एकाग्रता चयापचय सिंड्रोम12के विकास के खिलाफ सुरक्षात्मक है । इसके अलावा, परेशान या स्रावी या झिल्ली के विघटन-बाध्य यकृत प्रोटीन, जो लिपो, LDLR, और LRP1 सहित कोलेस्ट्रॉल homeostasis, मॉडुलन इंसुलिन प्रतिरोध, hyperlipidemia, या atherosclerosis के विकास के लिए नेतृत्व कर सकते हैं 13. इसलिए, आणविक pathophysiological तंत्र की पहचान है कि जिगर में प्रोटीन चयापचय अशांति में शामिल है और इसके संबद्ध चयापचय जटिलताओं उपंयास औषधीय खोज के लिए उपयोगी हो सकता है मंदबुद्धि शुरू करने के लिए दृष्टिकोण या ऐसे इंसुलिन प्रतिरोध, मधुमेह, और गैर शराबी फैटी लीवर के रूप में चयापचय रोगों का इलाज ।
प्रोटीन संश्लेषण कसकर सेलुलर ऊर्जा की स्थिति से जुड़ा हुआ है (जैसे, प्रोटीन संश्लेषण के बढ़ाव कदम के दौरान एक पेप्टाइड बॉण्ड के गठन की आवश्यकता है 4 phosphodiester बांड14) और आणविक रास्ते द्वारा विनियमित है कि भावना अंतर और इंट्रा सेलुलर पोषक तत्वों की उपलब्धता15,16. AMP-सक्रिय प्रोटीन कळेनासे (AMPK) intracellular ऊर्जा सेंसरों कि ऊर्जा homeostasis17बनाए रखने में से एक है । एक बार AMPK सक्रिय है जब सेलुलर ऊर्जा का स्तर कम हो जाते हैं, AMPK और इसके लक्षित सब्सट्रेट समारोह catabolic रास्ते को उत्तेजित करने के लिए और रोकना प्रोटीन संश्लेषण18,19सहित anabolic प्रक्रियाओं । प्रोटीन संश्लेषण के विनियमन के कई अनुवाद कारकों और राइबोसोमल प्रोटीन20के फास्फारिलीकरण द्वारा मध्यस्थता है. नोट, rapamycin परिसर 1 (mTORC1), प्रोटीन संश्लेषण का एक प्रमुख चालक के स्तनधारी लक्ष्य,21AMPK के मुख्य लक्ष्य में से एक है । mTORC1 मार्ग के सक्रियकरण प्रोटीन अनुवाद और autophagy20,21उत्तेजक द्वारा सेल विकास और प्रसार को बढ़ाता है । इसलिए, यह तार्किक है कि AMPK के सक्रियकरण mTORC1-मध्यस्थता प्रोटीन संश्लेषण22को बाधित कर सकते हैं । दरअसल, AMPK प्रतिक्रिया के सक्रियकरण और सीधे threonine अवशेषों पर phosphorylates mTORC1 २४४६ (२४४६) अपनी निष्क्रियता23 और प्रोटीन के दमन के लिए अग्रणी24। इसके अलावा, AMPK परोक्ष रूप से फास्फारिलीकरण और कंद स्केलेरोसिस परिसर 2 (TSC2)25 जो mTORC1 संकेतन झरना के ऊपर नियामक है के सक्रियकरण द्वारा mTORC1 समारोह को बाधित कर सकते हैं । संक्षेप में, जिगर में इन रास्ते के dysregulation अक्सर चयापचय रोगों के विकास के लिए जुड़ा हुआ है और इसलिए ऊर्जा के विनियमन में इन रास्ते की भूमिका की जांच करने के लिए प्रभावी प्रयोगात्मक उपकरण स्थापित करने के लिए एक महत्वपूर्ण जरूरत है और हेपैटोसाइट्स में प्रोटीन चयापचय ।
अलग प्राथमिक हेपैटोसाइट्स के कार्यात्मक गुणों के बीच एक मजबूत समानता है और vivo हेपैटोसाइट्स में साथ इन विट्रो जिगर से व्युत्पंन सेल लाइनों26,27,28। यह दिखाया गया है कि प्राथमिक मानव हेपैटोसाइट्स हिस्सा ७७ जिगर बायोप्सी के साथ% समानता, जबकि HepG2 कोशिकाओं है, जो अच्छी तरह से विभेदित यकृत कैंसर कोशिकाओं और व्यापक रूप से यकृत कार्यों की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया, के संदर्भ में कम से ४८% प्रदर्शन जीन एक्सप्रेशन प्रोफाइल29. इसलिए, प्राथमिक हेपैटोसाइट्स के उपयोग के बजाय अमरता संस्कृति कोशिकाओं, यकृत समारोह और शरीर विज्ञान की जांच में महत्वपूर्ण महत्व का है, और कई प्रोटोकॉल अलगाव और प्राथमिक हेपैटोसाइट्स की संस्कृति के लिए उपलब्ध हैं विशेष रूप से चूहों30,31से । जबकि चूहे हेपैटोसाइट्स कोशिकाओं की एक अपेक्षाकृत अधिक उपज के साथ उपयोगी होते हैं, माउस हेपैटोसाइट्स आनुवंशिक रूप से संग्राहक चूहों की व्यापक उपलब्धता की वजह से कई वैज्ञानिक पहलुओं में एक बड़ी क्षमता है । हालांकि, सेलुलर और आणविक आधारित आकलन के लिए चूहों से स्वस्थ और प्रचुर मात्रा में प्राथमिक हेपैटोसाइट्स को अलग करने में कई तकनीकी चुनौतियों का सामना कर रहे हैं: पहला, प्रवेशनी सम्मिलन perfuse करने के लिए बफर रिएजेंट के साथ जिगर को संभालना बहुत मुश्किल है छोटे और पतले माउस पोर्टल नस या अवर वेना कावा के कारण; दूसरा, अलगाव के दौरान कोशिकाओं की एक लंबी हेरफेर समय कोशिका मात्रा और गुणवत्ता में कमी पैदा कर सकता है; तीसरा, गैर एंजाइमी यांत्रिक जुदाई तरीकों गंभीर नुकसान में परिणाम और व्यवहार्य पृथक प्राथमिक हेपैटोसाइट्स३२,३३की एक कम उपज का उत्पादन कर सकते हैं । 1980 के दशक में, collagenase छिड़काव तकनीक३४पशुओं के जिगर से अलग हेपैटोसाइट्स के लिए शुरू की गई थी । इस विधि जिगर३५,३६,३७, कैल्शियम chelator समाधान३८,३९, एंजाइमी पाचन के साथ जिगर की अर्क के collagenase छिड़काव पर आधारित है और यकृत पैरेन्काइमा३५के यांत्रिक पृथक्करण । पहले चरण में, एक माउस जिगर एक कैल्शियम के साथ perfused है [ca2 +] एक युक्त मुक्त बफर [ca2 +] chelator (ethylenediamine tetraacetic एसिड, EDTA) । दूसरे चरण में, माउस जिगर सेलुलर-extracellular मैट्रिक्स बातचीत hydrolyze करने के लिए एक collagenase-युक्त बफर के साथ perfused है. चरण एक में प्रयोग किया जाता बफर के विपरीत, दूसरे चरण के बफर में [Ca2 +] आयनों की उपस्थिति प्रभावी collagenase गतिविधि के लिए आवश्यक है, जिसके बाद पचा जिगर को आगे धीरे और यांत्रिक रूप से संदंश के बीच का उपयोग कर अलग हो गया है यकृत कैप्सूल और parenchymatous ऊतक । अंत में, संयोजी ऊतक फ़िल्टरिंग द्वारा निकाल दिया जाता है, और बाद के केंद्रापसारक दोनों गैर parenchymal कोशिकाओं और गैर-घनत्व ढाल बफर४०,४१ के उपयोग के साथ hepatocyte रहने से व्यवहार्य हेपैटोसाइट्स अलग ,४२. वर्तमान अध्ययन में, हम प्रोटीन संश्लेषण के विश्लेषण के लिए एक माउस जिगर से प्राथमिक हेपैटोसाइट्स को अलग करने के लिए एक संशोधित दो कदम collagenase छिड़काव तकनीक दिखाते हैं ।
प्रोटीन की radiolabeling व्यापक रूप से अभिव्यक्ति के स्तर, कारोबार की दर को बढ़ाता है, और प्रोटीन के जैविक वितरण४३ ४४रेडियोधर्मिता का पता लगाने की उच्च संवेदनशीलता के कारण निर्धारित करने के लिए प्रयोग किया जाता है । हालांकि, रेडियोधर्मी आइसोटोप का उपयोग अत्यधिक नियंत्रित अनुसंधान परिस्थितियों और प्रक्रियाओं४५की आवश्यकता है. वैकल्पिक गैर रेडियोधर्मी तरीके विकसित किया गया है और तेजी से लोकप्रियता में प्राप्त की है । एक Tetramethylrhodamine के साथ chemo-चयनात्मक बंधाव प्रतिक्रिया (तमृ) प्रोटीन का पता लगाने विधि उनमें से एक है और एक chemo और azide समूहों४६, जो इस तरह के रूप में सेलुलर घटनाओं का विश्लेषण करने के लिए उपयोग किया जा सकता है के बीच alkyne चयनात्मक प्रतिक्रिया पर आधारित है एक azide समूह के साथ संशोधित नच के नवजात प्रोटीन संश्लेषण और उपवर्गों का पता लगाने. नवजात प्रोटीन संश्लेषण के लिए, एल Azidohomoalanine (एल-अहा, एक azide-संशोधित एमिनो एसिड) चयापचय प्रोटीन में शामिल किया जा सकता है और तमृ प्रोटीन का पता लगाने विधि४७का उपयोग करके पता चला । प्राथमिक माउस हेपैटोसाइट्स में इस परख का उपयोग करके, हम बताते है कि नवजात प्रोटीन संश्लेषण दर कसकर mitochondrial और AMPK सक्रियण (चित्रा 1) से एटीपी की उपलब्धता से जुड़ा हुआ है ।
सारांश में, प्राथमिक माउस हेपैटोसाइट्स के उपयोग प्रोटीन और ऊर्जा चयापचय और बढ़ाता नवजात प्रोटीन संश्लेषण की जांच के लिए महत्वपूर्ण रास्ते के विकास के लिए प्रासंगिक की शारीरिक भूमिका में अंतर्दृष्टि पाने के लिए मूल्यवान है और hepatocyte से संबंधित रोगों का ईलाज ।

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>HEPES buffer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP310-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D16-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene glycol-bis(&#946;-aminoethyl ether)-tetraacetic acid</td>
			<td>AmericanBio</td>
			<td>AB00505-00025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS (10X) no calcium, magnesium, phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14185-052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride Dihydrate (CaCl2.2H2O)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C79-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Density gradient buffer</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0891-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium) low glucose, pyruvate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11885-084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30910.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS) (1X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>1897141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Williams medium E, no glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12551-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-alanyl-L-glutamine dipeptide supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type X</td>
			<td>Wako Pure Chemical Industries</td>
			<td>039-17864</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion pump</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>Masterflex L/S</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IV administration set</td>
			<td>EXELINT</td>
			<td>29081</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A water bath</td>
			<td>REVSCI</td>
			<td>RS-PB-200</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube heater</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Isotemp</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Decon Lab, Inc</td>
			<td>0-39613</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>PHOENIX</td>
			<td>10250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclaved Cotton Tips</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>23-400-124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm Petri Dish</td>
			<td>TPP</td>
			<td>93100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Connector (Male Luer Lock Ring)</td>
			<td>Cole-Parmer instrument</td>
			<td>EW-4551807</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24G catheters</td>
			<td>TERUMO</td>
			<td>Surflo 24Gx3/4&#39;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#956;m Filter (CELL STRAINERS)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10199-658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml conical-bottom centrifuge tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89039-666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml conical-bottom centrifuge tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89039-658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemoselective ligation reaction PROTEIN ANALYSIS DETECTION KIT, TAMRA ALKYNE</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C33370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AHA (L-azidohomoalanine)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (methionine free)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21013024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Cystine Dihydrochloride</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>C2526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laemmli sample buffer</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>161-0737</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>P9599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS solution (20%)</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>161-0418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCL (1M)</td>
			<td>American Bioanalytical</td>
			<td>AB14044-01000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatase Inhibitor Cocktail</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>P5726</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein concentration measuring Kit (Bovin Serum Albumin-BSA)</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>500-0207</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well tissue culture plate</td>
			<td>TPP</td>
			<td>92006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Heatblock</td>
			<td>VWR</td>
			<td>12621-092</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-Rotator</td>
			<td>Grant-bio</td>
			<td>PTR-60</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic Sonicator</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>GE130PB</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Heavy-Duty Vortex Mixer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97043-566</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A variable mode laser scanner</td>
			<td>GE Healthcare Life Science</td>
			<td>FLA 9500</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie-dye reagent</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>24594</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>CKX53</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Western Blotting apparatus</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1658004</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5424R</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated cell counter</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>TC20</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluorChem R system</td>
			<td>proteinsimple</td>
			<td>-</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-Ampka (T172) antibody</td>
			<td>Cell signaling</td>
			<td>2535</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Total-AMPK antibody</td>
			<td>Cell signaling</td>
			<td>5832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin antibody</td>
			<td>Cell signaling</td>
			<td>4929</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>beta actin antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-130656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine scissors and forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of primary mouse hepatocytes for nascent protein synthesis analysis by non-radioactive l-azidohomoalanine labeling method

हेपैटोसाइट्स जिगर की कोशिकाओं को parenchymal है और संश्लेषण और प्रणालीगत ऊर्जा homeostasis के लिए आवश्यक प्रोटीन के स्राव सहित कई चयापचय कार्यों, संलग्न हैं । प्राथमिक हेपैटोसाइट्स murine जिगर से अलग कार्यात्मक गुण या जिगर में होने वाले परिवर्तन को समझने के लिए एक मूल्यवान जैविक उपकरण का गठन । साथ ही हम एक दो कदम collagenase छिड़काव तकनीक प्रदर्शन और प्रोटीन चयापचय की जांच के लिए उनके उपयोग पर चर्चा के द्वारा प्राथमिक माउस हेपैटोसाइट्स के अलगाव और संस्कृति के लिए एक विधि का वर्णन । एक वयस्क माउस के जिगर क्रमिक रूप से ईथीलीन ग्लाइकोल-बीआईएस tetraacetic एसिड (EGTA) और collagenase, घनत्व ढाल बफर के साथ हेपैटोसाइट्स के अलगाव के बाद के साथ perfused है । इन पृथक हेपैटोसाइट्स संस्कृति प्लेटों पर व्यवहार्य है और हेपैटोसाइट्स की संपंन विशेषताओं के बहुमत बनाए रखने । इन हेपैटोसाइट्स गैर रेडियोधर्मी रिएजेंट के साथ नवजात प्रोटीन संश्लेषण सहित प्रोटीन चयापचय के आकलन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । हम बताते है कि अलग हेपैटोसाइट्स आसानी से नियंत्रित कर रहे है और एक उच्च गुणवत्ता और प्रोटीन संश्लेषण ऊर्जा चयापचय से जुड़े एक Tetramethylrhodamine (तमृ) प्रोटीन के साथ chemo चयनात्मक बंधाव प्रतिक्रिया का उपयोग करके की मात्रा स्थिरता शामिल डिटेक्शन मेथड और वेस्टर्न सोख्ता िरा । इसलिए, इस विधि यकृत नवजात प्रोटीन संश्लेषण ऊर्जा homeostasis से जुड़े की जांच के लिए मूल्यवान है । निंनलिखित प्रोटोकॉल सामग्री और उच्च गुणवत्ता वाले प्राथमिक माउस हेपैटोसाइट्स और नवजात प्रोटीन संश्लेषण का पता लगाने के अलगाव के लिए तरीकों की रूपरेखा ।

प्राथमिक माउस हेपैटोसाइट्स आइसोलेशन परिणाम लगभग 20 x 106 कुल कोशिकाओं की एक उपज में माउस/ Histologically, लाइव और संलग्न प्राथमिक हेपैटोसाइट्स 24 एच मशीन (चित्रा 2) के बाद स्पष्ट रूप से उल्ल...

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Isolation of Primary Mouse Hepatocytes for Nascent Protein Synthesis Analysis by Non-radioactive L-azidohomoalanine Labeling Method

गैर रेडियोधर्मी एल azidohomoalanine लेबलिंग विधि द्वारा नवजात प्रोटीन संश्लेषण विश्लेषण के लिए प्राथमिक माउस हेपैटोसाइट्स का अलगाव

यहां, हम स्वस्थ और कार्यात्मक प्राथमिक माउस हेपैटोसाइट्स के अलगाव के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं । गैर रेडियोधर्मी लेबलिंग सब्सट्रेट द्वारा यकृत नवजात प्रोटीन संश्लेषण का पता लगाने के लिए निर्देश जिगर में ऊर्जा चयापचय homeostasis के संदर्भ में अंतर्निहित प्रोटीन संश्लेषण तंत्र को समझने में मदद प्रदान की गई.

Hepatocytes are parenchymal cells of the liver and engage multiple metabolic functions, including synthesis and secretion of proteins essential for ...

इस विधि से मोटापे, गैर-मादक फैटी लिवर और टाइप टू डायबिटीज में हेपेटिक ऊर्जा और प्रोटीन बायोसिंथेसिस के आणविक परिवर्तन के बारे में विभिन्न मेटाबोलिक रोग अनुसंधान क्षेत्रों में महत्वपूर्ण सवालों के जवाब देने में मदद मिल सकती है। इस तकनीक के मुख्य फायदे यह हैं कि यह एक गैर-रेड्रियक लेबलिंग सब्सट्रेट के माध्यम से कार्यात्मक प्राथमिक माउस हेपेटोसाइट्स और हेजेटिक नवजात प्रोटीन के अलगाव की सुविधा प्रदान करता है। इस विधि का दृश्य प्रदर्शन महत्वपूर्ण है क्योंकि छोटे और पतले माउस रक्त वाहिकाओं के कारण पर्फ्यूजन कदम सीखना मुश्किल है।जिगर परफ्यूजन के लिए, ध्यान से सही गुर्दे की नस के साथ विभाजन पर अवर वेना कावा या आईवीसी में एक 24 गेज कैथेटर डालें। चतुर्थक के भीतर कैनुला की स्थिति को बनाए रखने कैथेटर सुई को हटा दें और कनेक्टर का उपयोग करके परफ्यूजन ट्यूब के साथ एक 24 गेज कैनुला कनेक्ट करें। एक चार मिलीलीटर स्थायी प्रवाह दर पर गर्म एचबीबीएस माइनस के साथ जिगर को जल्दी से आंतरिक रक्त को निकालने के लिए प्लीहा नस काटने शुरू करें।10 मिनट के बाद, एचबीएसएस के 35 मिलीलीटर के साथ माउस लिवर को भरना प्लस कोलेजनस टाइप एक्स के साथ चार मिलीलीटर प्रति मिनट की प्रवाह दर पर पूरक किया जाता है, पूरे जिगर में परफ्यूसेट के वितरण की सुविधा के लिए हर कुछ मिनटों में लगभग 10 सेकंड तक प्लीहा नस को क्लैंप करता है। जब कोलेजन के सभी perfused किया गया है, जिगर में रक्त बैकफ्लो से बचने के लिए पंप को रोकने से पहले एक प्रयोगशाला ऊतक पर जिगर हस्तांतरण । पित्ताशय की थैली को हटाने के लिए संदंश का प्रयोग करें और किसी भी रक्त को हटाने के लिए एक ताजा प्रयोगशाला ऊतक के साथ जिगर को धीरे से पोंछें।लिवर को 100 मिलीमीटर पेट्री डिश में रखें जिसमें पांच मिलीलीटर ताजा गर्म एचबीएसएस प्लस कोलेजनेस के साथ पूरक होता है और लिवर कैप्सूल को धीरे से हटाने के लिए आवारा-इत्तला वाले संदंश का उपयोग करें। पर्चेन्चिमल ऊतक को सावधानीपूर्वक फैलाने के लिए संदंश का उपयोग करें और पेट्री डिश में 15 मिलीलीटर ठंडे डीएमईएम जोड़ें। मध्यम में अवशिष्ट पैरान्चिमल कोशिकाओं को छोड़ने के लिए फटे जिगर को धीरे से हिलाएं और बाकी कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए पकवान में ठंडे डीएमईएम के एक और 15 मिलीलीटर जोड़ें।फिर बर्फ पर 50 मिलीलीटर शंकु नली में 100 माइक्रोन सेल छलनी के माध्यम से ऊतक घोल को फ़िल्टर करें। प्राथमिक माउस हेपेटोसाइट्स को अलग करने के लिए, कोशिकाओं को अपकेंद्रित्र द्वारा एकत्र करें और ताजा डीएमईएम के 10 मिलीलीटर में गोली को फिर से खर्च करें। सावधानी से घनत्व ढाल जुदाई के लिए एक 40% घनत्व ढाल बफर पर कोशिकाओं परत, अपकेंद्रित्र के बाद ऊपरी और मध्य परतों से कोशिकाओं को त्यागने।ट्यूब की दीवार से मृत कोशिकाओं को इकट्ठा करने से बचने और कोशिकाओं को एक नए 50 मिलीलीटर ट्यूब में स्थानांतरित करने के लिए विलियम के मध्यम ई के दो से तीन मिलीलीटर के साथ प्राथमिक पैरान्चिमल हेपेटोसाइट पेलेट को फिर से खर्च करें। सेंटीफ्यूगेशन से पहले विलियम के ई मीडियम के अतिरिक्त सात से आठ मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं को मिलाएं और गोली के आकार के आधार पर 10, 20, या ताजा विलियम के मध्यम ई के 30 मिलीलीटर में गोली को फिर से खर्च करें । गिनती के बाद, बीज छह बार 10 पांचवीं कोशिकाओं के लिए एक छह अच्छी तरह से एक छह अच्छी तरह से थाली के लिए एक दो से तीन घंटे के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेशन ।इनक्यूबेशन के अंत में, मृत और असंबद्ध कोशिकाओं को हटाने और रातोंरात इनक्यूबेटर में कोशिकाओं को वापस करने के लिए 10% भ्रूण गोजातीय सीरम और एंटी-एंटी के साथ पूरक डीएमईएम के साथ माध्यम को प्रतिस्थापित करें। Azide-संशोधित नवजात प्रोटीन लेबलिंग के लिए, 2X रिएक्शन बफर के 50 माइक्रोलीटर में 20 से 40 माइक्रोग्राम सेल lysate जोड़ें। डिस्टिल्ड डिओनाइज्ड वॉटर के साथ वॉल्यूम को 80 माइक्रोलीटर तक लाएं और पांच सेकंड के लिए प्रोटीन सॉल्यूशन भंवर करें।एक और पांच सेकंड भंवर के लिए कोशिकाओं के लिए तांबे सल्फेट के पांच माइक्रोलीटर जोड़ें, इसके बाद प्रतिक्रिया बफर योजक एक के पांच माइक्रोलीटर भंवर के पांच सेकंड के साथ । तीन मिनट की इनक्यूबेशन के बाद, पुनर्गठित प्रतिक्रिया बफर योजक दो के 10 माइक्रोलीटर को एक और पांच सेकंड के भंवर के लिए कोशिकाओं में जोड़ें और प्रकाश से संरक्षित एक बहु-रोटेटर मशीन पर चार डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए नमूना घुमाएं । रोटेशन के अंत में, lysate में मेथनॉल के 300 माइक्रोलीटर जोड़ें, इसके बाद क्लोरोफॉर्म के 75 माइक्रोलीटर, और डबल आसुत पानी के 200 माइक्रोलीटर जोड़ें।अपकेंद्रित्र द्वारा लेबल प्रोटीन ले लीजिए और गोली में ताजा मेथनॉल के 250 माइक्रोलीटर जोड़ें। भंवर के बाद, लिस् ट को फिर से अपक्त करें और नंगे गोली को कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए लिंट-फ्री ऊतक के साथ कवर करें। पेज विश्लेषण के लिए, सूखे गोली को बीटा-मर्केप्टोथेनॉल के बिना बफर लोड करने के 20 माइक्रोलीटर में घुलनशील करें और 10 मिनट के लिए गोली को भंवर दें।इसके बाद, प्रोटीन को 10 मिनट के लिए 70 डिग्री सेल्सियस हीट ब्लॉक में गर्म करें और नमूना को टेट्रामेथाइलरोडमाइन डिटेक्शन के लिए 10% सोडियम डोडेसिल सल्फेट जेल पर लोड करें। फिर अहा लेबल नवजात प्रोटीन के सटीक मात्रा के लिए एक चर मोड लेजर स्कैनर का उपयोग करें। हिस्टोलॉजिकल रूप से, लाइव और संलग्न प्राथमिक हेपेटोसाइट्स संस्कृति के 24 घंटे के बाद स्पष्ट रूप से उल्लिखित झिल्लीदार सीमा के साथ आकार में बहुभुज या षट्कोणीय दिखाई देते हैं।इस बात की पुष्टि करने के लिए कि क्या अलग कोशिकाएं प्राथमिक हेपेटोसाइट्स हैं, इस प्रयोग में, एल्बुमिन प्रोटीन अभिव्यक्ति के स्तर की तुलना माउस भ्रूणीय फाइब्रोब्लास्ट, माउस हेपेटोमा सेल लाइन, अलग प्राथमिक माउस हेपेटोसाइट्स और माउस यकृत में की गई थी। प्राथमिक माउस हेपेटोसाइट्स और माउस यकृत में एल्बुमिन प्रोटीन अभिव्यक्ति का पता लगाया गया था, लेकिन माउस भ्रूणीय फाइब्रोब्लास्ट या हेपेटोमा सेल लाइन कोशिकाओं में पता लगाने योग्य नहीं था। चार से छह घंटे के लिए 10 माइक्रोमोलर रोटेनोन के साथ प्राथमिक हेपेटोसाइट उपचार से पता चला कि हेपेटिक एएमपी-सक्रिय प्रोटीन किनेज़ के एक मजबूत प्रेरण के रूप में हेपेटिक एएमपी-सक्रिय प्रोटीन kinase T172 पर वृद्धि हुई फॉस्फोरिलेशन के स्तर से पता चला है जो वीवो में मनाया उन लोगों के समान है ।दरअसल, 10 माइक्रोमोलर रोटेनोन उपचार के पांच घंटे के इलाज प्राथमिक हेपेटोसाइट्स में नवजात प्रोटीन संश्लेषण पर गहरा निरोधात्मक प्रभाव पड़ा, जैसा कि एक रसायनइलेक्टिव लिगाशन प्रतिक्रिया परख द्वारा प्रदर्शित अनुपचारित नियंत्रण कोशिकाओं की तुलना में होता है। इस प्रक्रिया का प्रयास करते समय, सभी आवश्यक अभिकर्दकों और माध्यमों को पहले से तैयार करना याद रखना महत्वपूर्ण है। इस तकनीक ने हेपेटिक मेटाबोलिक रोगविज्ञान के क्षेत्र में शोधकर्ता के लिए मोटापे में ऊर्जा प्रोटीन विनियमन के आणविक तंत्र का पता लगाने और अलग प्राथमिक माउस हेपेटोसिटे में टाइप टू डायबिटीज का मार्ग प्रशस्त किया।

Research

JoVE Journal

Medicine

A Model of Disturbed Flow-Induced Atherosclerosis in Mouse Carotid Artery by Partial Ligation and a Simple Method of RNA Isolation from Carotid Endothelium

आंशिक Ligation द्वारा अशांत प्रवाह प्रेरित माउस मन्या धमनी में Atherosclerosis और मन्या endothelium से एक शाही सेना के अलगाव की सरल विधि का एक माडल

Despite the well-known close association, direct evidence linking disturbed flow to atherogenesis has been lacking. We have recently used a modified ...

In vitro Organoid Culture of Primary Mouse Colon Tumors

In vitro Organoid Culture of Primary Mouse Colon Tumors

प्राथमिक माउस पेट के ट्यूमर की इन विट्रो Organoid संस्कृति में

Several  human and murine colon cancer cell lines have been established, physiologic  integrity of colon tumors such as multiple cell layers, basal-apical ...

Coculture Analysis of Extracellular Protein Interactions Affecting Insulin Secretion by Pancreatic Beta Cells

अग्नाशय बीटा कोशिकाओं द्वारा इंसुलिन स्राव पीडि़त कोशिकी प्रोटीन की सहभागिता coculture विश्लेषण

Interactions between cell-surface proteins help coordinate the function of neighboring cells. Pancreatic beta cells are clustered together within ...

A Modified Method for Heterotopic Mouse Heart Transplantion

Heterotopic माउस दिल Transplantion के लिए एक संशोधित विधि

Mice are often used as heart transplant donors and recipients in studies of transplant immunology due to the wide range of transgenic mice and reagents ...

Method for Obtaining Primary Ovarian Cancer Cells From Solid Specimens

ठोस नमूनों से प्राथमिक डिम्बग्रंथि कैंसर कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए विधि

Reliable tools for investigating ovarian cancer initiation and progression are urgently needed. While the use of ovarian cancer cell lines remains a ...

Isolation and Culture of Primary Endothelial Cells from Canine Arteries and Veins

अलगाव और कुत्ते धमनियों और नसों से प्राथमिक endothelial कोशिकाओं की संस्कृति

Cardiovascular disease is studied in both human and veterinary medicine. Endothelial cells have been used extensively as an in vitro model to study ...

Fluorescent Dye Labeling of Erythrocytes and Leukocytes for Studying the Flow Dynamics in Mouse Retinal Circulation

माउस रेटिना संचलन में फ्लो डायनेमिक्स के अध्ययन के लिए एरिथ्रोसाइट्स और ल्यूकोसाइट्स के फ्लोरोसेंट डाई लेबलिंग

The retinal and choroidal blood flow dynamics may provide insight into the pathophysiology and sequelae of various ocular diseases, such as glaucoma, ...

Lentiviral Vector-mediated Gene Therapy of Hepatocytes Ex Vivo for Autologous Transplantation in Swine

Lentiviral Vector-mediated Gene Therapy of Hepatocytes Ex Vivo for Autologous Transplantation in Swine

Lentiviral वेक्टर-हेपैटोसाइट्स पूर्व Vivo की मध्यस्थता जीन थेरेपी सूअर में ऑटोलॉगस प्रत्यारोपण के लिए

Gene therapy is an ideal choice to cure many inborn errors of metabolism of the liver. Ex-vivo, lentiviral vectors have been used successfully in the ...

Ultrasonic-augmented Primary Adult Fibroblast Isolation

अल्ट्रासोनिक-संवर्धित प्राथमिक वयस्क Fibroblast अलगाव

Primary adult fibroblasts have become an important tool to study fibrosis, fibroblast interactions and inflammation in all body tissues. Since primary ...

A Non-Invasive Method for Generating the Cyclic Loading-Induced Intra-Articular Cartilage Lesion Model of the Rat Knee

चूहे के घुटने के चक्रीय लोडिंग-प्रेरित इंट्रा-आर्टिकुलर कार्टिलेज लेशन मॉडल उत्पन्न करने के लिए एक गैर-इनवेसिव विधि

The pathophysiology of primary osteoarthritis (OA) remains unclear. However, a specific subclassification of OA in relatively younger age groups is likely ...