Name: isolation of primary mouse hepatocytes for nascent protein synthesis analysis by non-radioactive l-azidohomoalanine labeling method
Uploaded: 2018-10-23T13:30:00
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Ringraziamo la d. ssa Joonbae Seo e Vivian Hwa per il loro contributo scientifico e la discussione. Questo lavoro è stato supportato dal National Institute of Health (NIH) (R01DK107530). T.N. è stato sostenuto da PRESTO dalla Japan Science and Technology Agency. Una parte di questo studio è stata sostenuta da una sovvenzione dal NIH (P30DK078392) per il digestivo malattia Research Core Center di Cincinnati.

Questo protocollo contiene l'uso di topi di laboratorio. Cura degli animali e procedure sperimentali sono state eseguite secondo procedure approvate dai comitati di cura degli animali di Cincinnati Children Hospital Medical Center.
1. isolamento degli epatociti primari del topo
<ol><li>Preparazioni pre-isolamento<ol>
<li>Preparare 450 mL di buffer gradienti di densità 40% come descritto in tabella 1 e conservare a 4 ° C (15 mL/topo).</li>
		<li>Preparare 500 mL di Medium d...

Anche se parecchie linee cellulari immortalizzate epatiche sono state proposte e utilizzati per indagare le funzioni epatiche49,50,51,52, queste cellule mancano generalmente importante e fondamentale funzioni degli epatociti normali, quali l'espressione di albumina (Figura 3). È ampiamente riconosciuto, pertanto, che utilizzando epatociti primari è un'opzione imp...

La proteina è un elemento nutritivo importante e circa il 50% del peso secco del corpo umano è composto di proteine che hanno diversi tratti biologici e funzioni1. Di conseguenza, la sintesi delle proteine è uno della maggior parte degli eventi che richiede energia e un'alterazione nel metabolismo delle proteine altamente è associata con lo sviluppo di malattie, tra cui malattie metaboliche2,3,4. Nel fegato, biosintesi della proteina rappresenta circa 20 – 30% del consumo totale di energia5,6. Inoltre, la funzione di proteine come non solo passivo o blocchi del fegato, ma attivi anche fattori che mediano segnale intracellulare o extracellularly a regolare il metabolismo sistemico7. Per esempio, la riduzione dei livelli di albumina di siero, che viene sintetizzata e secreta dal fegato e la proteina più abbondante nel plasma8, aumenta il rischio di tipo 2 diabete sviluppo9,10, 11, mentre una maggiore concentrazione di albumina è protettiva contro lo sviluppo di sindrome metabolica12. Inoltre, disturbi o interruzioni delle proteine epatiche secretive o membrana-limita, che modulano l'omeostasi del colesterolo, incluse le lipoproteine e LDLR LRP1, possono portare allo sviluppo di insulino-resistenza, iperlipidemia o aterosclerosi 13. Pertanto, l'identificazione dei meccanismi molecolari patofisiologici che sono coinvolti nella dispersione del metabolismo della proteina nel fegato e delle complicanze metaboliche associate potrebbe essere utile per scoprire romanzo farmacologico si avvicina per ritardare l'insorgenza o trattare malattie metaboliche come l'insulino-resistenza, diabete e steatosi epatica non alcolica.
Sintesi proteica è strettamente legata allo stato di energia cellulare (ad es., la formazione di un legame peptidico durante la fase di allungamento della sintesi proteica richiede di legami fosfodiesterei 414) ed è regolata da meccanismi molecolari che senso Inter - e intra - cellulari disponibilità nutriente15,16. Chinasi proteica AMP-attivata (AMPK) è uno dei sensori di energia intracellulare che mantengono l'omeostasi di energia17. Una volta AMPK attivata quando i livelli energetici cellulari diventano più bassi, AMPK e suoi substrati mirate funzionano per stimolare le vie cataboliche e inibire i processi anabolici compreso proteina sintesi18,19. La regolazione della sintesi proteica è mediata dalla fosforilazione di molteplici fattori di traduzione e proteine ribosomiali20. Di nota, l'obiettivo mammifero della rapamicina complesso 1 (mTORC1), delle principali cause della sintesi proteica, è uno degli obiettivi principali di AMPK21. Attivazione del pathway di mTORC1 migliora la crescita delle cellule e la proliferazione di stimolante proteina traduzione e autofagia20,21. Pertanto, è logico che l'attivazione di AMPK può inibire la sintesi di mTORC1-mediato della proteina22. Infatti, l'attivazione di AMPK contrasta e fosforila direttamente mTORC1 il residuo di treonina 2446 (Thr2446) che conduce alla sua inattivazione23 e la soppressione della proteina biosintesi24. Inoltre, AMPK indirettamente può inibire la funzione di mTORC1 di fosforilazione e l'attivazione della sclerosi tuberosa complessa 2 (TSC2)25 che è il regolatore a Monte della cascata di segnalazione di mTORC1. In breve, disregolazione di queste vie nel fegato è spesso legata allo sviluppo di malattie metaboliche e di conseguenza c'è una necessità critica di stabilire efficaci strumenti sperimentali per studiare il ruolo di queste vie nella regolazione dell'energia e metabolismo delle proteine negli epatociti.
C'è una forte somiglianza tra le proprietà funzionali di epatociti primari isolati e in vivo gli epatociti rispetto con in vitro fegato-derivato delle cellule linee26,27,28. È stato dimostrato che epatociti umani primari condividano 77% somiglianza con quello delle biopsie del fegato, mentre le cellule HepG2, che sono cellule cancerose epatiche ben differenziate e ampiamente utilizzati per indagare le funzioni epatiche, visualizzare inferiore al 48% nel contesto della 29di profili di espressione genica. Pertanto, l'utilizzo di epatociti primari, piuttosto che le cellule immortalizzate cultura, è di vitale importanza nella ricerca di fisiologia e funzione epatica, e diversi protocolli sono disponibili per l'isolamento e la coltura di epatociti primari soprattutto da ratti30,31. Mentre gli epatociti di ratto sono utili con un rendimento relativamente più elevato di cellule, epatociti del topo hanno un potenziale maggiore in molti aspetti scientifici grazie alla vasta disponibilità di topi geneticamente modulati. Tuttavia, ci sono diverse sfide tecniche in isolamento sani e abbondanti epatociti primari dai topi per cellulare e molecolare-valutazioni basate su: in primo luogo, inserimento della cannula per irrorare il fegato con i reagenti buffer è molto difficile da gestire a causa del mouse piccolo e sottile vena portale o la vena cava inferiore; in secondo luogo, un tempo più lungo di manipolazione delle cellule durante l'isolamento può causare riduzione nella cella quantità e qualità; metodi di separazione meccanica in terzo luogo, non-enzimatica possono causare seri danni e produrre un rendimento basso di epatociti primari isolato vitali32,33. Nel 1980, tecnica di aspersione della collagenosi è stato introdotto per isolare gli epatociti dal fegato di animali34. Questo metodo si basa sulla perfusione collagenosi del fegato35,36,37, infusione del fegato con calcio chelante soluzione38,39, digestione enzimatica e dissociazione meccanica del parenchima epatico35. Nel primo passaggio, un fegato di topo è irrorato con un buffer liberi di calcio [Ca2 +] contenente un chelatore [Ca2 +] (etilenediammina acido etilendiamminotetraacetico, EDTA). Nel secondo passaggio, il fegato di topo è irrorato con un buffer contenente collagenasi per idrolizzare le interazioni cellulari-matrice extracellulare. A differenza di buffer utilizzato nella prima fase, la presenza di ioni [Ca2 +] nel buffer del secondo passaggio è necessaria per l'attività della collagenosi efficace, dopo di che il fegato digerito deve essere ulteriormente delicatamente e meccanicamente separati utilizzando forcipe tra il capsula epatica e tessuti parenchimatosi. Infine, tessuto connettivo viene rimosso dal filtro e successiva centrifugazione separa epatociti vitali dalle cellule non parenchimali sia e non-viventi epatociti con l'uso di densità gradiente buffer40,41 ,42. Nello studio presente, vi mostriamo una tecnica di aspersione di collagenasi modificate in due fasi per isolare epatociti primari da un fegato di topo per l'analisi della sintesi proteica.
La radiomarcatura di proteine è ampiamente usato per quantificare i livelli di espressione, tassi di fatturato e determinare la distribuzione biologica delle proteine43 grazie all'elevata sensibilità di rilevazione di radioattività44. Tuttavia, l'uso di isotopi radioattivi richiede circostanze e delle procedure di ricerca altamente controllata45. Metodi alternativi non radioattivo sono stati sviluppati e sempre più hanno guadagnato in popolarità. La reazione di legatura chemo-selettive con un metodo di rilevazione della proteina tetrametilrodamina (TAMRA) è uno di loro e si basa sulla reazione tra un'azide e alchino gruppi46, che può essere utilizzata per analizzare gli eventi cellulari come chemo-selettive rilevamento di sintesi proteica nascente e sottoclassi delle glicoproteine per volta con un gruppo di azide. Per la sintesi proteica nascente, L-Azidohomoalanine (L-AHA, un amminoacido per volta azide) può essere incorporato nelle proteine metabolicamente e rilevato utilizzando il TAMRA proteina rilevamento metodo47. Usando questo test in epatociti primari del topo, indichiamo che il tasso di sintesi proteica nascente è strettamente legato alla disponibilità di ATP da mitocondriale e l'attivazione di AMPK (Figura 1).
In sintesi, l'utilizzo di epatociti primari del topo è fondamentale per indagare il metabolismo proteico ed energetico e quantificare la sintesi proteica nascente è prezioso per ottenere approfondimenti il ruolo fisiologico delle vie rilevanti per lo sviluppo e cura delle malattie relative dell'epatocita.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>HEPES buffer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP310-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D16-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene glycol-bis(&#946;-aminoethyl ether)-tetraacetic acid</td>
			<td>AmericanBio</td>
			<td>AB00505-00025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS (10X) no calcium, magnesium, phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14185-052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride Dihydrate (CaCl2.2H2O)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C79-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Density gradient buffer</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0891-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium) low glucose, pyruvate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11885-084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30910.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS) (1X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>1897141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Williams medium E, no glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12551-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-alanyl-L-glutamine dipeptide supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type X</td>
			<td>Wako Pure Chemical Industries</td>
			<td>039-17864</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion pump</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>Masterflex L/S</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IV administration set</td>
			<td>EXELINT</td>
			<td>29081</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A water bath</td>
			<td>REVSCI</td>
			<td>RS-PB-200</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube heater</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Isotemp</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Decon Lab, Inc</td>
			<td>0-39613</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>PHOENIX</td>
			<td>10250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclaved Cotton Tips</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>23-400-124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm Petri Dish</td>
			<td>TPP</td>
			<td>93100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Connector (Male Luer Lock Ring)</td>
			<td>Cole-Parmer instrument</td>
			<td>EW-4551807</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24G catheters</td>
			<td>TERUMO</td>
			<td>Surflo 24Gx3/4&#39;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#956;m Filter (CELL STRAINERS)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10199-658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml conical-bottom centrifuge tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89039-666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml conical-bottom centrifuge tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89039-658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemoselective ligation reaction PROTEIN ANALYSIS DETECTION KIT, TAMRA ALKYNE</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C33370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AHA (L-azidohomoalanine)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (methionine free)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21013024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Cystine Dihydrochloride</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>C2526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laemmli sample buffer</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>161-0737</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>P9599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS solution (20%)</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>161-0418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCL (1M)</td>
			<td>American Bioanalytical</td>
			<td>AB14044-01000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatase Inhibitor Cocktail</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>P5726</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein concentration measuring Kit (Bovin Serum Albumin-BSA)</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>500-0207</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well tissue culture plate</td>
			<td>TPP</td>
			<td>92006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Heatblock</td>
			<td>VWR</td>
			<td>12621-092</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-Rotator</td>
			<td>Grant-bio</td>
			<td>PTR-60</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic Sonicator</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>GE130PB</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Heavy-Duty Vortex Mixer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97043-566</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A variable mode laser scanner</td>
			<td>GE Healthcare Life Science</td>
			<td>FLA 9500</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie-dye reagent</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>24594</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>CKX53</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Western Blotting apparatus</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1658004</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5424R</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated cell counter</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>TC20</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluorChem R system</td>
			<td>proteinsimple</td>
			<td>-</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-Ampka (T172) antibody</td>
			<td>Cell signaling</td>
			<td>2535</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Total-AMPK antibody</td>
			<td>Cell signaling</td>
			<td>5832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin antibody</td>
			<td>Cell signaling</td>
			<td>4929</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>beta actin antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-130656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine scissors and forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of primary mouse hepatocytes for nascent protein synthesis analysis by non-radioactive l-azidohomoalanine labeling method

Gli epatociti sono cellule parenchimatiche del fegato e coinvolgere più funzioni metaboliche, tra cui la sintesi e la secrezione di proteine essenziali per l'omeostasi energetica sistemica. Epatociti primari isolati dal fegato murino costituiscono un prezioso strumento biologico per comprendere le proprietà funzionali o le alterazioni che si verificano nel fegato. Qui descriviamo un metodo per l'isolamento e la coltura di epatociti primari del topo eseguendo una tecnica di perfusione in due fasi della collagenosi ed discutere la loro utilizzazione per indagare il metabolismo delle proteine. Il fegato di un topo adulto in sequenza è irrorato con acido tetraacetico di glicole etilenico-bis (EGTA) e la collagenosi, seguita dall'isolamento degli epatociti con il buffer di gradienti di densità. Questi epatociti isolati sono vitali su piastre di coltura e mantengono la maggior parte delle caratteristiche dotate degli epatociti. Questi epatociti possono essere utilizzati per le valutazioni del metabolismo delle proteine tra cui sintesi proteica nascente con reagenti non radioattivo. Indichiamo che gli epatociti isolati sono facilmente controllati e comprendono una maggiore stabilità di qualità e volume di sintesi delle proteine legata al metabolismo energetico utilizzando la reazione di legatura chemo-selettive con una proteina di tetrametilrodamina (TAMRA) Metodo di rilevazione e analisi macchiantesi occidentali. Pertanto, questo metodo è prezioso per lo studio di sintesi epatica della proteina nascente collegata all'omeostasi energetica. Il seguente protocollo descrive i metodi per il rilevamento della sintesi proteica nascente e l'isolamento degli epatociti primari del topo di alta qualità e materiali.

Isolamento di epatociti primari del topo si traduce in una resa di circa 20 x 106 totale cellule/mouse. Istologicamente, epatociti primari collegati e dal vivo appaiono poligonali o tipico esagonale in forma con chiaramente delineato membranosa contorno dopo 24 ore di incubazione (Figura 2).
Per verificare se cellule isolate sono epatociti primari, abbiamo confrontato i livelli di espress...

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Isolation of Primary Mouse Hepatocytes for Nascent Protein Synthesis Analysis by Non-radioactive L-azidohomoalanine Labeling Method

Isolamento degli epatociti primari del topo per l'analisi di sintesi della proteina nascente dal metodo di etichettatura Non radioattivo L-azidohomoalanine

Qui, presentiamo un protocollo per l'isolamento degli epatociti primari del topo sano e funzionale. Istruzioni per la rilevazione sintesi epatica delle proteine nascenti dal substrato di etichettatura non radioattivo erano fornite per aiutarvi a comprendere i meccanismi alla base della sintesi proteica nel contesto dell'omeostasi del metabolismo energetico nel fegato.

Hepatocytes are parenchymal cells of the liver and engage multiple metabolic functions, including synthesis and secretion of proteins essential for ...

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave in vari campi di ricerca sulle malattie metaboliche sulle alterazioni molecolari dell'energia epatica e della biosintesi proteica nell'obesità, nel fegato grasso analcolico e nel diabete di tipo due. I principali vantaggi di questa tecnica sono che facilita l'isolamento degli epatociti del topo primario funzionale e rileva le proteine nascenti epatiche attraverso un substrato di etichettatura nonradioattivo. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale in quanto la fase di perfusione è difficile da imparare a causa dei piccoli e sottili vasi sanguigni del topo.Per la perfusione epatica, inserire con cura un catetere calibro 24 nella Vena Cava inferiore o nell'IVC proprio alla biforcazione con la vena renale destra. Rimuovere l'ago del catetere mantenendo la posizione della cannula all'interno dell'IVC e collegare una cannula calibro 24 con tubo di perfusione utilizzando il connettore. Inizia a perfondere il fegato con HBSS caldo meno a una portata permanente di quattro millilitri tagliando rapidamente la vena splenica per drenare il sangue interno.Dopo 10 minuti, perfondere il fegato di topo con 35 millilitri di HBSS più integrato con collagenasi tipo X ad una portata di quattro millilitri al minuto, bloccando la vena splenica per circa 10 secondi ogni pochi minuti per facilitare la distribuzione del perfusato in tutto il fegato. Quando tutta la collagenasi è stata perfusa, trasferire il fegato su un tessuto da laboratorio prima di fermare la pompa per evitare il riflusso di sangue nel fegato. Utilizzare le fasci per rimuovere la cistifellea e pulire delicatamente il fegato con un tessuto da laboratorio fresco per rimuovere qualsiasi sangue.Mettere il fegato in una piastra di Petri da 100 millimetri contenente cinque millilitri di HBSS caldo fresco più integrato con collagenasi e utilizzare forcep con punta vagante per rimuovere delicatamente la capsula del fegato. Utilizzare le forcep per disperdere accuratamente il tessuto parenchimico e aggiungere 15 millilitri DMEM freddo alla piastra di Petri. Agitare delicatamente il fegato strappato per rilasciare le cellule parenchimali residue nel mezzo e aggiungere altri 15 millilitri di DMEM freddo al piatto per acquisire il resto delle cellule.Quindi filtrare i liquami tissutali attraverso un colino cellulare da 100 micron in un tubo conico da 50 millilitri sul ghiaccio. Per isolare gli epatociti primari del topo, raccogliere le cellule mediante centrifugazione e rimosogliere il pellet in 10 millilitri di DMEM fresco. Sovrapporre accuratamente le celle su un buffer di gradiente di densità del 40% per la separazione del gradiente di densità, eliminando le celle dagli strati superiore e medio dopo la centrifugazione.Rimospendò il pellet primario di epatociti parenchimali con da due a tre millilitri del Medium E di William per evitare di raccogliere cellule morte dalla parete del tubo e trasferire le cellule in un nuovo tubo da 50 millilitri. Mescolare le cellule con altri sette-otto millilitri del Mezzo E di William prima della centrifugazione e rimorsi il pellet in 10, 20 o 30 millilitri di E medio di William fresco a seconda delle dimensioni del pellet. Dopo il conteggio, seme sei volte 10 alla quinta parte di ogni pozzo di una piastra di sei pozzi per un'incubazione da due a tre ore a 37 gradi Celsius.Al termine dell'incubazione, sostituire il mezzo con DMEM integrato con siero bovino fetale al 10% e anti-anti per rimuovere le cellule morte e non attaccate e riportare le cellule nell'incubatrice durante la notte. Per l'etichettatura delle proteine nascenti modificate dall'azide, aggiungere da 20 a 40 microgrammi di litolato cellulare a 50 microlitri di tampone di reazione 2X. Portare il volume a 80 microlitri con acqua deionizzata distillata e vortice la soluzione proteica per cinque secondi.Aggiungere cinque microlitri di solfato di rame alle cellule per un altro vortice di cinque secondi, seguiti da cinque microlitri di additivo tampone di reazione uno con cinque secondi di vortice. Dopo un'incubazione di tre minuti, aggiungere 10 microlitri di additivo tampone di reazione ricostituito due alle cellule per un altro vortice di cinque secondi e ruotare il campione per 20 minuti a quattro gradi Celsius su una macchina multi-rotatore protetta dalla luce. Al termine della rotazione, aggiungere 300 microlitri di metanolo al lisato, seguiti da 75 microlitri di cloroformio e 200 microlitri di acqua distillata doppia.Raccogliere la proteina etichettata per centrifugazione e aggiungere 250 microlitri di metanolo fresco al pellet. Dopo il vortice, centrifugare nuovamente il lisato e coprire il pellet nudo con un tessuto privo di pelucchi per 15 minuti a temperatura ambiente. Per l'analisi PAGE, solubilizzare il pellet essiccato in 20 microlitri di tampone di carico senza beta-mercaptoetanolo e vortice il pellet per 10 minuti.Successivamente, riscaldare la proteina in un blocco termico di 70 gradi Celsius per 10 minuti e caricare il campione su un gel di solfato di dodecil di sodio al 10% per il rilevamento della tetrametillrhodamina. Quindi utilizzare uno scanner laser in modalità variabile per la quantificazione precisa delle proteine nascenti etichettate AHA. Istologicamente, gli epatociti primari vivi e attaccati appaiono tipicamente di forma poligonale o esagonale con un confine membranoso chiaramente delineato dopo 24 ore di coltura.Per confermare se le cellule isolate sono epatociti primari, in questo esperimento, i livelli di espressione delle proteine dell'albumina sono stati confrontati nei fibroblasti embrionali del topo, una linea cellulare di epatoma del topo, epatociti di topo primari isolati e fegati di topo. L'espressione della proteina dell'albumina è stata rilevata negli epatociti primari del topo e nei fegati di topo, ma non era rilevabile né nei fibroblasti embrionali del topo né nelle cellule della linea cellulare dell'epatoma. Il trattamento primario con epatociti con Rotenone micromolare per quattro o sei ore ha rivelato una robusta induzione della protein chinasi epatica attivata dall'AMP rilevata dall'aumento dei livelli di fosforilazione sulla proteina chinasi Epatica attivata da AMP T172 simile a quelle osservate in vivo.Infatti, cinque ore di trattamento rotenone micromolare 10 hanno avuto profondi effetti inibitori sulla nascente sintesi proteica negli epatociti primari trattati rispetto alle cellule di controllo non trattate come dimostrato da un saggio di reazione di ligation chemioselettiva. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di preparare in anticipo tutti i reagenti e i mezzi necessari. Questa tecnica ha spianato la strada al ricercatore nel campo della fisiopatologia metabolica epatica per esplorare il meccanismo molecolare della regolazione delle proteine energetiche nell'obesità e il diabete di tipo due nell'epatocita primario isolato del topo.

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Medicine

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