Name: isolation of primary mouse hepatocytes for nascent protein synthesis analysis by non-radioactive l-azidohomoalanine labeling method
Uploaded: 2018-10-23T13:30:00
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科学的な議論には、夫妻 Joonbae Seo とビビアン華をありがとうございます。この作品は、国立衛生研究所 (NIH) (R01DK107530) によって支えられました。濃度は, は、日本科学技術振興機構のさきがけによって支えられました。本研究の一部は、シンシナティの消化器病研究コアセンターの NIH (P30DK078392) からの助成金によって支えられました。

このプロトコルには、実験用マウスの使用が含まれています。動物のケアと実験手順は、シンシナティ子供病院医療センター動物の世話委員会によって承認された手続きに従って行われました。
1. プライマリ マウス肝細胞の分離
<ol><li>前の分離準備<ol>
<li>表 1と 4 ° C (15 mL/マウス) での説明に従って 450 mL の 40% 密度勾配バッファーを準備します。</li>
		<li><...

これらの細胞が一般に重要かつ基本的な不足がいくつか不死化肝細胞を提案し、肝機能49,50,51,52を調査するために使用すると、アルブミン (図 3) の式など、通常の肝細胞の機能。広く認識されて、したがって、初代肝細胞を利用したが肝臓の生理学および培養とこれらの細?...

タンパク質は重要な栄養素と人体の乾燥重量の約 50% はいくつかの生物学的特性と機能1のあるタンパク質から成る。したがって、タンパク質合成はほとんどエネルギーがかかるイベントの一つ、タンパク質の代謝変化は高代謝性疾患2,3、4を含む病気の開発に関連付けられています。肝臓で蛋白質の生合成は、総エネルギー消費量5,6の約 20-30% を占めています。また、タンパク質の機能としてだけでなく、パッシブまたは建物のブロックもアクティブな信号を仲介する因子は、肝臓の細胞内や細胞外7全身の代謝を調節します。合成され、肝臓とプラズマ8の最も豊富な蛋白質によって分泌される血清アルブミンの減らされたレベルが 2 型糖尿病の開発9,10,のリスクを増加させる例えば、11、血清アルブミンの濃度が高く、メタボリック シンドローム12を開発することに対して保護一方。邪魔やリポタンパク質を来すと LRP1 を含む、コレステロール恒常性を調節する、分泌または膜区切のラット肝タンパク質の混乱がさらに、インスリン抵抗性、高脂血症、動脈硬化症の発展につながることができます。13したがって、蛋白質代謝障害肝臓とその関連付けられた代謝性合併症に関与している分子病態生理学的メカニズムの同定は、薬理学的小説を発見するため役に立つかもしれない。発症を遅らせるか、またはインスリン抵抗性、糖尿病、非アルコール性脂肪肝など代謝性疾患の治療へのアプローチします。
タンパク質の合成は、細胞のエネルギー状態に密接に結びついた (例えば、蛋白質合成の伸長段階 1 つのペプチド結合の形成が必要 4 リン酸ジエステル結合14) 感知の分子経路によって調節されていると間や細胞内栄養アベイラビリティ15,16。AMP 活性化プロテインキナーゼ (AMPK) は、17エネルギー恒常性を維持する細胞内のエネルギー センサーの 1 つです。AMPK がアクティブになったときに細胞のエネルギー レベルが低下 AMPK やその対象となる基板に異化経路を刺激し、タンパク質合成18,19を含む同化の過程を阻害する機能します。タンパク質合成の調節は、複数の翻訳因子とリボソームタンパク質20のリン酸化によって媒介されます。ノートの哺乳類ラパマイシン標的複雑な 1 (mTORC1)、タンパク質合成の主要なドライバーは、AMPK の21の主要なターゲットの 1 つです。MTORC1 経路の活性化は、刺激的なタンパク質翻訳とオートファジー20,21により細胞の成長と増殖を強化します。したがって、AMPK の活性化が22mTORC1 を介したタンパク質合成を抑制することが論理です。確かに、AMPK の活性化を打ち消すし、直接その不活性化23と24タンパク質生合成の抑制につながるスレオニン残基 2446 (Thr2446) で mTORC1 を廃止します。また、AMPK 直接抑制することがないリン酸化と結節性硬化症複合 2 (TSC2)25 mTORC1 シグナル伝達カスケードの上流の調節因子である活性化による mTORC1 機能。要するに、肝臓でこれらの経路の制御不全は、しばしば代謝性疾患の開発にリンクされて、従ってエネルギーの制御にこれらの細道の役割を調査するため効果的な実験ツールを確立する重要な必要性があると肝細胞の蛋白質新陳代謝。
分離肝細胞の機能特性と体内肝細胞より体外肝由来細胞ライン26,27,28との強い類似性があります。それが示されているプライマリひと肝細胞が肝生検の 77% の類似を共有する HepG2 細胞を分化肝がん細胞と肝機能を調べるための広くのコンテキストで 48% 未満を表示するのに対し遺伝子発現プロファイル、29をです。したがって、肝機能と生理学の調査に重要です不死化細胞ではなく、初代肝細胞の利用、分離肝細胞の培養に使用可能ないくつかのプロトコル30,31をラットから特に。ラット肝細胞は細胞の比較的高い収率で役に立つ、マウス肝細胞は遺伝的変調マウスで広く利用できるため多くの科学的な面で大きな可能性を持ってください。ただし、健康と豊富な肝細胞および分子に基づく評価のマウスからの分離にはいくつかの技術的な課題があります: まず、バッファー試薬と肝臓を灌流してカニューレ挿入は非常に扱いにくい小さくて細いマウス門脈または下大静脈; のため第二に、分離の過程で細胞の長い操作時間を引き起こす可能性が減少細胞の量と質。第三に、非酵素的機械的分離法は、厳しい損傷で起因し、実行可能な分離肝細胞32,33の低収量を生成できます。1980 年代、コラゲナーゼ灌流法は動物の34の肝臓から肝細胞を分離するため導入されました。この手法はコラゲナーゼ灌流肝35,36,の37、カルシウム キレート剤ソリューション38,39, 酵素消化肝臓の注入と肝実質35の機械的解離。最初のステップで [Ca2 +] キレート (エチレンジアミン四酢酸、EDTA) を含むカルシウム [Ca2 +] 空きバッファーをマウス肝臓は灌流します。2 番目の手順では、マウスの肝臓は細胞-細胞外マトリックスの相互作用を分解するコラゲナーゼを含むバッファーと灌流します。ステップ 1 で使用するバッファーとは異なり [Ca2 +] 2 番目のステップのバッファーでイオンの存在はその後消化肝臓はさらにゆっくりと機械的に分離する間鉗子を使用して、効果的なコラゲナーゼに必要な肝カプセルと柔組織。最後に、結合組織はフィルタ リングによって削除され、その後遠心分離両方非実質細胞から実行可能な肝細胞と肝細胞以外の生物密度勾配バッファー40,41 を使って、42。本研究ではタンパク質合成の分析のためのマウスの肝臓から肝細胞を分離する変更された 2 段階コラゲナーゼ灌流法を紹介します。
蛋白質のカイネティックス、広く発現レベル、離職率を定量化し、蛋白質43高感度放射能44の検出のための生物の分布を決定する使用されます。ただし、放射性同位元素の使用には、高精度制御研究の状況と手順45が必要です。非放射性方法は開発されているし、ますます人気を集めています。Tetramethylrhodamine (耽羅) タンパク質検出法と化学療法選択の ligation の反作用はそれらの 1 つ、アジドとアルキン グループ46、よう携帯電話のイベントを分析する利用できる間化学療法選択的反応に基づいています新生タンパク質の合成とサブクラス、アジド基で修飾糖タンパク質の検出します。新生タンパク質合成の L Azidohomoalanine (L AHA、アジ化修飾アミノ酸) 代謝蛋白質に組み込まれて、耽羅タンパク質検出法47を使用して検出します。プライマリ マウス肝細胞のこの試金を使用して、我々 はミトコンドリアから ATP の可用性に新生タンパク質合成速度がしっかりとリンクされている表示と AMPK 活性化 (図 1)。
要約すると、プライマリ マウス肝細胞の使用率はタンパク質とエネルギー代謝を調査することが重要と新生タンパク質合成の定量化は開発に関連する経路の生理学的役割についての洞察を得るため貴重であると肝疾患の治療。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>HEPES buffer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP310-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D16-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene glycol-bis(&#946;-aminoethyl ether)-tetraacetic acid</td>
			<td>AmericanBio</td>
			<td>AB00505-00025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS (10X) no calcium, magnesium, phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14185-052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride Dihydrate (CaCl2.2H2O)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C79-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Density gradient buffer</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0891-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium) low glucose, pyruvate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11885-084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30910.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS) (1X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>1897141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Williams medium E, no glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12551-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-alanyl-L-glutamine dipeptide supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type X</td>
			<td>Wako Pure Chemical Industries</td>
			<td>039-17864</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion pump</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>Masterflex L/S</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IV administration set</td>
			<td>EXELINT</td>
			<td>29081</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A water bath</td>
			<td>REVSCI</td>
			<td>RS-PB-200</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube heater</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Isotemp</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Decon Lab, Inc</td>
			<td>0-39613</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>PHOENIX</td>
			<td>10250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclaved Cotton Tips</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>23-400-124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm Petri Dish</td>
			<td>TPP</td>
			<td>93100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Connector (Male Luer Lock Ring)</td>
			<td>Cole-Parmer instrument</td>
			<td>EW-4551807</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24G catheters</td>
			<td>TERUMO</td>
			<td>Surflo 24Gx3/4&#39;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#956;m Filter (CELL STRAINERS)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10199-658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml conical-bottom centrifuge tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89039-666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml conical-bottom centrifuge tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89039-658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemoselective ligation reaction PROTEIN ANALYSIS DETECTION KIT, TAMRA ALKYNE</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C33370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AHA (L-azidohomoalanine)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (methionine free)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21013024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Cystine Dihydrochloride</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>C2526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laemmli sample buffer</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>161-0737</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>P9599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS solution (20%)</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>161-0418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCL (1M)</td>
			<td>American Bioanalytical</td>
			<td>AB14044-01000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatase Inhibitor Cocktail</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>P5726</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein concentration measuring Kit (Bovin Serum Albumin-BSA)</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>500-0207</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well tissue culture plate</td>
			<td>TPP</td>
			<td>92006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Heatblock</td>
			<td>VWR</td>
			<td>12621-092</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-Rotator</td>
			<td>Grant-bio</td>
			<td>PTR-60</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic Sonicator</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>GE130PB</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Heavy-Duty Vortex Mixer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97043-566</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A variable mode laser scanner</td>
			<td>GE Healthcare Life Science</td>
			<td>FLA 9500</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie-dye reagent</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>24594</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>CKX53</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Western Blotting apparatus</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1658004</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5424R</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated cell counter</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>TC20</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluorChem R system</td>
			<td>proteinsimple</td>
			<td>-</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-Ampka (T172) antibody</td>
			<td>Cell signaling</td>
			<td>2535</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Total-AMPK antibody</td>
			<td>Cell signaling</td>
			<td>5832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin antibody</td>
			<td>Cell signaling</td>
			<td>4929</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>beta actin antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-130656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine scissors and forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of primary mouse hepatocytes for nascent protein synthesis analysis by non-radioactive l-azidohomoalanine labeling method

肝細胞は肝実質細胞で、全身のエネルギー代謝に不可欠なタンパク質の合成・分泌を含む複数の代謝機能に従事します。マウスの肝臓から分離した初代肝細胞は、機能性や肝臓で発生する変更を理解する貴重な生物学的ツールを構成します。ここ我々 二段コラゲナーゼ灌流法を実行することによって分離およびプライマリ マウス肝細胞の培養方法を説明し、蛋白代謝を調査するために利用します。成体マウスの肝臓は順番にエチレング リコール ビス四酢酸 (グリコールエーテルジアミン四酢酸)、コラゲナーゼ、密度勾配バッファーと肝細胞の分離に続いてにおいて灌流します。これらの分離肝細胞は培養皿で実行可能な肝細胞の寄附の特性の大半を維持します。これらの肝細胞は、非放射性試薬の新生タンパク質合成を含むタンパク質代謝の評価に使用できます。示す分離肝細胞が容易に制御 Tetramethylrhodamine (耽羅) 蛋白質と化学療法選択の ligation の反作用を利用してエネルギー代謝に関与する蛋白合成の高い質と量の安定性を構成します。検出法および西部のしみが付く分析。したがって、この方法はエネルギー恒常性に関与する肝初期蛋白合成を調査するためです。次のプロトコルは、材料と質の高いプライマリ マウス肝細胞の分離と新生タンパク質合成の検出方法について説明します。

プライマリ マウス肝細胞の分離の結果約 20 x 106合計セル/マウスの収率で。組織学的に、ライブと接続された初代肝細胞多角形または典型的な六角形で明確に説明膜境界後 24 時間培養 (図 2)。
単離細胞が肝細胞であるかどうかを確認、プライマリ マウス単離肝細胞 (PMHs)、マウス萌芽期の繊?...

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Isolation of Primary Mouse Hepatocytes for Nascent Protein Synthesis Analysis by Non-radioactive L-azidohomoalanine Labeling Method

非放射性 L azidohomoalanine ラベル法による新生タンパク質合成解析用プライマリ マウス肝細胞の分離

ここでは、健康で機能的なプライマリ マウス肝細胞の隔離のためのプロトコルを提案する.非放射性標識基板による肝新生タンパク質合成の検出については、肝臓でのエネルギー代謝の恒常性のコンテキストでのタンパク質合成の基になるメカニズムを理解するために提供されました。

Hepatocytes are parenchymal cells of the liver and engage multiple metabolic functions, including synthesis and secretion of proteins essential for ...

この方法は、肥満、非アルコール性脂肪肝、および2型糖尿病における肝エネルギーおよびタンパク質生合成の分子変化に関する様々な代謝疾患研究分野における重要な質問に答える助けとなる。この技術の主な利点は、非放射性標識基質を介して機能的な一次マウス肝細胞および検出肝新生タンパク質の単離を容易にすることである。この方法の視覚的なデモンストレーションは、灌流ステップが小さく、細いマウス血管のために学ぶのが難しいので重要です。肝臓灌流の場合は、右腎静脈との分岐で、24ゲージカテーテルを下の静脈カバまたはIVCに慎重に挿入します。カテーテル針を取り外し、IVC内でカニューレの位置を維持し、コネクタを使用して24ゲージカニューレを灌流管に接続します。4ミリリットルの永久流量で肝臓を温かいHBSSマイナスで穿ファジングし始めると、脾臓静脈を切断して内部血液を排出します。10分後、マウス肝臓に35ミリリットルのHBSSとコラゲラーゼタイプXを1分間に4ミリリットルの流量で補い、脾静脈を数分ごとに約10秒間クランプして肝臓全体の浸透液の分布を促進する。すべてのコラゲラーゼが浸透したら、肝臓に血液の逆流を避けるためにポンプを停止する前に、ラボ組織に肝臓を移します。鉗子を使用して胆嚢を取り除き、新鮮なラボ組織で肝臓を静かに拭いて血液を取り除きます。5ミリリットルの新鮮な暖かいHBSSとコラゲターゼを補充した100ミリメートルのペトリ皿に肝臓を入れ、迷子の鉗子を使って肝臓カプセルを穏やかに取り除きます。鉗子を使用して慎重にパレンキマル組織を分散させ、ペトリ皿に15ミリリットルの冷たいDMEMを加えます。引き裂かれた肝臓を穏やかに振って残留の小形細胞を培地に放出し、さらに15ミリリットルの冷たいDMEMを皿に加えて残りの細胞を獲得する。その後、100ミクロンの細胞ストレーナーを通して、氷の上の50ミリリットルの円錐管に組織スラリーをろ過します。一次マウス肝細胞を単離するには、遠心分離によって細胞を収集し、新鮮なDMEMの10ミリリットルでペレットを再懸濁します。密度勾配分離のために40%密度の勾配バッファーに細胞を慎重に重ね、遠心分離後に上層と中央層から細胞を廃棄します。一次層状肝細胞ペレットをウィリアムのミディアムEの2~3ミリリットルで再懸濁して、チューブの壁から死んだ細胞を採取することを避け、細胞を新しい50ミリリットルチューブに移します。遠心分離前にウィリアムのE培地の追加7〜8ミリリットルと細胞を混合し、ペレットの大きさに応じて新鮮なウィリアムのミディアムEの10、20、または30ミリリットルでペレットを再中断します。カウント後、摂氏37度で2〜3時間のインキュベーションのために6ウェルプレートの各ウェルに60〜5番目の細胞にシード。インキュベーションの終了時に、10%の胎児の牛血清を添加したDMEMと抗抗抗薬を培地に交換して、死んだ細胞と未結合の細胞を除去し、細胞を一晩インキュベーターに戻します。アジド修飾新規タンパク質標識の場合、2X反応バッファーの50マイクロリットルに20〜40マイクログラムの細胞ライセートを加えます。蒸留脱イオン水で80マイクロリットルの体積を持ち、タンパク質溶液を5秒間ボルテックスします。別の5秒渦のために細胞に硫酸銅の5マイクロリットルを追加し、次に5秒の渦を持つ反応緩衝剤1の5マイクロリットルが続きます。3分間のインキュベーションの後、再構成された反応バッファー添加剤10マイクロリットルを細胞に2つ加えて別の5秒渦を加え、光から保護されたマルチ回転機で4°Cでサンプルを20分間回転させます。回転の終わりに、300マイクロリットルのメタノールをリセートに加え、続いて75マイクロリットルのクロロホルム、200マイクロリットルの二重蒸留水を加える。遠心分離によって標識されたタンパク質を収集し、ペレットに新鮮なメタノールの250マイクロリットルを追加します。ボルテックス後、再びリセートを遠心分離し、室温で15分間、糸くずのない組織で裸ペレットを覆います。PAGE分析のために、乾燥したペレットをβ-メルカプトエタノールおよび渦液なしで20マイクロリットルの負荷バッファーで10分間可溶化する。次に、タンパク質を摂氏70度のヒートブロックで10分間加熱し、テトラメチルロダミン検出用の10%ドデシル硫酸ナトリウムゲルにサンプルをロードします。次に、可変モードのレーザースキャナーを使用して、AHA標識された新生タンパク質を正確に定量します。組織学的には、生きて、そして付着した原発肝細胞は、典型的には、培養の24時間後に明確に輪郭を描いた膜境界を有する形状の多角形または六角形に現れる。単離された細胞が原発性肝細胞であるかどうかを確認するために、本実験では、アルブミンタンパク質発現レベルをマウス胚性線維芽細胞、マウス肝腫細胞株、単離された一次マウス肝細胞、およびマウス肝で比較した。アルブミンタンパク質発現は、マウス肝細胞およびマウス肝の一次マウスで検出されたが、マウス胚性線維芽細胞または肝細胞株細胞のいずれにも検出できなかった。10ミクロモルロテノンを4〜6時間用いた一次肝細胞治療は、生体内で観察されたものと同様の肝AMP活性化プロテインキナーゼT172のリン酸化レベルの増加によって検出された肝AMP活性化プロテインキナーゼの堅牢な誘導を明らかにした。実際、5時間の10マイクロモルロテノン治療は、化学選択的ライゲーション反応アッセイによって示されるように、未処理の肝細胞と比較して、処理された原発肝細胞における新生タンパク質合成に対して深い阻害効果を有した。この手順を試みる間、すべての必要な試薬および媒体を事前に準備することを忘れないでください。この技術は、肝代謝病態生理学の分野の研究者が、単離された原発マウス肝細胞における肥満および2型糖尿病におけるエネルギータンパク質調節の分子メカニズムを探求する道を開いた。

Research

JoVE Journal

Medicine

A Model of Disturbed Flow-Induced Atherosclerosis in Mouse Carotid Artery by Partial Ligation and a Simple Method of RNA Isolation from Carotid Endothelium

部分的ライゲーションによるマウス頸動脈における乱流誘発アテローム性動脈硬化症と頸動脈内皮からのRNA単離の方法における簡便な方法のモデル

Despite the well-known close association, direct evidence linking disturbed flow to atherogenesis has been lacking. We have recently used a modified ...

In vitro Organoid Culture of Primary Mouse Colon Tumors

In vitro Organoid Culture of Primary Mouse Colon Tumors

プライマリマウス大腸腫瘍のin vitroオルガノイド培養で

Several  human and murine colon cancer cell lines have been established, physiologic  integrity of colon tumors such as multiple cell layers, basal-apical ...

Coculture Analysis of Extracellular Protein Interactions Affecting Insulin Secretion by Pancreatic Beta Cells

膵β細胞によるインスリン分泌に影響を及ぼす細胞外タンパク質相互作用の共培養分析

Interactions between cell-surface proteins help coordinate the function of neighboring cells. Pancreatic beta cells are clustered together within ...

A Modified Method for Heterotopic Mouse Heart Transplantion

異マウスハートTransplantion用に変更する方法

Mice are often used as heart transplant donors and recipients in studies of transplant immunology due to the wide range of transgenic mice and reagents ...

Method for Obtaining Primary Ovarian Cancer Cells From Solid Specimens

ソリッド検体からの原発性卵巣癌細胞を得る方法

Reliable tools for investigating ovarian cancer initiation and progression are urgently needed. While the use of ovarian cancer cell lines remains a ...

Isolation and Culture of Primary Endothelial Cells from Canine Arteries and Veins

犬の動脈と静脈からの初代内皮細胞の単離および培養

Cardiovascular disease is studied in both human and veterinary medicine. Endothelial cells have been used extensively as an in vitro model to study ...

Fluorescent Dye Labeling of Erythrocytes and Leukocytes for Studying the Flow Dynamics in Mouse Retinal Circulation

マウス網膜循環における血流動態を調べるための赤血球および白血球の蛍光色素標識

The retinal and choroidal blood flow dynamics may provide insight into the pathophysiology and sequelae of various ocular diseases, such as glaucoma, ...

Lentiviral Vector-mediated Gene Therapy of Hepatocytes Ex Vivo for Autologous Transplantation in Swine

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豚に自家移植用肝細胞Ex Vivoのレンチ ウイルス媒介性遺伝子治療

Gene therapy is an ideal choice to cure many inborn errors of metabolism of the liver. Ex-vivo, lentiviral vectors have been used successfully in the ...

Ultrasonic-augmented Primary Adult Fibroblast Isolation

超音波増強原発性成人線維芽細胞分離

Primary adult fibroblasts have become an important tool to study fibrosis, fibroblast interactions and inflammation in all body tissues. Since primary ...

A Non-Invasive Method for Generating the Cyclic Loading-Induced Intra-Articular Cartilage Lesion Model of the Rat Knee

ラット膝の周期的負荷誘発関節内軟骨病変モデルを生成するための非侵襲的方法

The pathophysiology of primary osteoarthritis (OA) remains unclear. However, a specific subclassification of OA in relatively younger age groups is likely ...

非放射性 L azidohomoalanine ラベル法による新生タンパク質合成解析用プライマリ マウス肝細胞の分離

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