Name: isolation of primary mouse hepatocytes for nascent protein synthesis analysis by non-radioactive l-azidohomoalanine labeling method
Uploaded: 2018-10-23T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Primary Mouse Hepatocytes for Nascent Protein Synthesis Analysis by Non-radioactive L-azidohomoalanine Labeling Method at JoVE.com

Vi takker Dr. Joonbae Seo og Vivian Hwa for sine vitenskapelige inngang og diskusjon. Dette arbeidet ble støttet av National Institute of Health (NIH) (R01DK107530). T.N. ble støttet av VIPs fra Japan vitenskap og teknologi byrå. En del av denne studien ble støttet av et stipend fra NIH (P30DK078392) for fordøyelses sykdommer forskning Core Center i Cincinnati.

Denne protokollen inneholder bruk av laboratoriet mus. Dyr omsorg og eksperimentelle prosedyrer ble utført i henhold til prosedyrer godkjent av dyr omsorg komiteer av Cincinnati Children Hospital Medical Center.
1. isolering hepatocytes hovedknappen på musen
<ol><li>Pre isolasjon forberedelser<ol>
<li>Forberede 450 mL 40% tetthet gradert bufferen som beskrevet i tabell 1 og holde på 4 ° C (15 mL/mus).</li>
		<li>Forberede 500 mL Williams' Medium som beskrevet i t...

Selv om flere udødeliggjort hepatic cellelinjer har vært foreslått og brukes til å undersøke leveren fungerer49,50,51,52, mangler disse cellene generelt viktig og grunnleggende funksjoner hepatocytes normal, som uttrykk for albumin (Figur 3). Det er allment kjent, derfor at utnytte primære hepatocytter er en verdifull mulighet for å undersøke leveren fysiol...

Protein er viktig ernæringsmessige og ca 50% av tørrvekt av en menneskekropp består av proteiner som har flere biologiske egenskaper og funksjoner1. Derfor proteinsyntese er en av de mest energi forbruker hendelsene og endring i protein metabolismen er svært knyttet til utviklingen av sykdommer, inkludert metabolske sykdommer2,3,4. I leveren, protein biosyntesen utgjør ca 20-30% av totale energi forbruk5,6. I tillegg proteiner funksjonen som ikke bare passiv eller byggesteinene i leveren, men også aktiv signal-formidling faktorer intracellulært eller extracellularly å regulere systemisk metabolisme7. For eksempel, reduserte nivåer av serum albumin, som syntetiseres og skilles ut av leveren og mest rikelig protein i plasma8, øker risikoen for type 2 diabetes utvikling9,10, 11, hvor en høyere konsentrasjon av serum albumin er beskyttende mot utvikler Metabolsk syndrom12. Videre kan forstyrret eller forstyrrelse av sekretoriske eller membran-bundet hepatic proteiner, som modulerer kolesterol homeostase, inkludert lipoproteiner, LDLR og LRP1, føre til utviklingen av insulinresistens, hyperlipidemi eller åreforkalkning 13. derfor identifikasjon av molekylære patofysiologiske mekanismer som er involvert i protein metabolisme forstyrrelser i leveren og dens tilknyttede metabolske komplikasjoner kan være nyttig for å oppdage romanen farmakologiske tilnærminger for å retard utbruddet eller behandle metabolske sykdommer som diabetes og insulinresistens, og alkoholfrie fettlever.
Proteinsyntese er tett knyttet til statusen celleenergien (f.eksdannelsen av en peptid obligasjon under forlengelse trinn i proteinsyntese krever 4 phosphodiester obligasjoner14) og er regulert av molekylære trasé som forstand Inter - og intra - cellular næringsstoffer tilgjengelighet15,16. AMP-aktivert protein kinase (AMPK) er en av intracellulær energi sensorer som vedlikeholder energi homeostase17. Når AMPK er aktivert når cellular energi nivåer blir lavere, fungerer AMPK og sin målrettede underlag for å stimulere katabolske veier og hemme anabole prosesser inkludert protein syntese18,19. Regulering av proteinsyntese er formidlet av fosforylering flere oversettelse faktorer og ribosomal proteiner20. Legg merke er til pattedyr målet på rapamycin komplekse 1 (mTORC1), en viktig drivkraft i proteinsyntese, en av de viktigste målene for AMPK21. Aktivering av den mTORC1 veien forbedrer cellevekst og spredning av stimulerende protein oversettelsen og autophagy20,21. Derfor er det logisk at aktivering av AMPK kan hemme mTORC1-mediert protein syntese22. Faktisk aktivering av AMPK motvirker og direkte phosphorylates mTORC1 på threonin rester 2446 (Thr2446) fører til inaktivering23 og undertrykkelse av protein biosyntesen24. Videre kan AMPK indirekte hemme mTORC1 funksjonen ved fosforylering og aktivering av tuberous sklerose komplekse 2 (TSC2)25 som er oppstrøms regulator av mTORC1 signalnettverk cascade. Kort sagt, feilregulering av disse i leveren er ofte knyttet til utvikling av metabolske sykdommer, og derfor er det et kritisk behov for å etablere effektive eksperimentelle verktøy for å undersøke rollen av disse i regulering av energi og protein metabolisme i hepatocytter.
Det er en sterkere likhet mellom isolerte primære hepatocytter funksjonelle egenskaper og i vivo hepatocytter enn med i vitro lever-avledet cellen linjer26,27,28. Det har vist at primære menneskelige hepatocytter deler 77% likhet med at av leveren biopsier, mens HepG2 celler, som er godt differensiert hepatic kreftceller og brukte å undersøke hepatic funksjoner, vise mindre enn 48% i sammenheng med genuttrykk profiler29. Derfor utnyttelse av primære hepatocytter, i stedet for udødeliggjort kultur celler, er av avgjørende betydning i å undersøke nedsatt funksjon og fysiologi, og flere protokoller er tilgjengelig for isolasjon og kultur primære hepatocytes spesielt fra rotter30,31. Mens rotte hepatocytter er nyttig med en relativt høyere avkastning av celler, har musen hepatocytter større potensial i mange vitenskapelige aspekter på grunn av den bredt tilgjengeligheten av genetisk modulert mus. Det er imidlertid flere tekniske utfordringer i isolere sunn og rikelig primære hepatocytter fra mus for mobilnettet og molekylære-baserte vurderinger: først kanyle innsetting å perfuse leveren med buffer reagenser er svært vanskelig å håndtere på grunn av små og tynne mus portalen blodåre eller mindreverdig vena cava; andre kan gangen for lengre manipulasjon av celler under isolasjon forårsake reduksjon i cellen kvantitet og kvalitet; tredje, ikke-enzymatisk mekanisk separasjon metoder kan føre til alvorlige skader og produsere en lav avkastning levedyktig isolert primære hepatocytter32,33. I 1980, ble collagenase perfusjon teknikken introdusert for å isolere hepatocytter fra lever av dyr34. Denne metoden er basert på collagenase perfusjon av leveren35,36,37, tilførsel av leveren med kalsium chelator løsning38,39, enzymatisk fordøyelsen og mekanisk dissosiasjon hepatic parenchyma35. I det første trinnet, er en mus lever parfyme med en kalsium [Ca2 +] gratis buffer inneholder en [Ca2 +] chelator (ethylenediamine tetraacetic acid, EDTA). I det andre trinnet er musen leveren parfyme med en collagenase inneholder buffer hydrolyze mobil-ekstracellulær matrix interaksjoner. I motsetning til bufferen i trinn én, tilstedeværelsen av [Ca2 +] ioner i bufferen i det andre trinnet er nødvendig for effektiv collagenase aktivitet, hvoretter fordøyd leveren har mer forsiktig og mekanisk skilles ved hjelp av pinsett mellom de hepatic capsule og parenchymatous vev. Til slutt, bindevev fjernes ved filtrering, og påfølgende sentrifugering skiller levedyktig hepatocytter fra både ikke-parenchymal celler og ikke-levende hepatocyte med bruk av tetthet gradert buffer40,41 ,42. Studien viser vi en endret i two-step collagenase perfusjon teknikk å isolere primære hepatocytter fra en mus lever for analyse av proteinsyntese.
Radiolabeling av proteiner er mye brukt å kvantifisere uttrykk nivåene, Omsetningshastigheten, og biologiske fordelingen av proteiner43 på grunn av høy følsomheten av deteksjon av radioaktivitet44. Imidlertid krever bruk av isotopene kontrollerte forskning omstendigheter og prosedyrer45. Alternative ikke radioaktiv metoder har blitt utviklet og fått stadig i popularitet. Chemo-selektiv ligation reaksjon med en Tetramethylrhodamine (TAMRA) protein gjenkjennings-metoden er en av dem og er basert på chemo-selektiv reaksjonen mellom en azide og alkyne grupper46, som kan benyttes til å analysere mobilnettet hendelser som registrere begynnende proteinsyntese og underklasser av glykoproteiner endret med en azide gruppe. For begynnende proteinsyntese, kan L-Azidohomoalanine (L-AHA, en azide-modifisert aminosyre) metabolically innlemmet i proteiner og oppdaget ved hjelp av TAMRA proteinet oppdagelsen metoden47. Ved hjelp av denne analysen i hovedknappen på musen hepatocytter, viser vi at den gryende protein syntese rate er tett knyttet til tilgjengeligheten av ATP fra Mitokondrielt og AMPK Aktivisering (figur 1).
Oppsummert utnyttelse hepatocytes hovedknappen på musen er avgjørende for å undersøke den protein og energi metabolismen og kvantifisere begynnende proteinsyntese er verdifull for å få innsikt i fysiologiske rollen av relevant til utviklingen og kur av hepatocyte-relaterte sykdommer.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>HEPES buffer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP310-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D16-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene glycol-bis(&#946;-aminoethyl ether)-tetraacetic acid</td>
			<td>AmericanBio</td>
			<td>AB00505-00025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS (10X) no calcium, magnesium, phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14185-052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride Dihydrate (CaCl2.2H2O)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C79-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Density gradient buffer</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0891-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium) low glucose, pyruvate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11885-084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30910.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS) (1X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>1897141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Williams medium E, no glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12551-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-alanyl-L-glutamine dipeptide supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type X</td>
			<td>Wako Pure Chemical Industries</td>
			<td>039-17864</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion pump</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>Masterflex L/S</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IV administration set</td>
			<td>EXELINT</td>
			<td>29081</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A water bath</td>
			<td>REVSCI</td>
			<td>RS-PB-200</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube heater</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Isotemp</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Decon Lab, Inc</td>
			<td>0-39613</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>PHOENIX</td>
			<td>10250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclaved Cotton Tips</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>23-400-124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm Petri Dish</td>
			<td>TPP</td>
			<td>93100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Connector (Male Luer Lock Ring)</td>
			<td>Cole-Parmer instrument</td>
			<td>EW-4551807</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24G catheters</td>
			<td>TERUMO</td>
			<td>Surflo 24Gx3/4&#39;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#956;m Filter (CELL STRAINERS)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10199-658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml conical-bottom centrifuge tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89039-666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml conical-bottom centrifuge tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89039-658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemoselective ligation reaction PROTEIN ANALYSIS DETECTION KIT, TAMRA ALKYNE</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C33370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AHA (L-azidohomoalanine)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (methionine free)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21013024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Cystine Dihydrochloride</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>C2526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laemmli sample buffer</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>161-0737</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>P9599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS solution (20%)</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>161-0418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCL (1M)</td>
			<td>American Bioanalytical</td>
			<td>AB14044-01000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatase Inhibitor Cocktail</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>P5726</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein concentration measuring Kit (Bovin Serum Albumin-BSA)</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>500-0207</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well tissue culture plate</td>
			<td>TPP</td>
			<td>92006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Heatblock</td>
			<td>VWR</td>
			<td>12621-092</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-Rotator</td>
			<td>Grant-bio</td>
			<td>PTR-60</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic Sonicator</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>GE130PB</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Heavy-Duty Vortex Mixer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97043-566</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A variable mode laser scanner</td>
			<td>GE Healthcare Life Science</td>
			<td>FLA 9500</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie-dye reagent</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>24594</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>CKX53</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Western Blotting apparatus</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1658004</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5424R</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated cell counter</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>TC20</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluorChem R system</td>
			<td>proteinsimple</td>
			<td>-</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-Ampka (T172) antibody</td>
			<td>Cell signaling</td>
			<td>2535</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Total-AMPK antibody</td>
			<td>Cell signaling</td>
			<td>5832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin antibody</td>
			<td>Cell signaling</td>
			<td>4929</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>beta actin antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-130656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine scissors and forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of primary mouse hepatocytes for nascent protein synthesis analysis by non-radioactive l-azidohomoalanine labeling method

Hepatocytter er parenchymal celler i leveren og engasjere flere metabolske funksjoner, inkludert syntese og sekresjon av proteiner viktig for systemisk energi homeostase. Primære hepatocytter isolert fra murine leveren utgjør et verdifullt biologiske verktøy for å forstå funksjonelle egenskaper eller endringer forekommer i leveren. Her vi beskriver en metode for isolasjon og kultur hepatocytes hovedknappen på musen ved å utføre en totrinns collagenase perfusjon teknikk og diskutere utnyttelse for å undersøke protein metabolisme. Leveren av en voksen mus er sekvensielt parfyme med etylenglykol-bis tetraacetic syre (EGTA) og collagenase, etterfulgt av isolering av hepatocytter med tetthet gradert bufferen. Disse isolerte hepatocytter er levedyktig på kultur plater og opprettholde fleste utstyrt egenskaper hepatocytes. Disse hepatocytter kan brukes for vurderinger av protein metabolisme inkludert begynnende proteinsyntese med ikke-radioaktivt reagenser. Vi viser at de isolerte hepatocytter er lett kontrollert og utgjør en høyere kvalitet og volum stabilitet i proteinsyntese knyttet til energi metabolism ved å benytte chemo-selektiv ligation reaksjon med et Tetramethylrhodamine (TAMRA) protein oppdagelse metode og vestlige blotting analyser. Denne metoden er derfor verdifulle for å undersøke hepatic begynnende proteinsyntese knyttet til energi homeostase. Følgende protokollen skisserer materialer og metoder for isolering av høy kvalitet hovedknappen på musen hepatocytter og påvisning av begynnende proteinsyntese.

Hovedknappen på musen hepatocytter isolasjon resulterer i en ytelse på ca 20 x 106 totalt celler/mus. Histologisk, live og festet primære hepatocytter vises mangekantet eller typiske Sekskantet i form med tydelig beskrevet membranous grensen etter 24-timers inkubasjon (figur 2).
For å bekrefte om isolerte celler er primære hepatocytter, sammenlignet vi uttrykk nivåer av albumin prot...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Primary Mouse Hepatocytes for Nascent Protein Synthesis Analysis by Non-radioactive L-azidohomoalanine Labeling Method at JoVE.com

Isolation of Primary Mouse Hepatocytes for Nascent Protein Synthesis Analysis by Non-radioactive L-azidohomoalanine Labeling Method

Isolasjon hepatocytes hovedknappen på musen for begynnende Protein syntese analyse av ikke-radioaktivt L-azidohomoalanine merking metoden

Her presenterer vi en protokoll for isolasjon hepatocytes sunn og funksjonelle hovedknappen på musen. Instruksjoner for å oppdage hepatic begynnende proteinsyntese av ikke-radioaktivt merking underlaget ble gitt til å forstå mekanismene bak proteinsyntese i sammenheng med energi-metabolisme homeostase i leveren.

Hepatocytes are parenchymal cells of the liver and engage multiple metabolic functions, including synthesis and secretion of proteins essential for ...

Denne metoden kan bidra til å svare på viktige spørsmål i ulike metabolske sykdommer forskningsfelt om molekylære endringer av leverenergi og protein biosyntese i fedme, alkoholfri fettlever, og type to diabetes. De viktigste fordelene med denne teknikken er at det letter isolering av funksjonelle primære mus hepatocytter og deteksjon hepatisk nascent proteiner via en ikke-radioaktiv merking substrat. Visuell demonstrasjon av denne metoden er kritisk da perfusjonstrinnet er vanskelig å lære på grunn av de små og tynne musblodkarene.For leverperfusjon, sett forsiktig inn et 24 gauge kateter i Inferior Vena Cava eller IVC bare ved bifurcation med riktig nyrevene. Fjern kateternålen som opprettholder kanylens posisjon i IVC og koble en 24 gauge kanyle med perfusjonsrør ved hjelp av kontakten. Begynn å perfusere leveren med varm HBSS minus med en fire milliliter permanent strømningshastighet raskt kutte miltvenen for å drenere ut det indre blodet.Etter 10 minutter, perfuse museleveren med 35 milliliter HBSS pluss supplert med Collagenase Type X med en strømningshastighet på fire milliliter per minutt, klemme miltven i ca 10 sekunder noen få minutter for å lette fordelingen av perfusate gjennom hele leveren. Når alle kollagennase har blitt perfused, overføre leveren til et laboratorievev før du stopper pumpen for å unngå blod tilbakestrømning i leveren. Bruk tang for å fjerne galleblæren og tørk forsiktig leveren med et friskt laboratorievev for å fjerne blod.Legg leveren i en 100 millimeter petriskål som inneholder fem milliliter frisk varm HBSS pluss supplert med Collagenase og bruk stray-tipped tang for å forsiktig fjerne leverkapselen. Bruk tangen til å forsiktig spre parenchymalt vev og tilsett 15 milliliter kald DMEM til petriskålen. Rist den revet leveren forsiktig for å frigjøre de gjenværende parenchymale cellene i mediet og legg til ytterligere 15 milliliter kald DMEM til parabolen for å skaffe resten av cellene.Deretter filtrerer vevsslamen gjennom en 100 mikron cellesil i et 50 milliliter konisk rør på is. For å isolere primærmus hepatocytter, samle cellene ved sentrifugering og gjenbruk pellet i 10 milliliter frisk DMEM. Lag cellene forsiktig over en 40% tetthetsgradientbuffer for tetthetsgradientseparasjon, og kast cellene fra de øvre og midterste lagene etter sentrifugering.Resuspend den primære parenchymal hepatocyte pellet med to til tre milliliter av William's Medium E for å unngå å samle døde celler fra veggen av røret og overføre cellene til en ny 50 milliliter tube. Bland cellene med ytterligere syv til åtte milliliter av William's E Medium før sentrifugering og resuspend pellet i 10, 20 eller 30 milliliter av friske William's Medium E avhengig av størrelsen på pellet. Etter telling, frø seks ganger 10 til de femte cellene til hver brønn av en seks-brønns plate for en to til tre timers inkubasjon ved 37 grader Celsius.På slutten av inkubasjonen, erstatt mediet med DMEM supplert med 10% Fetal Bovine Serum og anti-anti for å fjerne døde og ufestede celler og returnere cellene til inkubatoren over natten. For azidmodifisert nascent protein merking, tilsett 20 til 40 mikrogram cellelylat til 50 mikroliter av 2X reaksjonsbuffer. Bring volumet til 80 mikroliter med destillert deionisert vann og vortex proteinløsningen i fem sekunder.Tilsett fem mikroliter kobbersulfat til cellene for ytterligere fem-sekunders virvel, etterfulgt av fem mikroliter reaksjonsbuffer additiv en med fem sekunder med vortexing. Etter en tre minutters inkubasjon, legg til 10 mikroliter rekonstituert reaksjonsbuffer additiv to til cellene for ytterligere fem-sekunders virvel og roter prøven i 20 minutter ved fire grader Celsius på en multi-rotator maskin beskyttet mot lys. På slutten av rotasjonen legger du til 300 mikroliter metanol til lysatet, etterfulgt av 75 mikroliter kloroform og 200 mikroliter dobbeltdestiller med dobbelt destillert vann.Samle merket protein ved sentrifugering og tilsett 250 mikroliter frisk metanol til pellet. Etter vortexing, sentrifuge lysatet igjen og dekke den nakne pellet med en lo-fri vev i 15 minutter ved romtemperatur. For PAGE analyse, solubilize tørket pellet i 20 mikroliter av lasting buffer uten beta-mercaptoethanol og vortex pellet i 10 minutter.Deretter varmer proteinet i en 70 graders Celsius varmeblokk i 10 minutter og laster prøven på en 10% natrium dodecylsulfatgel for tetrametylrhodamindeteksjon. Bruk deretter en laserskanner i variabel modus for nøyaktig mengde av de AHA-merkede gryende proteinene. Histologisk, levende og vedlagte primære hepatocytter vises typisk polygonale eller sekskantede i form med en tydelig skissert membranøs grense etter 24 timers kultur.For å bekrefte om de isolerte cellene er primære hepatocytter, i dette eksperimentet ble albuminproteinuttrykksnivåer sammenlignet i mus embryonale fibroblaster, en mus hepatoma cellelinje, isolerte primære mus hepatocytter, og mus lever. Albuminproteinuttrykket ble oppdaget i primærmus hepatocytter og muselever, men var ikke påviselig i enten mus embryonale fibroblaster eller hepatoma cellelinjeceller. Primær hepatocyttbehandling med 10 mikromolar Rotenone i fire til seks timer viste en robust induksjon av lever AMP-aktivert protein kinase som påvist ved økte fosforyleringsnivåer på lever AMP-aktivert protein kinase T172 lik de som er observert i vivo.Faktisk hadde fem timer med 10 mikromolar Rotenone-behandling dype hemmende effekter på gryende proteinsyntese i behandlede primære hepatocytter sammenlignet med ubehandlede kontrollceller som demonstrert ved en kjemoselectiv ligasjonsreaksjonsanalyse. Mens du prøver denne prosedyren, er det viktig å huske å forberede alle nødvendige reagenser og medier på forhånd. Denne teknikken banet vei for forskeren innen lever metabolsk patofysiologi for å utforske den molekylære mekanismen for energiproteinregulering i fedme og type to diabetes i isolert primærmus hepatocytt.

Research

JoVE Journal

Medicine

A Model of Disturbed Flow-Induced Atherosclerosis in Mouse Carotid Artery by Partial Ligation and a Simple Method of RNA Isolation from Carotid Endothelium

Despite the well-known close association, direct evidence linking disturbed flow to atherogenesis has been lacking. We have recently used a modified ...

In vitro Organoid Culture of Primary Mouse Colon Tumors

In vitro Organoid Culture of Primary Mouse Colon Tumors

In vitro Organoid Culture of Primary Mouse colontumorer

Several  human and murine colon cancer cell lines have been established, physiologic  integrity of colon tumors such as multiple cell layers, basal-apical ...

Coculture Analysis of Extracellular Protein Interactions Affecting Insulin Secretion by Pancreatic Beta Cells

Coculture Analyse av Ekstracellulære protein interaksjoner som påvirker insulinsekresjon ved betaceller i bukspyttkjertelen

Interactions between cell-surface proteins help coordinate the function of neighboring cells. Pancreatic beta cells are clustered together within ...

A Modified Method for Heterotopic Mouse Heart Transplantion

En modifisert metode for Heterotop Mouse Hjerte Transplantion

Mice are often used as heart transplant donors and recipients in studies of transplant immunology due to the wide range of transgenic mice and reagents ...

Method for Obtaining Primary Ovarian Cancer Cells From Solid Specimens

Metode for Innhenting av primær eggstokkreft celler fra solide Prøver

Reliable tools for investigating ovarian cancer initiation and progression are urgently needed. While the use of ovarian cancer cell lines remains a ...

Isolation and Culture of Primary Endothelial Cells from Canine Arteries and Veins

Isolasjon og Culture of Primary endotelceller fra Canine arterier og vener

Cardiovascular disease is studied in both human and veterinary medicine. Endothelial cells have been used extensively as an in vitro model to study ...

Fluorescent Dye Labeling of Erythrocytes and Leukocytes for Studying the Flow Dynamics in Mouse Retinal Circulation

Fluorescerende fargemerking av erytrocytter og leukocytter for å studere strømdynamikken i musens retinalsirkulasjon

The retinal and choroidal blood flow dynamics may provide insight into the pathophysiology and sequelae of various ocular diseases, such as glaucoma, ...

Lentiviral Vector-mediated Gene Therapy of Hepatocytes Ex Vivo for Autologous Transplantation in Swine

Lentiviral Vector-mediated Gene Therapy of Hepatocytes Ex Vivo for Autologous Transplantation in Swine

Lentiviral Vector-mediert genterapi av hepatocytter Ex Vivo for autolog transplantasjon i svin

Gene therapy is an ideal choice to cure many inborn errors of metabolism of the liver. Ex-vivo, lentiviral vectors have been used successfully in the ...

Ultrasonic-augmented Primary Adult Fibroblast Isolation

Ultralyd-utvidet primær voksen Fibroblast Isolation

Primary adult fibroblasts have become an important tool to study fibrosis, fibroblast interactions and inflammation in all body tissues. Since primary ...

A Non-Invasive Method for Generating the Cyclic Loading-Induced Intra-Articular Cartilage Lesion Model of the Rat Knee

En ikke-invasiv metode for å generere den sykliske belastningsinduserte intraartikulære brusklesjonsmodellen til rottekneet

The pathophysiology of primary osteoarthritis (OA) remains unclear. However, a specific subclassification of OA in relatively younger age groups is likely ...