Name: an anaerobic biosensor assay for the detection of mercury and cadmium
Uploaded: 2018-12-17T13:00:00
Duration: 9 min 33 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Anaerobic Biosensor Assay for the Detection of Mercury and Cadmium at JoVE.com

ونود أن أشكر التعليقات من المراجعين المجهولين اثنين كأعضاء جيدا في مختبر بولان لمناقشة الثاقبة في تطوير بيوسينسور اللاهوائية. جائزة الباحث المبكر من مقاطعة أونتاريو ومنحة الاكتشاف وتكملة مسرع من العلوم الطبيعية ومجلس البحوث الهندسية في كندا إلى A.J.P. بتمويل هذه الدراسة.

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

أجهزة استشعار العوامل البيولوجية الميكروبية هي أدوات مفيدة لتحديد الآليات التي تتفاعل الفلزات مع الميكروبات. هنا، يمكننا وصف أسلوب التي يمكن قياس لاهوائيا Hg التوافر البيولوجيالثاني الثاني ومؤتمر نزع السلاح إلى الخلية المضيفة الغرام (كولاي) وتعطي نتيجة قابلة للقياس في غضون ساعات قليلة. واحدة من نقاط القوة الرئيسية في هذا البروتوكول هو أنه يتيح مراقبة واسعة النطاق من المعادن انتواع في الأجلين المتوسط والتعرض عن طريق تجنب يغاندس ملزمة قوية أو المكونات التي قد تؤدي إلى هطول الأمطار معدنية. تم على غرار انتواع معدنية واختبارها في هذا التعرض المتوسطة استخدام فريقك17، لكن قد يتم نشر البرمجيات انتواع معدنية أخرى. في حالة لا يغاندس المضافة، زئبق انتواع من المتوقع أن تكون موجودة ك Hg(OH) 97%2 و 3% زئبق (NH3)22 +، بينما سيكون انتواع القرص المضغوط حاليا ك 59% مؤتمر نزع السلاح--β-جليسيروفوسفاتي و 25% Cd2 +و 16% كدسو4. استخدام برمجيات نمذجة الحرارية بسيطة، يمكن للمستخدم تصميم وسائط التعرض واختبار للتوافر البيولوجي المعادن ذات الأهمية. وبالإضافة إلى ذلك، الخلية المضيف بيوسينسور (NEB5αكولاي ) قابلة للتطبيق على طائفة واسعة من الأس الهيدروجيني (5-8.5) وتركيز كلوريد الصوديوم (0-0.55 م)17.
مثلايشن Hg عملية اللاهوائية، وليس لديه البروتوكول الواردة في هذه الدراسة الحاجة إلى الأوكسجين، مما يسمح لوصف أكثر دقة الأيض اللاهوائي في التوافر البيولوجي معدنية. وهذا مهم لأن وجود الأكسجين يغير الجينات التعبير الملامح48،49 ومن ثم إمكانات النقل مسارات؛ ولذلك يقدم هذا الأسلوب ميزة على exising حاليا بدائل الهوائية. يمكن أن تستخدم في بناء بيوسينسينج المقدمة هنا مع المضيفين اللاهوائية الأخرى التي قد تكون أكثر أهمية للزئبق مثلايشن (مثلاً، جيوباكتير، ديسولفوفيبريو)، ولكن ربما أقل أصعب من كولاي. واحد الحد الحالي للنهج الذي قدم هنا أن لدينا حد الكشف لم يبلغ بعد المستويات بعد الظهر، خلافا للأنظمة الهوائية الموجودة4،19،37. هو مع ذلك من المهم الإشارة إلى أنه من أجل تحقيق هذه الحدود الكشف عن انخفاض العديد من الخطوات الواجب اتخاذها44: أنا) إضافة يجند مطلوب لضمان أن الزئبق يبقى في حل ولا الجسميات على جدار الخلية الجرثومية (Hg سوف تكون محددة لا رجعة فيها إلى الخلية ثيولس السطحية منع عن التوافر الأحيائي25،27؛ انظر الرد عتبة للزئبق في الشكل 3 ألف)، ثانيا) تعديلات على كثافة الخلية، أو الثالث) تعديل بنية الوراثية تشمل بروتينات النقل مير-مشغل (هي merT وميرب)، وتزايد Hg التمويه داخل الخلية50،51. هذه التعديلات ستكون مفيدة في الكشف عن تركيزات منخفضة من الزئبق، ولكن ليس بالضرورة مثاليا عند تقييم الحالات ذات الصلة بيئياً. بينما أجهزة استشعار العوامل البيولوجية الكادميوم السابقة موجودة أساسا كدليل "من حيث المبدأ"، تم تصميمها في وسائل الإعلام المعقدة التي لا تسمح للمحقق لتقييم دور انتواع في التوافر البيولوجي41،42، 43 , 44.
بيوسينسور هو أداة مفيدة بشكل لا يصدق في تحديد الآليات التي الأنواع المعدنية أحيائياً. لأن الكائن الحي المضيف ليس زئبق-ميثيلاتور، قد فقط استخدامه لوضع نموذج لكيفية قد أدخل Hg بكتيريا سلبية الغرام ولا أساس منطقي نهائي لكيفية اكتساب ميثيلاتورس Hg Hg. وتوجد أساليب أخرى لتحديد التوافر البيولوجي الزئبق، مثل مثلايشن، كنتيجة لامتصاص أو استخدام التوازن الكتلي نهج10،15،20،،من4546. ومع ذلك، الطريقة المعروضة هنا يقدم في الاستفادة من الوقت الحقيقي شبه التوافر البيولوجي البيانات في خلايا قابلة للحياة. لا نوصي بأن استخدام هذا الأسلوب لقياس مجموع مستويات الزئبق أو القرص المضغوط في مصفوفة بيئية. تتوفر العديد من الأساليب القياسية متاحة بسهولة أكبر على الرغم من استخدام أجهزة استشعار العوامل البيولوجية لتحديد تركيزات المعادن في البيئة36المقترحة، مثل برنامج المقارنات الدولية--مرض التصلب العصبي المتعدد، FAAS (لتحليل القرص المضغوط) أو بخار الباردة مطيافية الامتصاص الذري (لنيافة تحليل). بيوسينسور مع ذلك يمكن استخدامها لتحديد ما إذا كان مصفوفة بيئية معينة يمكن أن تعزز أو تعرقل التوافر الأحيائي؛ ويتحقق ذلك عن طريق إجراء الإضافات القياسية.
الرقم الهيدروجيني للتعرض لوسائل الإعلام قد يكون تغيير إلى أي مكان داخل نطاق 5 و 8-5، شريطة أن يتم تبادل حمض والمماسح الحرة (المخزن) مع حمض حرة بديلة من المخزن المؤقت مع pKa المناسبة (انظر قائمة مخازن مناسبة (فيريرا et al. (2015) 47) وتعديلها مع كوه على درجة الحموضة المناسبة عند اتخاذ التعرض لوسائل الإعلام. وبالإضافة إلى ذلك، الأسلوب لا يقتصر على الزئبق، ومؤتمر نزع السلاح، ولكن يمكن أن تمتد إلى المعادن الأخرى استخدام المنظمين النسخ الأخرى.
قد يتم تعديل المقايسة التعرض لاستكشاف تأثير متقبلون الإلكترون الأخرى مثل س2 وفيوماريت عن التوافر الأحيائي زئبق أو القرص المضغوط. إجراء تعديلات طفيفة على طريقة لاستخدام كل من س2 وفيوماريت متقبلون إلكترون متوفرة عند الطلب.
وخلاصة القول أننا نود أن نؤكد على النقاط التالية: أنا) من المحتم أن تركيزات الأرصدة Cd أو زئبق معروفة في الخطوة 2، كما سوف تستخدم هذه لمعايرة في بيوسينسور. الثاني) اليوم التعرض، يجب أن يتوقف نمو الخلايا التطوير التنظيمي من 0.6 (± 0.1)600 وأن الحرص عند ريسوسبيندينج الثقافات الخلية، كما بيوسينسور معايرة كثافة هذه الخلية. الثالث) وأخيراً، من المهم بذل المتوسطة التعرض دقة التعرض في اليوم. لضمان نجاح البروتوكول، ينبغي أن تزرع ثقافات متعددة في وقت واحد (للالتفاف حول إمكانية فشل النمو) وينبغي مجدد المتوسطة النمو الأسبوعية (للتحايل metastability لوسائل الإعلام والتلوث المحتمل). كما تجدر الإشارة إلى أن replicates البيولوجية (متعددة الثقافات الخلية) تعبر عن التغير عندما يتعلق الأمر بإشارة الإنتاج. على الرغم من أن الردود الفلورية قد تختلف من ثقافة إلى ثقافة، ينبغي أن تظل الاتجاهات الفلورسنت ردا على متغير معطى نفسه طوال replicates البيولوجية العديدة.

الزئبق (Hg) ملوثاً عالمياً وعلى التوافر البيولوجي لنيافة ميثيلاتينج الميكروبات هو الخطوة الأولى نحو التضخم الأحيائي لها من خلال الشبكات الغذائية والآثار السمية العصبية في الإنسان والحياة البرية1. ويعتقد حاليا أن مثلايشن Hg الميكروبية هي عملية داخل الخلايا التي تتطلب: ط) نوعا الزئبق يكون متوافراً بيولوجيا2،،من34،،من56،7 والثاني) للخلية لتكون قادرة على الناحية الفسيولوجية ميثيلاتينج Hg8،،من910. الكادميوم (Cd) تتراكم أحيائياً في الكائنات الحية، ولكن لا لا يتضخم أحيائياً في فودويبس، ويستخدم على نطاق واسع في العمليات الصناعية والتجارية التي تسبب التعرض الحاد يشيع في الناس و البيئة11. على الرغم من أن الميكروبات أدواراً رئيسية عدة في مصير الزئبق في البيئة، تركز معظم الدراسات على القرص المضغوط الكيمياء الجيولوجية وعلم السموم الإيكولوجية على حقيقيات النوى الميكروبية12. استهلاك المحاصيل الزراعية (مثل الأرز) هو المصدر الرئيسي للتعرض المباشر للكادميوم؛ في هذه الحالة، التوافر الأحيائي لمؤتمر نزع السلاح للميكروبات رهيزوسفيري يؤثر تأثيراً مباشرا المبلغ النباتات يمكن أن تتراكم13.
مسارات النقل Hg معقدة، وربما تنطوي نقل نشط خطوة14. عندما يتعلق الأمر نقل، العمل الأخيرة واقترح أن يستخدم الزئبقالثاني الزنكالثاني أو Mnالثاني الناقل7،15،،من1617. بينما القرص المضغوطالثاني هو الافتراض بنقلها بطريق الخطأ في سيتوسول من خلال مسارات النقل معدنية ديفالينت (لا سيما Mnالثاني أو الزنكالثاني)، نقل الآليات من القرص المضغوطالثاني داخل الخلايا تظل ممر النقل المضاربة، ولا مؤتمر نزع السلاح الخاصة قد حددت13،18. بغض النظر عن طبيعة الناقلين المشاركة، تحديد ثلاثة عوامل ميكانيكية في نهاية المطاف قدرة المعادن على إدخال خلية: ط) انتواع معدنية في الحل2،،من615، 16 , 17 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23، ثانيا) خصائص بيوفيسيوتشيميكال غشاء الخلية17،24،25،،من2627،28،29 ،،من3031، وثالثاً) القدرة على المعدن الوصول إلى موقع نقل7،32. مؤتمر نزع السلاح، والزئبق من غير المحتمل أن يوجد أيونات حرة تحت الشروط ذات الصلة فسيولوجيا الميكروبات بسبب ما تقارب عالية لحله العضوية هذه المسألة (DOM)، خالب الملوثات (مثل، يدتا)، أو تخفيض الكبريت مويتيس33، ،من 3435 (القرص المضغوطالثاني يمكن أن توجد حرة أيون أو شكل أيون-أزواج في غياب هذه يغاندس). وهناك نقص في أساليب فعالة في تحديد كيفية هذه الأنواع المعدنية أحيائياً في ظروف ذات صلة بمصيرهم في البيئة. على سبيل المثال، زئبق هو ميثليته تحت الظروف اللاهوائية14، والكادميوم والزئبق المعادن اللينة (أو فئة ب الكاتيونات)، التي تتطلب أن بهم انتواع التحقيق في الظروف التي تحافظ على سلامة المجموعات تخفيض الكبريت.
أجهزة استشعار العوامل البيولوجية الميكروبية هي الخلايا البكتيرية التي تنبعث منها إشارة قابلة للقياس في استجابة لتركيزات المعادن، في هذه الحالة زئبق أو القرص المضغوط داخل الخلايا. على هذا النحو، وأدوات مثالية لفهم كيفية إدخال المعادن خلية36، شريطة أن يتم التحكم بعناية في ظروف التعرض ل. أجهزة استشعار العوامل البيولوجية Hg تحتوي عادة على اندماج الجينات بين الدوائر التنظيمية مير-مشغل (بما في ذلك الجينات ترميز للجهة المنظمة للنسخ ميرس فضلا عن المشغل ومروج المناطق لمشغل)، والإبلاغ عن الجينات (مثلاً، لوكس، والتجارة والنقل، وأمريكا اللاتينية والكاريبي الجينات). عند الزئبق موجود في السيتوبلازم، فإنه سيتم ربط ميرر، أسفر عن النسخ من جينات الإبلاغ والإشارات اللاحقة إنتاج19،37. صممت أجهزة استشعار العوامل البيولوجية مؤتمر نزع السلاح المحددة عادة استخدام كادك، كادك أو زنتا أو زنتر ترميز النسخ المنظمين38، ولكن تجدر الإشارة إلى أن مير لها صلة أقل، ولكن قابلة للقياس الكمي لمؤتمر نزع السلاح5. بسبب تقييد الهوائية معظم استخداماً البروتينات مراسل الإنارة أو الفلورسنت، حتى الميكروبية مؤخرا أجهزة استشعار العوامل البيولوجية ما زال غير قادر على تقديم رؤى في التحول الأحيائي للمعادن في ظروف وصول. وهذا يجعل الكشف عن المعادن التوافر البيولوجي اللاهوائي صعبة جداً أكثر من مجموعة من الظروف ذات الصلة لمصيرهم البيئية، على وجه التحديد حضور الأكسدة يغاندس حساسة (مثل كبريتيد وثيولس)4، 5 , 39.
للتخفيف من وطأة العيش عقبة المنهجية التصوير في غياب الأكسجين، دريبير et al. (2007) قد وضعت بروتين فلوري المستندة إلى فلافين (فبفب)، استناداً إلى مجال الجهد الأكسجين الخفيفة من البروتين SB2 من P. putida. هذا البروتين الأسرة غير قادرة على فلوريس في غياب الأوكسجين40. بناء على عمل دريبير et al., لدينا مختبر تصميم بيوسينسور اللاهوائية السماح لدراسة التوافر البيولوجي Hg ظروف أوضاع مؤكسدة ووصول وعلى نطاق واسع من الملوحة 17. في هذه الورقة، ونحن تصف كيفية إعداد واستخدام في بيوسينسور لاختبار تأثير المتغيرات البيئية على التوافر البيولوجي زئبق أو القرص المضغوط. على الرغم من وضعنا في بيوسينسور لنيافةثانيا، لقد اخترنا القيام بتجارب مع القرص المضغوطالثاني كوسيلة استرعاء انتباه القارئ إلى حقيقة أن هذه الأجهزة قد تستجيب أيضا لعدة عوامل الإجهاد التي من المحتمل أن تحدث المشاركة في البيئة مصفوفات؛ وفي هذه الحالة كان التحقيق القرص المضغوطالثاني لأنه من المعروف أن ربط الهيئة التنظيمية النسخي ميرر5. هنا، نعرض المعايرة الممثل ونطاقات الخطية الفنية فيما يتعلق بأي معدن. نحن أيضا إعطاء مثال عندما تكون النتائج بيوسينسور قاطعة (مغالثاني و Mnالثاني عن التوافر الأحيائي Hg) وغير حاسمة (الزنكالثاني عن التوافر الأحيائي Hg).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>7 ml standard vial, rounded interior</td>
			<td>Delta Scientific</td>
			<td>200-007-20</td>
			<td>34 recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vial tray, 21 mm openings</td>
			<td>Delta Scientific</td>
			<td>730-2001</td>
			<td>4 for (4 x 8 grid)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 mm Closure</td>
			<td>Delta Scientific</td>
			<td>600-024-01</td>
			<td>32 recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LID CORNER NOTCH BLK STR CS/50</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Corning 3931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 96- well clear-bottom nonbinding surface microplate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Corning 3651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anaerobic Chamber (glovebox)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>The air in the anaerobic chamber should be (97 % N2 &#177; 2 % and 3 % H2 &#177; 2 %)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Palladium catalyst</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Converts O2 to H2O in the anaerobic chamber. Not required but recommended.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>450 (&#177;10) nM filter for the microplate reader</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 (&#177;10) nM filter for the microplate reader</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anaerobic culture vial (balch tubes) + rubber stoppers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Modified for anaerobic culture tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MA-3000 (mercury analyzer)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH probe</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any pH probe will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical sterile polypropylene centrifuge tubes.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m polyethersulfone syringe filter + syringe</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile/clean glass bottles</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For growth media and standards</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile/clean plastic or PTFE bottles</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For alkali solutions (NaOH/KOH)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents powders: Na2MoO4, Na2SeO4, H3BO3, NaOH, KOH, MnSO4, ZnSO4, CoCl2, NiCl2, ampicillin sodium salt, Difco M9 Minimal Salts, Glucose, MgSO4, Thiamine HCl, NaNO3, l-leucine, l-isoleucine valine, EDTA sodium salt, FeSO4, Sodium Beta-Gylcerophosphate, Mops free acid, (NH4)2SO4, Hg(NO3)2, CdCl2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Milli-Q water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Autoclaved or filter sterilized is fine.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysogeny Broth</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical grade H2SO4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an anaerobic biosensor assay for the detection of mercury and cadmium

الزئبق (Hg) التوافر البيولوجي للميكروبات خطوة أساسية للسمية Hg الأحيائي في الشبكات الغذائية. التحولات الكادميوم (Cd) والتوافر الحيوي للبكتيريا مراقبة المبلغ الذي سوف تتراكم في محاصيل الأغذية الرئيسية. التوافر البيولوجي لهذه المعادن مرهون بهم انتواع في الحل، ولكن أكثر خاصة تحت ظروف وصول فيها زئبق هو ميثليته إلى مونوميثيلميركوري السامة (لميثيل) ومؤتمر نزع السلاح لا يزال قائما في رهيزوسفيري. كامل الخلية الميكروبية أجهزة استشعار العوامل البيولوجية تعطي إشارة قابلة للقياس عند معدن يدخل في سيتوسول وبالتالي فهي أدوات مفيدة لتقييم المعادن التوافر البيولوجي. للأسف، حتى الآن كان مقيداً معظم بيوسينسينج الجهود للبيئات أوضاع مؤكسدة بسبب القدرة المحدودة للبروتينات مراسل موجود للدالة في غياب الأكسجين. في هذه الدراسة، نقدم جهودنا الرامية إلى تطوير وتحسين مقايسة biosensor كامل الخلية قادرة على أداء لاهوائيا التي يمكن الكشف عن المعادن تحت شرط وصول في الوقت شبه الحقيقي، وفي غضون ساعة. يصف لنا كيف يمكن أن تساعد بيوسينسور تقييم المتغيرات الكيميائية كيف ذات الصلة للدراجات البيئية تؤثر المعادن على التوافر البيولوجي. يشمل البروتوكول التالي أساليب (1) إعداد Hg ومعايير مؤتمر نزع السلاح في ظروف وصول، (2) إعداد بيوسينسور في غياب الأكسجين، (3) تصميم وتنفيذ تجربة لتحديد كيفية تأثير سلسلة متغير على التوافر البيولوجي زئبق أو مؤتمر نزع السلاح، و (4) لقياس وتفسير البيانات بيوسينسور. إظهار نطاقات الخطي أجهزة استشعار العوامل البيولوجية، وتقديم الأمثلة التي توضح الأسلوب القدرة على التمييز بين المعادن من التوافر البيولوجي وسمية باستخدام سلالات كل المعادن إيندوسيبلي والتأسيسي.

مرة واحدة على قمم الأسفار التي تم كمياً وفقا للخطوة 5.3، يمكن رسوم بيانية نتيجة لقمم fluorescence طبقاً لتركيز المتغيرات التي توضح كيفية تأثير هذا المتغير على التوافر البيولوجي النسبي للزئبق أو القرص المضغوط. على سبيل المثال، سوف تسفر عن منحنى المعايرة للأسفار على مدى [Hgالثاني] من الشكل 2 إيندوسيبلي البيانات المعروضة في الشكل 3 ألف. لنيافةثانيا المعايرة، إرادة منحنى دائماً تحتوي على 3 عناصر لسلالة إيندوسيبلي الزئبق؛ استجابة الحد الأدنى من حوالي 1-2 نانومتر Hgالثاني قبل إنتاج إشارة fluorescence تناسبا خطيا إلى [Hgالثاني]، مجموعة الخطي حيث 5 نانومتر Hgالثاني سوف يكون موثوق بها دائماً في وسط هذا النطاق، وهضبة فيها لم يعد ستزيد زيادة [Hgالثاني] إشارة الأسفار. أي تغيير في إنتاج إشارة عن سلالة التأسيسي يبين أن السمية من [Hgالثاني] لا يؤثر على إنتاج إشارة. القرص المضغوطالثاني في الشكل 3B، هناك دائماً المكونات 2 لسلالة إيندوسيبلي؛ مجموعة خطي فيها 200-300 نانومتر القرص المضغوطالثاني ستكون موثوق بها دائماً في وسط النطاق الخطي وهضبة. يظهر انخفاض في الأسفار إشارة مع زيادة [القرص المضغوطالثاني] أن تركيزات أعلى من القرص المضغوط سامة للخلايا، ويمكن أن يفسر انخفاض في إنتاج إيندوسيبلي fluorescence بعد الهضبة في شمال البحر الأبيض المتوسط 1000 القرص المضغوطالثاني. ولذلك، عند اختبار التوافر البيولوجي زئبق أو مؤتمر نزع السلاح فيما يتعلق بمتغير البيئة، فإننا نقترح استخدام 5 نانومتر لنيافةالثاني و 300 نانومتر لمؤتمر نزع السلاحالثاني.
في بعض الحالات، إنتاج إشارة بشكل صحيح ويعزى إلى التوافر البيولوجي زئبق أو مؤتمر نزع السلاح، ولكن في حالات أخرى، يمكن أن تتأثر إنتاج إشارة بالتباين في الدولة المضيفة خلية biosensor الفسيولوجية (مثل المعادن ذات الأهمية أو الظروف البيئية التي اختبرت السامة). في الشكل 4A، تم اختبار 5 التوافر البيولوجي Hg شمال البحر الأبيض المتوسط عبر رج الزنك (0-10 ميكرومتر). في كل زئبق إيندوسيبلي وسلالات التأسيسي، هناك انخفاض مماثل في إشارة مع زيادة تركيزات الزنك. ولذلك، لا تميز أحد عما إذا كانت الإشارة ناتج عن انخفاض التوافر البيولوجي أو نتيجة للسمية الزنك. في الشكل 4 باء وجيم 4، تم اختبار 5nM Hg التوافر البيولوجي عبر رج مغثانيا (0-10 مم) والثاني مينيسوتا (0-10 ميكرومتر). زيادة مغ انخفضت تركيزاتالثاني الثاني والمليون إشارة الأسفار من سلالة إيندوسيبلي. من ناحية أخرى، لم تظهر سلالة التأسيسي انخفاض في الأسفار مع زيادة مغ تركيزاتالثاني الثاني والمنغنيز (مغالثاني والمليونالثاني مفيدة للخلايا في إنتاج فبفب، كما يتبين من زيادة في إشارة الأسفار). وهذا يدل على أن الخلايا قابلة للبقاء والنقصان الأسفار من سلالة إيندوسيبلي Hg ناجم عن انخفاض التوافر البيولوجي Hg. هذه البيانات تؤكد كم مهم لجميع فحوصات biosensor أيضا توفير قياسات التأسيسي العام خلية اللياقة.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58324/58324fig3.jpg"> الشكل 3: النطاقات الخطي من بيوسينسور مع الزئبق والكادميوم- الأسفار أقصى تقاس الأسفار النسبية وحدات (رفو) ± الانحراف المعياري 1 المنبعثة من NEB5α كولاي إيواء pUC57merR-Pp (Hg-إيندوسيبلي) وصفحة pUC19Balch (كونستيتوتيفي) بالإضافة إلى A) Hgثانيا (0-15 نانومتر) و ب) القرص المضغوطالثاني (0-1,000 nM) تحت الظروف اللاهوائية. الأسفار بمتوسط 3 التقنية وإنشاء نسخ متماثلة في 37 ˚C. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58324/58324fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58324/58324fig4.jpg"> الشكل 4: مثال على نتيجة غير حاسمة مع الزنك ونتيجة نهائية مع المغنيسيوم والمنغنيز. الأسفار أقصى تقاس الأسفار النسبية وحدات (رفو) ± الانحراف المعياري 1 المنبعثة من NEB5α كولاي إيواء pUC57merR-Pp (Hg-إيندوسيبلي) وصفحة pUC19Balch (كونستيتوتيفي) بالإضافة إلى A) الزنكثانيا (0-10 ميكرومتر)، ب) مغثانيا (0-10 ملم)، و ج) Mnالثاني (0-10 ميكرومتر) تحت الظروف اللاهوائية. تم تعيين [Hgالثاني] إلى 5 نانومتر لكل العلاجات والأسفار وكان متوسط 3 replicates التقنية في 37 ˚C. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58324/58324fig4large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>

Watch this Scientific Journal Video about An Anaerobic Biosensor Assay for the Detection of Mercury and Cadmium at JoVE.com

An Anaerobic Biosensor Assay for the Detection of Mercury and Cadmium

نقدم هنا، وضع بروتوكول لاستخدام biosensor كامل الخلية جرثومية اللاهوائية لتقييم المتغيرات البيئية المختلفة كيف تؤثر على التوافر الحيوي للزئبق، ومؤتمر نزع السلاح للبكتيريا في بيئات وصول.

مقايسة Biosensor اللاهوائية للكشف عن الزئبق والكادميوم

Mercury (Hg) bioavailability to microbes is a key step to toxic Hg biomagnification in food webs. Cadmium (Cd) transformations and bioavailability to ...

ويمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على الأسئلة الرئيسية المتعلقة بالدراجات الكيميائية الحيوية للكادميوم والزئبق، مثل كيفية تأثير المتغيرات البيئية المختلفة على توافرها البيولوجي للبكتيريا. والميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها توفر بيانات التوافر البيولوجي شبه في الوقت الحقيقي والخلايا القابلة للحياة بغض النظر عن وجود الأكسجين. عموما سوف الأفراد الجدد لهذه الطريقة النضال لأن هناك العديد من الوقت الخطوات الحساسة التي تتطلب عناية دقيقة جدا إلى التفاصيل.إثبات الإجراء سيكون بن، طالب غراد من مختبري. وللتحضير للمقايسة، استرجع جهاز الاستشعار الحيوي الزئبقي غير القابل للتكون والمكون من مخزون التبريد ناقص 80 درجة مئوية. لوحة الخلايا على لوحات مرق ليسوجيني تحتوي على 120 ميكروغرام لكل ملليلتر من الأمبيسيلين.تنمو الثقافات لوحة في حاضنة في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها. بين 4:30 و 5 ص.m. تلقيح ثقافة في عشرة ملليلتر من LB مع الأمبيسيلين وتنمو بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية مع اهتزاز في 220 دورة في الدقيقة.في ما بين تسعة وعشرة .m. في صباح اليوم التالي جلب الثقافة وكذلك متوسطة النمو التي أعدت سابقا في غرفة اللاهوائية. ثم إضافة ثمانية ملليلتر من متوسطة النمو الطازجة و 210 ميكروغرام لكل ملليلتر من الأمبيسلين في أنبوب بالش العقيمة.الآن جمع مليلتر اثنين من ثقافة نمت بين عشية وضحاها ونقلها إلى أنبوب جهاز طرد مركزي صغير ملليلتر اثنين. بعد الطرد المركزي في 10، 000 RCF لمدة 90 ثانية، وإزالة عظمى و resuspend في مليلتر من متوسط النمو الطازج. ثم إضافة ثقافة resuspended إلى أنبوب بالش التي تحتوي على ثمانية ملليلتر من متوسط النمو الطازجة ampicillin.باستخدام تقنية معقمة، ضع سدادة مطاطية بعناية على أنبوب البلش قبل إزالته من غرفة اللاهوائية. ثم ضع الأنبوب في حاضنة وتنمو اللاهوائية في 37 درجة مئوية مع اهتزاز في 220 دورة في الدقيقة. بين ثلاثة وخمسة .m.جلب أنبوب balch مع الثقافة، أنبوب بالش معقمة جديدة، ومتوسطة النمو في غرفة اللاهوائية. إضافة 100 ميكرولترات من الثقافة إلى 10 ملليلتر من متوسطة النمو الطازجة مع الأمبيسلين في أنبوب األش العقيم. باستخدام تقنية معقمة، ضع سدادة مطاطية بعناية على أنبوب البلش.قم بإزالة الأنبوب من الغرفة اللاهوائية قبل أن ينمو بين عشية وضحاها عند درجة حرارة 37 درجة مئوية مع اهتزاز عند 220 دورة في الدقيقة. بين تسعة وعشرة .m في اليوم التالي، نقل الثقافة ومتوسطة النمو مرة أخرى إلى غرفة اللاهوائية.أضيفي مرة أخرى ثمانية ملليلترات من متوسط النمو و ampicillin في أنبوب بالش معقمة. نقل مليلترين من ثقافة نمت بين عشية وضحاها في أنبوب جهاز طرد مركزي صغير ملليلتر اثنين. بعد الطرد المركزي كما كان من قبل، وإزالة عظمى و resuspend الخلايا في مليلتر اثنين من متوسطة النمو الطازجة.ثم إضافة ثقافة resuspended إلى أنبوب بالش التي تحتوي على متوسط النمو الطازجة و ampicillin. باستخدام تقنية معقمة، ضع سدادة مطاطية بعناية على أنبوب البلش. أخرجه من الغرفة وينمو لاهوائياً عند درجة حرارة 37 درجة مئوية مع اهتزاز عند 220 دورة في الدقيقة.مراقبة نمو الثقافة باستخدام مقياس الطيف الضوئي من خلال دوامة الثقافة ثم قياس الكثافة البصرية في 600 نانومتر أو OD600. بعد ثلاثة إلى أربعة ساعات من النمو المتوقع، ينبغي أن تصل الثقافة إلى OD600 من 6. الآن جلب الأنبوب في غرفة اللاهوائية ونقل الثقافة إلى اثنين من ملليلتر أنابيب أجهزة الطرد المركزي الصغيرة.بعد الطرد المركزي كما كان قبل إزالة نازع الخلية و resuspend كل في مليلترين من متوسط التعرض الطازجة. كرر هذه الخطوة الغسيل مرة واحدة لإزالة أي أثر من متوسطة النمو. الآن الجمع بين كلا أنابيب أجهزة الطرد المركزي الصغيرة من ثقافة الخلية في قارورة PTFE PTFE القياسية سبعة ملليلتر للحصول على مخزون biossor للاستخدام في الفحص التعرض.قبل البدء في التجربة تحقق من رصد اللاهوائية للتأكد من عدم وجود الأكسجين في غرفة اللاهوائية. تصميم لوحة وفقا ل قالب 96 جيدا. لتشغيل التجارب في التكرارات التقنية من ثلاثة وهذا سيسمح ل32 العلاجات المختلفة، والتي هي أفضل ممثلة مع أربعة في ثمانية شبكة لإعداد قوارير.إعداد أربعة من ثمانية شبكة وفقا لتخطيط لوحة المقايسة. ثم ضع 7 قوارير PTFE المليمترية في الدرج. يجب التعامل مع القنينات فقط عن طريق التلاعب خارج القارورة.إضافة حجم متوسط التعرض في كل قارورة المقابلة لكل علاج. إلى كل قارورة إضافة حجم المقابلة من متغير الكيميائية ليتم اختبارها وفقا لتخطيط لوحة. الآن إضافة النترات إلى كل قارورة بحيث يكون التركيز 200 ميكرومولار.استبعاد هذه الخطوة لفراغات المعالجة biosensor التأسيسية. لإضافة الزئبق إلى القنينات، أولاً خذ مخزون الأربعة إلى ثمانية ميكرومولر واهتز جيداً. تخفيف الحل ومتوسطة التعرض في قارورة PTFE 7 ملليلتر إلى تركيز من 100 إلى 250 نانومولار لصنع محلول الزئبق العامل.من هذا الحل العامل، إضافة الزئبق إلى قوارير المطلوبة وفقا لتخطيط لوحة. بعد إضافة الزئبق أو الكادميوم يهز لوحة يدويا في حركة مدارية. ويمكن إيقاف التجربة الآن اعتماداً على الوقت اللازم للزئبق أو الكادميوم لكي يُترك في محلول.عندما يتم استئناف التجربة، الماصات بلطف biosensor الأسهم ذهابا وإيابا لضمان التجانس. ثم إضافة 100 ميكرولتررس من مخزون biosensor إلى كل قارورة وتهز لوحة يدويا كما كان من قبل. الاحماء قارئ لوحة إلى 37 درجة مئوية واقامة تشغيل الحركية لمدة عشر ساعات مع يقرأ كل نقطتين خمس إلى خمس دقائق.اهتزاز مداري بين القراءات. إعداد المدى لاتخاذ قياسات الفلورانس مع استثارة الفلوريسنس من 440 نانومتر وانبعاث 500 نانومتر. الآن ماص 200 ميكرولترات من كل قارورة PTFE في أربعة من قبل ثمانية شبكة في الآبار المقابلة من لوحة 96 بئر.الماصات ذهابا وإيابا خمس مرات قبل نقل كل 200 ميكرولترات. بدلاً من تجاهل طرف الماصات، اترك طرف الماصات في قارورة PTFE لتتبع التقدم في الأنابيب. ضع لوحة 96 في علبة قارئ اللوحة.ثم وضع الغطاء على لوحة 96 جيدا وتبدأ في الفحص. فيما يلي نتائج تمثيلية تظهر بيانات الفلورسنسي المصححة كدالة للوقت. ويظهر الفلور مع تركيزات متزايدة من الزئبق على جهاز الاستشعار الحيوي غير القابل للتكون.جميع القيم فارغة إلى عدم وجود عنصر تحكم الزئبق. ويمكن تحديد قمم الفلورسنت كمياً لإظهار الإشارة الفلورية كدالة لتركيز الزئبق أو الكادميوم. وبالنسبة لكل من أجهزة الاستشعار البيولوجية غير القابلة للانكات، ينبغي استخدام تركيز الزئبق أو الكادميوم في وسط نطاق أجهزة الاستشعار غير القابلة للحساسية الخطية لاختبار المتغيرات.وفيما يلي أمثلة على نتيجة غير حاسمة مع الزنك. ونتيجة حاسمة مع المغنيسيوم والمنغنيز على التوافر البيولوجي الزئبق إلى جهاز استشعار الحيوية. النتيجة مع الزنك غير حاسمة لأن الفلورية التأسيسية تتحلل مع fluorescence غير قابل للانحلال مما يدل على سمية.أثناء محاولة هذا الإجراء من المهم أن نتذكر إدخال تركيزات الكادميوم أو الزئبق حيث سيتم استخدامها لمعايرة جهاز الحساسية البيولوجية. وبعد هذا الإجراء، يمكن تنفيذ طرق أخرى مثل النمذجة الحرارية للأنظمة المائية للإجابة على أسئلة إضافية مثل كيف تؤثر أنواع كيميائية معينة من الزئبق أو الكادميوم على توافرها البيولوجي. لا تنس أن العمل مع الكادميوم والزئبق والأحماض القوية مثل حمض الكبريتيك يمكن أن تكون خطرة للغاية وينبغي اتخاذ الاحتياطات مثل ارتداء معدات الحماية الشخصية دائما أثناء تنفيذ هذا الإجراء.بعد تطورها مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال علم الأحياء الدقيقة البيئية لاستكشاف الزئبق اللاهوائي شبه الوقت الحقيقي أو التوافر البيولوجي للكادميوم والميكروبات القابلة للتمالك وراثيا.

Research

JoVE Journal

Environment

Evaluation of Integrated Anaerobic Digestion and Hydrothermal Carbonization for Bioenergy Production

تقييم الهضم اللاهوائي المتكاملة والتفحيم الحرارية المائية لإنتاج الطاقة الحيوية

Lignocellulosic biomass is one of the most abundant yet underutilized renewable energy resources. Both anaerobic digestion (AD) and hydrothermal ...

Detection of Foodborne Bacterial Pathogens from Individual Filth Flies

الكشف عن مسببات الأمراض البكتيرية المنقولة بالأغذية من الذباب الفردية القذارة

There is unanimous consensus that insects are important vectors of foodborne pathogens. However, linking insects as vectors of the pathogen causing a ...

Development of Sulfidogenic Sludge from Marine Sediments and Trichloroethylene Reduction in an Upflow Anaerobic Sludge Blanket Reactor

تطوير المولدة للكبريتيد الحمأة من الرواسب البحرية والحد من Trichloroethylene في غطاء المفاعل Upflow اللاهوائية الحمأة

The importance of microbial sulfate reduction relies on the various applications that it offers in environmental biotechnology. Engineered sulfate ...

Spotting Cheetahs: Identifying Individuals by Their Footprints

اكتشاف الفهود: الأفراد تحديد من آثارهم

The cheetah (Acinonyx jubatus) is Africa's most endangered large felid and listed as Vulnerable with a declining population trend by the IUCN1. It ranges ...

Experimental Column Setup for Studying Anaerobic Biogeochemical Interactions Between Iron (Oxy)Hydroxides, Trace Elements, and Bacteria

Experimental Column Setup for Studying Anaerobic Biogeochemical Interactions Between Iron OxyHydroxides, Trace Elements, and Bacteria

إعداد العمود التجريبية لدراسة التفاعلات الكيميائية الأرضية الأحيائية اللاهوائية بين هيدروكسيدات الحديد (أوكسي)، والعناصر النزرة، والبكتيريا

Fate and speciation of trace elements (TEs), such as arsenic (As) and mercury (Hg), in aquifers are closely related to physio-chemical conditions, such as ...

Fluorescent Paper Strips for the Detection of Diesel Adulteration with Smartphone Read-out

شرائط ورق الفلورسنت للكشف عن غش الديزل مع القراءة الذكي

Three fluorescent molecular rotors of 4-dimethylamino-4-nitrostilbene (4-DNS) were investigated for their potential use as viscosity probes to indicate ...

A Precise and Autonomous System for the Detection of Insect Emergence Patterns

نظام دقيق ومستقل للكشف عن أنماط ظهور الحشرات

Existing systems to measure insect emergence patterns have limitations; they are only partially automated and are limited in the maximum number of ...

Detection of Tilapia Lake Virus Using Conventional RT-PCR and SYBR Green RT-qPCR

كشف البلطي بحيرة الفيروسات باستخدام التقليدية RT-PCR وسيبر الأخضر RT-قبكر

The aim of this method is to facilitate the fast, sensitive and specific detection of Tilapia Lake Virus (TiLV) in tilapia tissues. This protocol can be ...

An Induction System for Clustered Stomata by Sugar Solution Immersion Treatment in Arabidopsis thaliana Seedlings

An Induction System for Clustered Stomata by Sugar Solution Immersion Treatment in Arabidopsis thaliana Seedlings

نظام التوجيهي "الثغور متفاوت" "السكر الحل العلاج الغمر" في شتلات نبات التمويل

Stomatal movement mediates plant gas exchange, which is essential for photosynthesis and transpiration. Stomatal opening and closing are accomplished by a ...

Cultivation of Green Microalgae in Bubble Column Photobioreactors and an Assay for Neutral Lipids

زراعة الطحالب الخضراء في فقاعة العمود Photobioreactors وفحص للدهون محايدة

There is significant interest in the study of microalgae for engineering applications such as the production of biofuels, high value products, and for the ...