Name: an anaerobic biosensor assay for the detection of mercury and cadmium
Uploaded: 2018-12-17T13:00:00
Duration: 9 min 33 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Anaerobic Biosensor Assay for the Detection of Mercury and Cadmium at JoVE.com

Vi vil gerne takke bemærkninger fra to anonyme anmeldere som godt medlemmer af Poulain Lab for indsigtsfulde diskussion om udviklingen i den anaerobe biosensor. En tidlig forsker Award fra provinsen Ontario og Discovery tilskud og en accelerator supplement fra naturvidenskab og Engineering Research Council of Canada til A.J.P. finansieret denne undersøgelse.

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Mikrobielle biosensorer er nyttige værktøjer til at identificere mekanismer som metaller interagerer med mikrober. Her, vi beskriver en metode, der kan anaerobt kvantificere HgII og CdII biotilgængelighed til en Gram-negative vært celle (E. coli) og give en kvantificerbar resultat inden for et par timer. En af de store styrker af denne protokol er at det giver omfattende kontrol af metal typebestemmelse på mellemlang og eksponering ved at undgå stærke binding ligander eller komponenter, der kan føre til metal nedbør. Metal artsdannelse har modelleret og afprøvet i denne eksponering medium ved hjælp af PHREEQC17, men andre metal artsdannelse software kan installeres. Ingen ekstra ligander, Hg artsdannelse forventes at være til stede som 97% Hg(OH)2 og 3% Hg (NH3)22 +, mens Cd typebestemmelse vil være til stede ved som 59% Cd-β-Glycerophosphate, 25% Cd2 +og 16% CdSO4. Ved hjælp af en simpel termodynamiske modellering software, kan brugeren designe eksponering medier og teste for biotilgængeligheden af metal af interesse. Biosensor vært celle (E. coli NEB5α) er derudover levedygtige over en bred vifte af pH (5-8,5) og NaCl koncentration (0-0,55 M)17.
HG methylering er en anaerob proces, og den protokol, der er skitseret i denne undersøgelse har ikke et krav for ilt, giver mulighed for mere præcis beskrivelse af anaerobe metabolisme på metal biotilgængelighed. Dette er vigtigt, fordi tilstedeværelsen af ilt ændrer gen expression profiler48,49 og dermed potentialet transport veje; derfor udgør denne metode en fordel frem for øjeblikket eksisterer aerob alternativer. Den biosensing konstruktion præsenteres her kan potentielt bruges med andre anaerobe værter, der kan være mere relevante for kviksølv methylering (f.eks. Geobacter, Desulfovibrio), men måske mindre tractable end E. coli. En nuværende begrænsning af tilgang præsenteres her er, at vores grænse for registrering endnu ikke har nået pM niveauer, i modsætning til eksisterende aerobe systemer4,19,37. Det er dog vigtigt at bemærke, at for at opnå disse lave påvisningsgrænser flere skridt skal tages44: Jeg) ligand tilføjelse er forpligtet til at sikre, at Hg forbliver i løsning og ikke adsorberes på mikrobiel cellevæggen (Hg vil være uoprettelige bundet til cellens overflade dithioler forhindrer dens biotilgængelighed25,27; Se tærskel svar til Hg i figur 3A), ii) ændringer til celle tæthed, eller iii) ændre genkonstruktion til også at omfatte transport proteiner af mer-operon (nemlig merT og merP), stigende Hg flux inde i cellen50,51. Disse ændringer ville være gavnlige i forbindelse med afsløring lave koncentrationer af Hg, men ikke nødvendigvis ideel ved vurderingen miljømæssigt relevante situationer. Tidligere cadmium biosensorer findes primært som en "proof of princippet", var de designet i komplekse medier, der ikke tillader investigator at vurdere rollen som artsdannelse biotilgængelighed41,42, 43 , 44.
Biosensor er et utroligt nyttigt redskab til bestemmelse af mekanismer som metal arter er biotilgængelige. Fordi værtsorganismen ikke er en Hg-methylator, kan den kun bruges til at udvikle en model for hvordan Hg kan indtaste Gram-negative bakterier og ikke en endelig rationale for hvordan Hg-methylators erhverve Hg. Der findes andre metoder til bestemmelse af Hg biotilgængelighed, såsom methylering, som et resultat af optagelsen eller brug af en massebalance tilgang10,15,20,45,46. Når det er sagt, tilbyder metoden præsenteres her fordel af kvasi realtid biotilgængelighed data i levedygtige celler. Vi anbefaler ikke, at denne metode bruges til at kvantificere samlede Hg eller Cd niveauer i en miljømæssig matrix. Trods den påtænkte anvendelse af biosensorer til at bestemme metal koncentrationer i miljøet36, er mange mere let tilgængelige standard metoder tilgængelige som ICP-MS, Frederiksen (for Cd analyse) eller kolde damp atomic absorption spektroskopi (for Hg analyse). Biosensor kan dog bruges til at afgøre, om en given miljømæssige matrix har potentiale til at fremme eller hæmme biotilgængelighed; Dette opnås ved at udføre standardopløsninger.
PH af eksponering medier kan ændres til hvor som helst inden for intervallet af 5 og 8,5, forudsat MOPS fri syre (buffer) udveksles med en alternativ fri syre af en buffer med den bør pKa (Se venligst listen over relevante buffere (Ferreira et al. (2015) 47) og justeret med KOH passende pH-værdi, når du foretager eksponering mediet. Derudover metoden er ikke begrænset til Hg og Cd, men kan udvides til andre metaller ved hjælp af andre transskription regulatorer.
Eksponering assay kan ændres for at udforske andre elektronacceptorer O2 og fumarat indflydelse på Hg eller Cd biotilgængelighed. Mindre ændringer til metoden til at udnytte både O2 og fumarat som elektronacceptorer er tilgængelige efter anmodning.
I sammendrag, vi gerne vil fremhæve følgende punkter: jeg) det er bydende nødvendigt, at koncentrationerne af Cd eller Hg bestande er kendt i trin 2, da disse skal bruges til at kalibrere biosensor. II) på dagens eksponering væksten af celler skal være stoppet ved en OD600 på 0,6 (± 0,1) og den omhu, når resuspending cellekulturer, som biosensor er kalibreret til denne celle tæthed. III) endelig er det vigtigt, at eksponering medium er gjort grundigt på dagens eksponering. For at sikre succes i protokollen, flere kulturer bør dyrkes samtidigt (for at omgå muligheden for vækst fiasko) og vækstmediet bør være genskabt ugentligt (for at omgå metastability medier og eventuel forurening). Det skal også bemærkes, at biologiske flergangsbestemmelser (flere cellekulturer) express variabilitet, når det kommer til at signalere produktion. Selv om de fluorescerende svar kan variere fra kultur til kultur, bør de fluorescerende tendenser som reaktion på en given variabel forblive den samme i hele mange biologiske replikater.

Kviksølv (Hg) er et globalt forurenende stof og dets biotilgængelighed til Hg methylating mikrober er det første skridt mod sin Bioakkumuleringen gennem mad webs og dens mulige neurotoksiske virkninger i menneskelige og dyreliv1. Det er i øjeblikket troede at mikrobielle Hg methylering er en intracellulær proces, der kræver: i) arterne af Hg skal være biotilgængelige2,3,4,5,6,7 og ii) for cellen at være fysiologisk i stand til at methylating Hg8,9,10. Cadmium (Cd) bioakkumulerende i organismer, men ikke ikke biomagnifies i foodwebs og er almindeligt anvendt i industrielle og kommercielle processer, der almindeligvis forårsage akut engagementer i mennesker og miljø11. Selv om mikrober spiller flere vigtige roller i Hg skæbne i miljøet, fokusere de fleste undersøgelser på Cd Geokemi og økotoksikologi på mikrobiel eukaryoter12. Forbruget af landbrugsafgrøder (fx ris) er den største kilde til direkte eksponering for cadmium; i dette tilfælde biotilgængelighed af Cd til mikrober af rhizosfære direkte påvirkninger af beløbet planter kan ophobes13.
HG transport veje er komplekse og muligvis indebærer en aktiv transport trin14. Når en transportør er involveret, seneste arbejde foreslog, at HgII bruger en ZnII eller MnII transporter7,15,16,17. Mens CdII er hypotese for at transporteres ved et uheld i cytosol gennem divalent metal transport veje (især MnII eller ZnII) mekanismer af CdII transport indeni cellerne forblive spekulative, og ingen Cd-specifikke transport pathway har været identificeret13,18. Uanset arten af transportvirksomheder involveret, tre mekanistiske faktorer i sidste ende bestemme metaller evne til at indtaste en celle: i) den metal typebestemmelse i løsning2,6,15, 16 , 17 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23, ii) biophysiochemical egenskaber af cellemembranen17,24,25,26,27,28,29 ,30,31, og iii) evne til metal til at få adgang til en transport site7,32. CD og Hg er usandsynligt, at eksisterer som frie ioner på mikrobiel fysiologisk relevante betingelser på grund af deres høje affinitet for opløst organisk stof (DOM), chelaterende forurenende stoffer (fx, EDTA), eller reduceret svovl fraspaltning33, 34,35 (CdII kan eksistere som en gratis ion eller form ion-par i mangel af disse ligander). Der er en mangel på effektive metoder til at bestemme, hvordan disse metal arter er biotilgængelige under betingelser, der er relevante for deres skæbne i miljøet. For eksempel, Hg er methylerede under anaerobe betingelser14, og både cadmium og Hg er bløde metaller (eller klasse B kationer), der kræver, at deres artsdannelse undersøges under forhold, der opretholder integriteten af reduceret svovl grupper.
Mikrobielle biosensorer er bakterieceller, der udsender en kvantificerbar signal som svar på de intracellulære koncentrationer af et metal, i dette tilfælde Hg eller Cd. Som sådan, er de ideelle værktøjer til at forstå, hvordan metaller Indtast en celle36, forudsat at eksponeringsforhold er omhyggeligt kontrolleret. HG biosensorer indeholder typisk gen fusioner mellem de regulerende kredsløb af mer-operon (herunder gener kodning for transskription regulator MerRas samt operatør og promotor regioner af operonen), og rapportering gener (f.eks. Lux, normal god landbrugspraksis, lac gener). Når kviksølv findes i cytoplasma, vil den binde sig til MerR, hvilket resulterer i transskription af rapportering gener og efterfølgende signal produktion19,37. Særlige Cd biosensorer er normalt udviklet ved hjælp af cadC, cadAC, zntA eller zntR kodet transskription regulatorer38, men det er værd at bemærke, at MerR har en lavere, men alligevel målbare affinitet til Cd5. På grund af aerobe begrænsning af de fleste anvendte almindeligt selvlysende eller fluorescerende reporter proteiner, indtil for nylig mikrobielle biosensorer forblev ikke tilbyde indsigt i biotransformation af metaller under iltfattige forhold. Dette gør anaerob påvisning af metaller biotilgængelighed meget vanskeligt på en række betingelser er relevante for deres skæbne i miljøet, specielt i overværelse af redox følsomme ligander (fx sulfid og dithioler)4, 5 , 39.
For at afhjælpe den metodologiske forhindring af live imaging i mangel af ilt, Drepper et al. (2007) har udviklet en flavin-baserede fluorescerende proteiner (FbFp), baseret på lys ilt spænding domæne SB2 protein fra P. putida. Dette protein familie er købedygtig fluorescerer i mangel af ilt40. Med udgangspunkt i arbejdet i Drepper et al., designet vores lab en anaerob biosensor giver mulighed for undersøgelse af Hg biotilgængelighed under oxic og iltfattige forhold og over en bred vifte af saltholdighed 17. I den nuværende papir beskriver vi hvordan man kan forberede og bruge biosensor for at teste miljømæssige variabler indflydelse på Hg eller Cd biotilgængelighed. Selv om vi udviklet biosensor for HgII, valgte vi at udføre eksperimenter med CdII som et middel til at henlede læserens opmærksomhed på, at biosensorer kan også reagere på flere stressfaktorer, der kan forventes at samtidig forekomme i miljøet matricer; i dette tilfælde CdII blev undersøgt fordi det er kendt for at binde til det transkriptionel regulator MerR5. Her viser vi repræsentative kalibrering og funktionelle lineær intervaller med hensyn til enten metal. Vi giver også et eksempel når biosensor's resultater er afgørende (MgII og MnII på Hg biotilgængelighed) og usikkert (ZnII på Hg biotilgængelighed).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>7 ml standard vial, rounded interior</td>
			<td>Delta Scientific</td>
			<td>200-007-20</td>
			<td>34 recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vial tray, 21 mm openings</td>
			<td>Delta Scientific</td>
			<td>730-2001</td>
			<td>4 for (4 x 8 grid)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 mm Closure</td>
			<td>Delta Scientific</td>
			<td>600-024-01</td>
			<td>32 recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LID CORNER NOTCH BLK STR CS/50</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Corning 3931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 96- well clear-bottom nonbinding surface microplate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Corning 3651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anaerobic Chamber (glovebox)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>The air in the anaerobic chamber should be (97 % N2 &#177; 2 % and 3 % H2 &#177; 2 %)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Palladium catalyst</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Converts O2 to H2O in the anaerobic chamber. Not required but recommended.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>450 (&#177;10) nM filter for the microplate reader</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 (&#177;10) nM filter for the microplate reader</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anaerobic culture vial (balch tubes) + rubber stoppers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Modified for anaerobic culture tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MA-3000 (mercury analyzer)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH probe</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any pH probe will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical sterile polypropylene centrifuge tubes.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m polyethersulfone syringe filter + syringe</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile/clean glass bottles</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For growth media and standards</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile/clean plastic or PTFE bottles</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For alkali solutions (NaOH/KOH)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents powders: Na2MoO4, Na2SeO4, H3BO3, NaOH, KOH, MnSO4, ZnSO4, CoCl2, NiCl2, ampicillin sodium salt, Difco M9 Minimal Salts, Glucose, MgSO4, Thiamine HCl, NaNO3, l-leucine, l-isoleucine valine, EDTA sodium salt, FeSO4, Sodium Beta-Gylcerophosphate, Mops free acid, (NH4)2SO4, Hg(NO3)2, CdCl2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Milli-Q water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Autoclaved or filter sterilized is fine.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysogeny Broth</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical grade H2SO4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an anaerobic biosensor assay for the detection of mercury and cadmium

Kviksølv (Hg) biotilgængelighed til mikrober er et vigtigt skridt til giftige Hg Bioakkumuleringen i mad webs. Cadmium (Cd) transformationer og biotilgængelighed til bakterier kontrollere det beløb, der vil ophobe sig i korte fødevareafgrøder. Biotilgængelighed af disse metaller er afhængige af deres typebestemmelse i løsning, men mere især under iltfattige forhold hvor Hg er methylerede til giftige monomethylmercury (MeHg) og Cd fortsætter i rhizosfære. Hele-celle mikrobielle biosensorer give en kvantificerbar signal, når en metal ind i cytosol og derfor er nyttige værktøjer til at vurdere metal biotilgængelighed. Desværre, de fleste biosensing bestræbelser har hidtil været begrænset til oxic miljøer på grund af den begrænsede evne af eksisterende reporter proteiner til at fungere i mangel af ilt. I denne undersøgelse præsenterer vi vores indsats for at udvikle og optimere en helhed-celle biosensor assay funktionsdygtigt anaerobt der kan registrere metaller under iltfattige betingelse i næsten realtid og inden for timer. Vi beskriver, hvordan biosensor kan hjælpe med at vurdere hvordan kemiske variabler er relevante for den miljømæssige cykling af metaller påvirker deres biotilgængelighed. Følgende protokol omfatter metoder til at (1) forberede Hg og Cd-standarder under iltfattige forhold, (2) forberede biosensor i mangel af ilt, (3) design og Udfør et eksperiment for at bestemme, hvordan en række variabel påvirker Hg eller Cd biotilgængelighed, og (4) at kvantificere og fortolke biosensor data. Vi viser de lineære intervaller af biosensorer og give eksempler viser metodens evne til at skelne mellem metal biotilgængelighed og toksicitet ved at udnytte både metal-inducerbar og konstituerende stammer.

Når fluorescens toppe har opgjort ifølge trin 5.3, kan resultatet af fluorescens toppe grafen efter den variable koncentration illustrerer, hvordan denne variabel påvirker den relative biotilgængelighed enten Hg eller Cd. For eksempel, vil fluorescens over [HgII] fra figur 2 kalibreringskurve give inducerbar data præsenteret i figur 3A. Til HgII kalibrering, kurve vil altid indeholde 3 komponenter til Hg-inducerbar stammen; en tærskel svar på omkring 1-2 nM HgII før fluorescens signal produktion er lineært proportionelt til [HgII], det lineære område hvor 5 nM HgII pålideligt altid vil være i midten af dette område, og et plateau hvor øge [HgII] vil ikke længere øge fluorescens signal. Ingen ændring i signal produktion på den konstituerende stamme viser, at toksicitet fra [HgII] ikke påvirker signalet produktion. CdII i figur 3Ber der altid 2 komponenter for inducerbar stamme; en lineære område hvor 200-300 nM CdII bliver pålideligt altid i midten af det lineære område og et plateau. Et fald i fluorescens signal med stigende [CdII] viser, at højere Cd koncentrationer er giftigt for celler og kan forklare en nedgang i inducerbar fluorescens produktionen efter plateau ved 1000 nM CdII. Derfor, når du tester Hg eller Cd biotilgængelighed med hensyn til en miljømæssig variable, vi foreslår at bruge 5 nM for HgII og 300 nM for CdII.
I nogle tilfælde signal produktion kan korrekt tilskrives Hg eller Cd biotilgængelighed, men i andre tilfælde signal produktion kan blive påvirket af variation i biosensor celle vært fysiologiske tilstand (f.eks. metal af interesse eller miljøforhold testet er giftige). I figur 4A, 5 nM Hg biotilgængelighed blev testet over et forløb af Zn (0-10 µM). I både Hg-inducerbar og konstituerende stammer er der et lignende fald i signal med stigende Zn koncentrationer. Derfor, man kan ikke diskriminere om signalet er et resultat af sænkede biotilgængelighed eller er et resultat af Zn toksicitet. I figur 4B og 4 C, 5nM Hg biotilgængelighed blev testet over et forløb af MgII (0-10 mM) og MnII (0-10 µM). Stigende MgII og MnII koncentrationer faldt fluorescens signal af den inducerbare stamme. På den anden side den konstituerende stamme ikke viser et fald i fluorescens med stigende MgII og MnII koncentrationer (MgII og MnII er til gavn for cellerne i produktionen af FbFp, som det fremgår af en stigning i fluorescens-signalet). Dette viser, at cellerne er levedygtig og fluorescens faldet af Hg-inducerbar stammen resultater fra et fald i Hg biotilgængelighed. Denne data understreger, hvor vigtigt det er for alle biosensor assays til også give konstitutiv målinger af overordnede celle fitness.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58324/58324fig3.jpg"> Figur 3: lineær intervaller af biosensor med kviksølv og Cadmium. Maksimale fluorescens måles som relativ fluorescens enheder (RFU) ± 1 standardafvigelse fra E. coli NEB5α husly pUC57merR-Pp (Hg-inducerbar) og pUC19Balch-Pp (Constitutive) med tilføjelse af A) HgII (0-15 nM) og B) CdII (0-1.000 nM) under anaerobe forhold. Fluorescens var gennemsnittet af 3 tekniske replikater på 37 ˚C. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58324/58324fig3large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58324/58324fig4.jpg"> Figur 4: eksempel på et usikkert resultat med zink og en afgørende resultat med Magnesium og mangan. Maksimale fluorescens måles som relativ fluorescens enheder (RFU) ± 1 standardafvigelse fra E. coli NEB5α husly pUC57merR-Pp (Hg-inducerbar) og pUC19Balch-Pp (Constitutive) med tilføjelse af A) ZnII (0-10 µM), B) MgII (0-10 mM), og C) MnII (0-10 µM) under anaerobe forhold. [HgII] blev sat til 5 nM for alle behandlinger og fluorescens var gennemsnittet af 3 tekniske replikater på 37 ˚C. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58324/58324fig4large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>

Watch this Scientific Journal Video about An Anaerobic Biosensor Assay for the Detection of Mercury and Cadmium at JoVE.com

An Anaerobic Biosensor Assay for the Detection of Mercury and Cadmium

Vi præsenterer her, en protokol for at bruge en anaerob hele-celle mikrobielle biosensor til at evaluere hvordan forskellige miljøvariabler påvirke biotilgængeligheden af Hg og Cd til bakterier i iltfattige miljøer.

En anaerob Biosensor Assay til påvisning af kviksølv og Cadmium

Mercury (Hg) bioavailability to microbes is a key step to toxic Hg biomagnification in food webs. Cadmium (Cd) transformations and bioavailability to ...

Denne metode kan hjælpe med at besvare centrale spørgsmål vedrørende biogeokemisk cykling af cadmium og kviksølv, såsom hvordan forskellige miljømæssige variabler påvirker deres biotilgængelighed for bakterier. Den største fordel ved denne teknik er, at det giver kvasi realtid biotilgængelighed data og levedygtige celler uanset tilstedeværelsen af ilt. Generelt enkeltpersoner nye til denne metode vil kæmpe, fordi der er mange tidsfølsomme trin, der kræver meget omhyggelig opmærksomhed på detaljer.Demonstration af proceduren vil være Ben, en grad studerende fra mit laboratorium. For at forberede analysen, hente kviksølv inducerende biosensor og konstituerende udtrykt biosensor fra et minus 80 grader Celsius cryo lager. Plade cellerne på lysogen bouillon plader, der indeholder 120 mikrogram pr. milliliter ampicillin.Dyrk pladekulturerne i en kuvøse ved 37 grader Celsius natten over. Mellem 4:30 og 5 p.m. inokulere en kultur i ti milliliter LB med ampicillin og vokse natten over ved 37 grader Celsius med rystelser på 220 rpm.På mellem ni og ti a.m næste morgen bringe kulturen samt den tidligere forberedte vækstmedium ind i anaerobe kammer. Derefter tilsættes otte milliliter frisk vækstmedium og 210 mikrogram pr. milliliter ampicillin i et sterilt balchrør.Nu indsamle to milliliter af natten dyrket kultur og overføre til en to milliliter mikrocentrifuge rør. Efter centrifugering ved 10,000 RCF i 90 sekunder fjernes supernatanten og resuspendres i to milliliter frisk vækstmedium. Derefter tilsættes den resuspenderede kultur til balch røret indeholder otte milliliter frisk vækst medium og ampicillin.Ved hjælp af steril teknik, omhyggeligt placere en gummi prop på balch røret, før du fjerner det fra det anaerobe kammer. Derefter placere røret i en kuvøse og vokse anaerobically ved 37 grader Celsius med omrystning ved 220 rpm. Mellem tre og fem p.m.bringe balch rør med kulturen, en ny steril balch rør, og vækstmediet ind i anaerobe kammer. Tilsæt 100 mikroliter af kulturen til 10 milliliter frisk vækstmed ampicillin i det sterile balchrør. Ved hjælp af steril teknik, omhyggeligt placere en gummi prop på balch røret.Fjern røret fra det anaerobe kammer, før du dyrker det natten over ved 37 grader Celsius med rystelser ved 220 rpm. Mellem ni og ti a.m. den næste dag, overføre kultur og vækstmediet tilbage til det anaerobe kammer.Igen tilføje otte milliliter vækst medium og ampicillin i en steril balch rør. Overfør to milliliter af den dyrkede kultur natten over til et to milliliter mikrocentrifugerør. Efter centrifugering som før fjernes supernatanten og cellerne opsbruges igen i to milliliter frisk vækstmedium.Tilsæt derefter den resuspenderede kultur til balchrøret, der indeholder det friske vækstmedium og ampicillin. Ved hjælp af steril teknik, omhyggeligt placere en gummi prop på balch røret. Fjern det fra kammeret og vokse anaerobically ved 37 grader Celsius med omrystning på 220 rpm.Overvåg kulturens vækst ved hjælp af et spektrofotometer ved at vortexing kulturen og derefter måle den optiske tæthed ved 600 nanometer eller OD600. Efter tre til fire timers forventet vækst, bør kulturen nå en OD600 af 6. Nu bringe røret i det anaerobe kammer og overføre kulturen i to to milliliter mikrocentrifuge rør.Efter centrifugering som før fjernes supernatant og resuspendere hver celle gane i to milliliter frisk eksponering medium. Gentag dette vasketrin én gang for at fjerne ethvert spor af vækstmediet. Nu kombinere både mikro centrifuge rør af cellekultur i en syv milliliter PTFE standard hætteglas for at opnå biosensor lager til brug i eksponeringsanalyse.Før forsøget påbegyndes, skal den anaerobe monitor kontrolleres for at sikre, at der ikke er ilt i det anaerobe kammer. Design pladen layout i henhold til en 96 godt skabelon. For at køre forsøg med tekniske replikater af tre vil dette give mulighed for 32 forskellige behandlinger, som bedst repræsenteres med en fire af otte gitter til at oprette hætteglas.Opsæt de fire med otte gitter i henhold til analysen plade layout. Læg derefter syv milliliter PTFE standard hætteglas i bakken. Hætteglas bør kun håndteres ved at manipulere ydersiden af hætteglasset.Der tilsættes eksponeringsmediummængden i hvert hætteglas, der svarer til hver behandling. Til hvert hætteglas tilsættes det tilsvarende volumen af den kemiske variabel, der skal testes i henhold til pladelayoutet. Nu tilsættes nitrat til hvert hætteglas, så koncentrationen er 200 mikromolar.Udeluk dette trin for konstituerende biosensor behandling emner. For at tilføje kviksølv til hætteglassene, først tage de fire til otte mikromolar bestand og ryst godt. Opløsningen og eksponeringsmediet fortyndes i et PTFE-hætteglas med syv milliliter til en koncentration på 100 til 250 nanomolar for at lave en fungerende kviksølvopløsning.Fra denne arbejdsløsning tilsættes kviksølv til de nødvendige hætteglas i henhold til pladelayoutet. Efter tilsætning af kviksølv eller cadmium manuelt ryste pladen i en orbital bevægelse. Forsøget kan sættes på pause nu afhængigt af den tid, det er nødvendigt for, at kviksølv eller cadmium kan speciaate i opløsning.Når forsøget genoptages, pipetteres biosensorbestanden forsigtigt frem og tilbage for at sikre homogenitet. Derefter tilsættes 100 mikroliter af biosensorlageret til hvert hætteglas og ryst forsigtigt pladen som før. Varm pladelæseren op til 37 grader Celsius og opsæt et kinetisk løb i ti timer med aflæsninger hvert andet punkt fem til fem minutter.En orbital ryster i mellem aflæsninger. Opsæt løbet til at tage fluorescensmålinger med en fluorescens-excitation på 440 nanometer og en emission på 500 nanometer. Nu pipette 200 mikroliter fra hver PTFE hætteglas i de fire med otte gitter i de tilsvarende brønde af 96 brøndpladen.Pipette frem og tilbage fem gange, før hver 200 mikroliter overføres. I stedet for at kassere pipettespidsen skal pipettens tip efterlades i PTFE-hætteglasset for at holde styr på pipetteringsfremsk status. Placer 96 brøndpladen i bakken på pladelæseren.Derefter placere låget på 96 godt plade og begynde analysen. Her er repræsentative resultater, der viser korrigerede fluorescensdata som en funktion af tid. Fluorescens er vist med stigende koncentrationer af kviksølv til den inducerende biosensor.Alle værdier er tomme til ingen kviksølv kontrol. Lysstofrørets toppe kan kvantificeres for at vise fluorescerende signalet som en funktion af kviksølv- eller cadmiumkoncentrationen. For både de inducerende og de konstituerende biosensorer bør kviksølv- eller cadmiumkoncentrationen midt i det inducerede sensors lineære område anvendes til testvariabler.Her er eksempler på et usikkert resultat med zink. Og et afgørende resultat med magnesium og mangan om kviksølv biotilgængelighed til biosensor. Resultatet med zink er ikke overbevisende, fordi den konstituerende fluorescens henfalder med inducerelig fluorescens, der indikerer toksicitet.Under forsøg på denne procedure er det vigtigt at huske at indtaste koncentrationerne af enten cadmium eller kviksølv, da disse vil blive brugt til at kalibrere biosensoren. Efter denne procedure kan andre metoder som termodynamisk modellering af vandige systemer udføres for at besvare yderligere spørgsmål såsom hvordan påvirker specifikke kemiske arter af kviksølv eller cadmium deres biotilgængelighed. Glem ikke, at arbejde med cadmium og kviksølv og stærke syrer såsom svovlsyre kan være yderst farligt og forholdsregler såsom brug af personlige værnemidler bør altid tages, mens du udfører denne procedure.Efter sin udvikling denne teknik banede vejen for forskere inden for miljømæssig mikrobiologi til at udforske kvasi realtid anaerob kviksølv eller cadmium biotilgængelighed og genetisk tractable mikrober.

Research

JoVE Journal

Environment

Evaluation of Integrated Anaerobic Digestion and Hydrothermal Carbonization for Bioenergy Production

Evaluering af integreret anaerob nedbrydning og Hydrotermisk forkulning til bioenergiproduktion

Lignocellulosic biomass is one of the most abundant yet underutilized renewable energy resources. Both anaerobic digestion (AD) and hydrothermal ...

Detection of Foodborne Bacterial Pathogens from Individual Filth Flies

Påvisning af fødevarebårne patogene bakterier fra Individual Filth Fluer

There is unanimous consensus that insects are important vectors of foodborne pathogens. However, linking insects as vectors of the pathogen causing a ...

Development of Sulfidogenic Sludge from Marine Sediments and Trichloroethylene Reduction in an Upflow Anaerobic Sludge Blanket Reactor

Udvikling af Sulfidogenic Slam fra marine sedimenter og Trichlorethylen Reduktion i en opadgående strømning Anaerob Slam Blanket Reactor

The importance of microbial sulfate reduction relies on the various applications that it offers in environmental biotechnology. Engineered sulfate ...

Spotting Cheetahs: Identifying Individuals by Their Footprints

Spotting Geparder: Identifikation Personer ved deres fodspor

The cheetah (Acinonyx jubatus) is Africa's most endangered large felid and listed as Vulnerable with a declining population trend by the IUCN1. It ranges ...

Experimental Column Setup for Studying Anaerobic Biogeochemical Interactions Between Iron (Oxy)Hydroxides, Trace Elements, and Bacteria

Experimental Column Setup for Studying Anaerobic Biogeochemical Interactions Between Iron OxyHydroxides, Trace Elements, and Bacteria

Eksperimentelle kolonne Setup for at studere anaerob biogeokemiske interaktioner mellem jernhydroxider (Oxy), sporstoffer og bakterier

Fate and speciation of trace elements (TEs), such as arsenic (As) and mercury (Hg), in aquifers are closely related to physio-chemical conditions, such as ...

Fluorescent Paper Strips for the Detection of Diesel Adulteration with Smartphone Read-out

Fluorescerende papirstrimler til påvisning af Diesel forfalskning med Smartphone læse-out

Three fluorescent molecular rotors of 4-dimethylamino-4-nitrostilbene (4-DNS) were investigated for their potential use as viscosity probes to indicate ...

A Precise and Autonomous System for the Detection of Insect Emergence Patterns

En præcis og autonome System til påvisning af insekt fremkomsten mønstre

Existing systems to measure insect emergence patterns have limitations; they are only partially automated and are limited in the maximum number of ...

Detection of Tilapia Lake Virus Using Conventional RT-PCR and SYBR Green RT-qPCR

Påvisning af Tilapia søen Virus ved hjælp af konventionelle RT-PCR og SYBR Green RT-qPCR

The aim of this method is to facilitate the fast, sensitive and specific detection of Tilapia Lake Virus (TiLV) in tilapia tissues. This protocol can be ...

An Induction System for Clustered Stomata by Sugar Solution Immersion Treatment in Arabidopsis thaliana Seedlings

An Induction System for Clustered Stomata by Sugar Solution Immersion Treatment in Arabidopsis thaliana Seedlings

En induktion System for grupperet spalteåbninger af sukker løsning fordybelse behandling i Arabidopsis thaliana stiklinger

Stomatal movement mediates plant gas exchange, which is essential for photosynthesis and transpiration. Stomatal opening and closing are accomplished by a ...

Cultivation of Green Microalgae in Bubble Column Photobioreactors and an Assay for Neutral Lipids

Dyrkning af grøn mikroalger i boble kolonne Photobioreactors og en analyse for Neutral lipider

There is significant interest in the study of microalgae for engineering applications such as the production of biofuels, high value products, and for the ...