Name: an anaerobic biosensor assay for the detection of mercury and cadmium
Uploaded: 2018-12-17T13:00:00
Duration: 9 min 33 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Anaerobic Biosensor Assay for the Detection of Mercury and Cadmium at JoVE.com

We bedank opmerkingen van twee Anoniem reviewers als ook leden van de Poulain Lab voor inzichtelijke discussie over de ontwikkeling van de anaërobe biosensor. Deze studie wordt gefinancierd door een Early onderzoeker Award van de provincie Ontario en de toekenning van een ontdekking en een aanvulling van de versneller van de Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada op A.J.P..

De auteurs hebben niets te onthullen.

Microbiële biosensoren zijn nuttige hulpmiddelen om te identificeren van de mechanismen waarmee metalen zijn interactie met microben. Hier beschrijven we een methode die Hg anaëroob kan kwantificerenII en CdII biologische beschikbaarheid tot een gram-negatieve gastheercel (E. coli) en geven een meetbaar resultaat binnen een paar uur. Een van de belangrijkste troeven van dit protocol is dat het mogelijk uitgebreide controle van metalen soortvorming in het blootstelling medium maakt door het vermijden van sterke bindende liganden of componenten die tot metalen neerslag leiden kunnen. Metaal speciatie is gemodelleerd en getest in dit medium van de blootstelling met behulp van de PHREEQC17, maar andere metaal speciatie-software kan worden ingezet. In het geval van geen toegevoegde liganden, Hg soortvorming verwachting aanwezig te zijn als 97% Hg(OH),2 en 3% Hg (NH3)22 +, terwijl Cd soortvorming zullen presenteren als 59% Cd-β-Glycerophosphate, 25% Cd2 +en 16% CdSO4. Met behulp van een eenvoudige thermodynamische modellering software, kan de gebruiker blootstelling media ontwerpen en testen voor de biodisponibiliteit van het metaal van belang. Daarnaast de gastheercel biosensor (E. coli NEB5α) haalbaar is over een brede waaier van pH (5-8.5) en concentratie van de NaCl (0-0,55 M)17.
Methylation van HG is een anaerobe proces, en het protocol geschetst in deze studie hoeft niet een vereiste voor zuurstof, waardoor meer accurate beschrijving van anaërobe metabolisme op metalen biologische beschikbaarheid. Dit is belangrijk omdat de aanwezigheid van zuurstof gen expressie profielen48,49 verandert , en vandaar, potentieel vervoer trajecten; Deze methode stelt daarom een voordeel ten opzichte van momenteel bestaand aërobe alternatieven. De constructie van de biosensing hier gepresenteerde potentieel kan worden gebruikt met andere anaërobe hosts die relevant meer voor kwik methylering (bijv. Geobacter, Desulfovibrio), maar misschien zijn kunnen minder hanteerbare dan E. coli. Een van de huidige beperking van de hier gepresenteerde benadering is dat onze limiet van detectie pM niveaus, in tegenstelling tot bestaande aërobe systemen4,-19,37nog niet heeft bereikt. Het is echter belangrijk op te merken dat om deze lage detectiegrenzen verschillende stappen dienen te worden genomen44: ik) ligand toevoeging is vereist om ervoor te zorgen dat Hg in de oplossing blijft en niet op de microbiële celwand (Hg zullen onomkeerbaar gebonden doet adsorberen naar een cel oppervlakte thiolen voorkomen zijn biologische beschikbaarheid25,27; Zie de reactie van de drempel voor Hg in figuur 3A), ii) wijzigingen van de celdichtheid, of iii) wijzigen van de genetische constructie tot vervoer proteïnen van de mer-operon (namelijk merT en merP), toenemende Hg flux binnen de cel50,51. Deze wijzigingen zou heilzaam bij de opsporing van de lage concentraties van Hg, maar niet noodzakelijkerwijs ideaal bij de beoordeling van de milieu relevante situaties. Overwegende dat eerdere cadmium biosensoren bestaan voornamelijk als een "proof of principe", werden ze ontworpen in complexe media die niet toestaan de onderzoeker te beoordelen van de rol van soortvorming op biologische beschikbaarheid41,42, 43 , 44.
De biosensor is een ongelooflijk nuttig hulpmiddel bij het bepalen van de mechanismen waarin metalen soorten biologisch beschikbaar zijn. Omdat het ontvangende organisme niet een Hg-methylator is, kan het uitsluitend gebruikt voor het ontwikkelen van een model voor hoe Hg gram-negatieve bacteriën en niet een definitieve reden voor hoe Hg-methylators Hg verwerven kan invoeren. Er bestaan andere methoden voor de bepaling van de biologische beschikbaarheid Hg, zoals methylering, als een resultaat van opname of het gebruik van een massabalans aanpak10,15,20,45,,46. Dat gezegd zijnde, biedt de hier voorgestelde methode het voordeel van quasi real time-gegevens van de biologische beschikbaarheid in levensvatbare cellen. Wij adviseren niet dat deze methode worden gebruikt om de totale Hg of Cd niveaus in een milieu matrix te kwantificeren. Ondanks het voorgestelde gebruik van biosensoren om metalen concentraties in het milieu36, zijn veel meer beschikbaar standaardmethoden beschikbaar zoals ICP-MS, FAAS (p.a. Cd) of koude damp-atomaire absorptie spectroscopie (voor Hg analyse). De biosensor kan echter worden gebruikt om te bepalen als een bepaald milieu matrix heeft het potentieel om te verbeteren of belemmeren van biologische beschikbaarheid; Dit wordt bereikt door het uitvoeren van de Standaardextra.
De pH van de media blootstelling mag worden gewijzigd om overal binnen de waaier van 5 en 8,5, mits de MOPS vrije zure (buffer) wordt uitgewisseld met een alternatieve vrij zuur van een buffer met de desbetreffende pKa (zie lijst van passende buffers (Ferreira et al. (2015) 47) en aangepast met KOH aan de juiste pH-waarde bij het maken van de media van de blootstelling. Bovendien, de methode is niet beperkt tot Hg en Cd, maar kan worden uitgebreid tot andere metalen met behulp van andere regelgevers van de transcriptie.
De bepaling van de blootstelling kan worden gewijzigd om te verkennen van de invloed van andere elektronen acceptoren zoals O2 en fumaraat op Hg of Cd biologische beschikbaarheid. Kleine wijzigingen in de methode te gebruiken zowel O2 en fumaraat als elektronen acceptoren zijn beschikbaar op aanvraag.
Kortom, we willen graag de volgende punten: ik) is het absoluut noodzakelijk dat de concentraties van Cd of Hg voorraden zijn bekend in stap 2, zoals deze wordt gebruikt voor het kalibreren van de biosensor. II) op de dag van de blootstelling, de groei van cellen moet worden gestopt bij een OD-600 voor 0.6 (± 0,1) en dat de zorg wordt genomen bij de resuspending van de celculturen, als de biosensor is gekalibreerd om de celdichtheid van deze. III) ten slotte, het is belangrijk dat het medium blootstelling minutieus op de dag van de blootstelling geschiedt. Om ervoor te zorgen het succes van het protocol, meerdere culturen tegelijk (te omzeilen de mogelijkheid van groei storing) moeten worden gekweekt en het groeimedium moet wekelijks worden vernieuwd (om te omzeilen de metastabiliteit van de media en de eventuele verontreiniging). Ook opgemerkt moet worden dat biologische replicatieonderzoeken (meerdere celculturen) variabiliteit kenbaar te maken wanneer het gaat om het signaal van de productie. Hoewel de fluorescerende reacties van cultuur tot cultuur variëren kunnen, moeten de fluorescerende trends in reactie op een gegeven variabele blijven hetzelfde tijdens talrijke biologische replicatieonderzoeken.

Kwik (Hg) is een wereldwijde verontreinigende stof en de biologische beschikbaarheid aan Hg methylerend microben is de eerste stap naar de biomagnificatie via voedsel webs en mogelijk neurotoxische effecten in mens en natuur1. Er wordt op dit moment gedacht dat microbiële methylation van Hg is een intracellulair proces dat vereist: i) de soorten Hg als biologisch beschikbare2,3,4,5,6,7 en ii) voor de cel te kunnen fysiologisch methylerend Hg8,9,10. Cadmium (Cd) bioaccumulates in organismen, maar doet niet biomagnifies in foodwebs en wordt veel gebruikt in industriële en commerciële processen die vaak acute blootstelling in mensen en het milieu11 veroorzaken. Hoewel microben verschillende spelen een belangrijke rol in het lot van Hg in het milieu spelen, richten de meeste studies over Cd geochemie en ecotoxicologie op microbiële eukaryoten12. Consumptie van landbouwproducten (bijvoorbeeld rijst) is de belangrijkste bron van directe blootstelling aan cadmium; in dit geval de biodisponibiliteit van Cd naar microben van de rhizosfeer rechtstreeks van invloed op de hoeveelheid planten kunnen accumuleren13.
HG vervoer trajecten zijn complex en eventueel betrekken een actief transport stap14. Wanneer een vervoerder is betrokken, recent werk voorgesteld dat HgII een Zn gebruiktII of MnII transporter7,15,16,17. Overwegende dat de CdII is veronderstelde om per ongeluk worden vervoerd in het cytosol via divalente metalen vervoer wegen (vooral MnII of ZnII), mechanismen van CdII vervoer binnen de cellen blijven speculatieve en geen Cd-specifieke vervoer traject geweest geïdentificeerde13,18. Ongeacht de aard van de betrokken vervoerders, drie mechanistische factoren bepalen uiteindelijk het vermogen van metalen tot het invoeren van een cel: i) de metalen soortvorming in oplossing2,6,15, 16 , 17 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23, ii) de biophysiochemical eigenschappen van de celmembraan17,24,25,26,27,28,29 ,30,31, en iii) de mogelijkheid voor het metaal tot een vervoer site7,32. CD en Hg zijn waarschijnlijk niet bestaat als vrije ionen microbiële fysiologisch relevante omstandigheden vanwege hun hoge affiniteit voor opgeloste organische materie (DOM), chelaat verontreinigingen (bijvoorbeeld EDTA), of zwavel wordt33, verminderd 34,35 (CdII kan bestaan als een vrije ion of formulier ion-paren in de afwezigheid van deze liganden). Er is een gebrek aan efficiënte methoden in om te bepalen hoe deze metalen soorten biologisch beschikbaar onder omstandigheden met betrekking tot hun lot in het milieu. Bijvoorbeeld, Hg is gemethyleerd onder anaërobe omstandigheden14, en zowel cadmium en Hg zijn zachte metalen (of klasse B kationen), vereisen dat hun soortvorming onder omstandigheden die de integriteit van verminderde zwavel groepen behouden worden onderzocht.
Microbiële biosensoren zijn bacteriële cellen die een kwantificeerbare signaal in reactie op de intracellulaire concentraties van metaal, in dit geval Hg of Cd uitstoten. Als zodanig zijn ze ideaal hulpmiddelen om te begrijpen hoe metalen Voer een cel36, mits de blootstellingsvoorwaarden zijn zorgvuldig gecontroleerd voor. HG biosensoren bevatten doorgaans gene fusies tussen de regelgevende circuits van de mer-operon (inclusief genen coderend voor de transcriptie regulator MerRas evenals de operator en de promotor voor regio's van het operon), query's en rapporten genen (b.v., Lux, gfp, lac genen). Als kwik in het cytoplasma aanwezig is, zal het binden aan MerR, resulterend in de transcriptie van de rapportage genen en de daaropvolgende signaal productie19,37. Specifieke Cd biosensoren zijn meestal ontworpen met behulp van de cadC, cadAC, zntA of zntR gecodeerd transcriptie regelgevers38, maar het is vermeldenswaard dat MerR een lagere, maar meetbare affiniteit met Cd5 heeft. Als gevolg van aërobe beperking van de meeste gebruikte luminescent of TL verslaggever eiwitten, totdat onlangs microbiële biosensoren bleef niet bieden inzicht in de biotransformatie van metalen onder zuurstofvrije omstandigheden. Dit maakt anaërobe opsporing van metalen biobeschikbaarheid zeer moeilijk over een scala van omstandigheden relevant zijn voor hun verspreiding in het milieu, specifiek in het bijzijn van de redox gevoelige liganden (bijvoorbeeld sulfide en thiolen)4, 5 , 39.
Ter verzachting van de methodologische horde van beeldvorming bij gebrek aan zuurstof, Drepper et al. leven (2007) hebben een flavin gebaseerde fluorescente proteïne (FbFp) ontwikkeld, gebaseerd op lichte zuurstof-spanning domein SB2 eiwit van P. putida. Deze eiwit-familie vermag fluoresceren bij gebrek aan zuurstof40. Voortbouwend op de werkzaamheden van Drepper et al., ontworpen ons lab een anaërobe biosensor waardoor voor de studie van Hg biobeschikbaarheid IME en zuurstofvrije omstandigheden en over een breed scala aan zoutgehalte 17. In het huidige document beschrijven we hoe te bereiden en gebruiken van de biosensor om te testen omgevingsvariabelen invloed op Hg of Cd biologische beschikbaarheid. Hoewel we de biosensor ontwikkeld voor HgII, kozen we voor het uitvoeren van experimenten met CdII als een middel om te trekken de aandacht van de lezer op het feit dat biosensoren reageert ook op meerdere stressoren die zijn waarschijnlijk mede in milieu matrices; in dit geval CdII werd onderzocht omdat het is bekend om te binden aan de transcriptionele regelgever MerR5. Hier, laten we representatieve kalibratie en functionele lineaire bereiken met betrekking tot beide metaal. Ook geven wij een voorbeeld wanneer de biosensor de resultaten zijn overtuigend (MgII en MnII over Hg biologische beschikbaarheid) en onduidelijk (ZnII over Hg biologische beschikbaarheid).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>7 ml standard vial, rounded interior</td>
			<td>Delta Scientific</td>
			<td>200-007-20</td>
			<td>34 recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vial tray, 21 mm openings</td>
			<td>Delta Scientific</td>
			<td>730-2001</td>
			<td>4 for (4 x 8 grid)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 mm Closure</td>
			<td>Delta Scientific</td>
			<td>600-024-01</td>
			<td>32 recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LID CORNER NOTCH BLK STR CS/50</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Corning 3931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 96- well clear-bottom nonbinding surface microplate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Corning 3651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anaerobic Chamber (glovebox)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>The air in the anaerobic chamber should be (97 % N2 &#177; 2 % and 3 % H2 &#177; 2 %)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Palladium catalyst</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Converts O2 to H2O in the anaerobic chamber. Not required but recommended.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>450 (&#177;10) nM filter for the microplate reader</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 (&#177;10) nM filter for the microplate reader</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anaerobic culture vial (balch tubes) + rubber stoppers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Modified for anaerobic culture tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MA-3000 (mercury analyzer)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH probe</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any pH probe will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical sterile polypropylene centrifuge tubes.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m polyethersulfone syringe filter + syringe</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile/clean glass bottles</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For growth media and standards</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile/clean plastic or PTFE bottles</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For alkali solutions (NaOH/KOH)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents powders: Na2MoO4, Na2SeO4, H3BO3, NaOH, KOH, MnSO4, ZnSO4, CoCl2, NiCl2, ampicillin sodium salt, Difco M9 Minimal Salts, Glucose, MgSO4, Thiamine HCl, NaNO3, l-leucine, l-isoleucine valine, EDTA sodium salt, FeSO4, Sodium Beta-Gylcerophosphate, Mops free acid, (NH4)2SO4, Hg(NO3)2, CdCl2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Milli-Q water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Autoclaved or filter sterilized is fine.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysogeny Broth</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical grade H2SO4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an anaerobic biosensor assay for the detection of mercury and cadmium

Kwik (Hg) biologische beschikbaarheid aan microben is een belangrijke stap naar giftige Hg biomagnificatie in voedsel webs. Cadmium (Cd) transformaties en biologische beschikbaarheid aan bacteriën bepalen het bedrag dat zich in het hoofdvoedsel gewassen ophopen zal. De biodisponibiliteit van deze metalen is afhankelijk van hun soortvorming in oplossing, maar meer in het bijzonder onder zuurstofvrije omstandigheden waar Hg is gemethyleerd aan giftige monomethylmercury (MeHg) en Cd aanhoudt in de rizosfeer. Hele cellen microbiële biosensoren geven een kwantificeerbare signaal als een metaal het cytosol binnenkomt en daarom nuttige tools zijn voor het evalueren van metalen biologische beschikbaarheid. Helaas hebben de meeste biosensing inspanningen tot nu toe is beperkt tot IME omgevingen als gevolg van de beperkte capaciteit van bestaande verslaggever eiwitten te laten functioneren in de afwezigheid van zuurstof. In dit onderzoek presenteren wij onze inspanning om te ontwikkelen en optimaliseren van een geheel-cel biosensor assay staat werking anaëroob dat metalen onder zuurstofvrije omstandigheden in quasi-real-time en binnen enkele uren detecteren kan. We beschrijven hoe de biosensor kan helpen beoordelen hoe chemische variabelen relevant zijn voor het milieu fietsen van metalen beïnvloeden hun biologische beschikbaarheid. Het volgende protocol bevat methoden ter (1) voorbereiding van Hg en Cd normen onder zuurstofvrije omstandigheden, (2) de biosensor bij gebrek aan zuurstof, (3) ontwerp voorbereiden en uitvoeren van een experiment om te bepalen hoe een aantal variabele beïnvloedt Hg of Cd biologische beschikbaarheid, en (4) te kwantificeren en te interpreteren biosensor gegevens. Wij tonen de lineaire bereiken van de biosensoren en bieden voorbeelden laten zien van de methode kunnen onderscheid maken tussen metalen biologische beschikbaarheid en toxiciteit door gebruik te maken van metal-afleidbare zowel constitutieve stammen.

Zodra de pieken van de fluorescentie is gekwantificeerd volgens stap 5.3, het resultaat van de fluorescentie pieken kan worden opgenomen in een grafiek volgens de variabele concentratie illustreren hoe die variabele beïnvloedt de relatieve biologische beschikbaarheid van Hg of Cd. Bijvoorbeeld, zal ijkkromme van fluorescentie over [HgII] uit Figuur 2 figuur 3Agepresenteerde afleidbare gegevens opleveren. Voor HgII kalibratie, de curve zal altijd bevatten 3 componenten voor de Hg-afleidbare stam; de reactie van een drempel van ongeveer 1-2 nM HgII voor fluorescentie signaal productie is lineair evenredig aan [HgII], de lineaire reeks waar 5 nM HgII zullen op een betrouwbare manier altijd in het midden van dat bereik en een plateau waar toenemende [HgII] zal niet langer fluorescentie signaal. Geen verandering in de productie van het signaal op de constitutieve stam toont dat toxiciteit van [HgII] geen afbreuk doet aan de productie van het signaal. Voor CdII in figuur 3Bzijn er altijd 2 componenten voor de afleidbare stam; een lineaire reeks waar 200-300 nM CdII zal op een betrouwbare manier altijd in het midden van het lineaire bereik en een plateau. Een afname van de fluorescentie signaal met toenemende [CdII] blijkt dat hogere concentraties van de Cd giftig voor de cellen zijn en een daling in de productie van afleidbare fluorescentie na het plateau op 1000 nM CdIIkunnen uitleggen. Dus, bij het testen van Hg of Cd biologische beschikbaarheid met betrekking tot een omgevingsvariabele, raden we u aan 5 nM voor HgII en 300 nM voor CdII.
In sommige gevallen signaal productie kan goed worden toegeschreven aan Hg of Cd biobeschikbaarheid, maar in andere gevallen signaal productie kan worden beïnvloed door de variatie in de fysiologische status van de host biosensor cel (bijvoorbeeld het metaal van belang of milieu-omstandigheden getest zijn giftig). In figuur 4A, 5 nM Hg biobeschikbaarheid werd getest over een helling van Zn (0-10 µM). In zowel Hg-afleidbare en constitutieve stammen is er een vergelijkbare daling in signaal met toenemende concentraties van Zn. Daarom kan niet een discrimineren of het signaal uit verminderde biobeschikbaarheid voortvloeit of een gevolg van Zn toxiciteit is. In figuur 4B en 4 C, 5nM Hg biobeschikbaarheid werd getest over een helling van MgII (0-10 mM) en MnII (0-10 µM). Toenemende MgII en MnII concentraties daalde het signaal van de fluorescentie van de afleidbare stam. Aan de andere kant, de constitutieve spanning bleek niet dat een afname van de fluorescentie met toenemende MgII en MnII concentraties (MgII en MnII gunstig zijn voor de cellen in de productie van de FbFp, zoals blijkt uit een toename van de fluorescentie-signaal). Dit toont aan dat de cellen levensvatbaar zijn en de daling van de fluorescentie van de Hg-afleidbare stam het gevolg is van een afname van de biologische beschikbaarheid van Hg. Deze gegevens benadrukt hoe belangrijk het is dat alle biosensor testen om ook constitutieve metingen van algemene cel geschiktheid.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58324/58324fig3.jpg"> Figuur 3: lineaire reeksen van de biosensor met kwik en Cadmium. Maximale fluorescentie gemeten als relatieve fluorescentie eenheden (RFU) ± 1 standaarddeviatie uitgestoten door E. coli NEB5α herbergen van de pUC57merR-Pp (Hg-afleidbare) en pUC19Balch-Pp (Constitutive) met de toevoeging van A) HgII (0-15 nM) en B) CdII (0-1000 nM) onder anaërobe omstandigheden. Fluorescentie was dat het gemiddelde van 3 technische repliceert op 37 ˚C. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58324/58324fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58324/58324fig4.jpg"> Figuur 4: voorbeeld van een twijfelachtig resultaat met zink en een overtuigend resultaat met Magnesium en mangaan. Maximale fluorescentie gemeten als relatieve fluorescentie eenheden (RFU) ± 1 standaarddeviatie uitgestoten door E. coli NEB5α herbergen van de pUC57merR-Pp (Hg-afleidbare) en pUC19Balch-Pp (Constitutive) met de toevoeging van A) ZnII (0-10 µM), B) MgII (0-10 mM), en C) MnII (0-10 µM) onder anaërobe omstandigheden. [HgII] is ingesteld op 5 nM voor alle behandelingen en fluorescentie was het gemiddelde van 3 technische wordt gerepliceerd op 37 ˚C. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58324/58324fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>

Watch this Scientific Journal Video about An Anaerobic Biosensor Assay for the Detection of Mercury and Cadmium at JoVE.com

An Anaerobic Biosensor Assay for the Detection of Mercury and Cadmium

Hier presenteren we een protocol voor het gebruik van een anaërobe geheel cellen microbiële biosensor te evalueren van hoe verschillende milieu variabelen beïnvloeden de biodisponibiliteit van Hg en Cd voor bacteriën in een zuurstofvrije omgeving.

Een anaërobe Biosensor Assay voor het opsporen van kwik en Cadmium

Mercury (Hg) bioavailability to microbes is a key step to toxic Hg biomagnification in food webs. Cadmium (Cd) transformations and bioavailability to ...

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen met betrekking tot de biogeochemische fietsen van cadmium en kwik, zoals hoe verschillende omgevingsvariabelen hun biologische beschikbaarheid voor bacteriën beïnvloeden. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het biedt quasi real-time biobeschikbaarheid gegevens en levensvatbare cellen, ongeacht de aanwezigheid van zuurstof. Over het algemeen individuen nieuw op deze methode zal worstelen, want er zijn veel tijd gevoelige stappen die zeer nauwgezette aandacht voor detail vereisen.Het aantonen van de procedure zal Ben zijn, een student van mijn lab. Ter voorbereiding op de test, haal de kwik inducible biosensor en de constitutief uitgedrukte biosensor uit een min 80 graden Celsius cryo voorraad. Plaats de cellen op Lysogene bouillonplaten met 120 microgram per milliliter ampicilline.Kweek de plaatculturen in een couveuse bij 37 graden Celsius 's nachts. Tussen 4:30 en 5 p.m. inenten een cultuur in tien milliliter LB met ampicilline en groeien 's nachts op 37 graden Celsius met schudden bij 220 rpm.Om negen en tien uur een.m. de volgende ochtend brengen de cultuur evenals de eerder voorbereide groeimedium in de anaërobe kamer. Voeg vervolgens acht milliliter vers groeimedium en 210 microgram per milliliter ampicilline toe in een steriele balchbuis.Verzamel nu twee milliliter van de 's nachts geteelde cultuur en breng over in een twee milliliter microcentrifuge buis. Na het centrifugeren op 10,000 RCF gedurende 90 seconden, verwijder de supernatant en resuspend in twee milliliter vers groeimedium. Voeg vervolgens de geresuspended cultuur toe aan de balchbuis met acht milliliter vers groeimedium en ampicilline.Plaats met behulp van steriele techniek voorzichtig een rubberen stop op de balchbuis voordat u deze uit de anaerobe kamer haalt. Plaats de buis vervolgens in een couveuse en kweek anaëroob op 37 graden Celsius met schudden bij 220 rpm. Tussen drie en vijf uur .m.breng de balch buis met de cultuur, een nieuwe steriele balch buis, en het groeimedium in de anaerobe kamer. Voeg 100 microliter van de cultuur toe aan 10 milliliter vers groeimedium met ampicilline in de steriele balchbuis. Plaats met behulp van steriele techniek voorzichtig een rubberen stop op de balchbuis.Verwijder de buis uit de anaerobe kamer voordat u deze 's nachts bij 37 graden Celsius laat groeien met schudden bij 220 tpm. Tussen negen en tien a.m de volgende dag, breng de cultuur en het groeimedium terug naar de anaerobe kamer.Voeg opnieuw acht milliliter groeimedium en ampicilline toe in een steriele balchbuis. Breng twee milliliter van de 's nachts gegroeide cultuur in een twee milliliter microcentrifuge buis. Na centrifugatie zoals voorheen, verwijder de supernatant en resuspend de cellen in twee milliliter van vers groeimedium.Voeg vervolgens de geresuspendeerde cultuur toe aan de balchbuis met het verse groeimedium en ampicilline. Plaats met behulp van steriele techniek voorzichtig een rubberen stop op de balchbuis. Haal het uit de kamer en groeien anaerobically op 37 graden Celsius met schudden op 220 rpm.Monitor de groei van de cultuur met behulp van een spectrofotometer door de cultuur te vortexen en vervolgens de optische dichtheid te meten op 600 nanometer of OD600. Na drie tot vier uur van de verwachte groei, moet de cultuur een OD600 van 6 bereiken. Breng nu de buis in de anaerobe kamer en breng de cultuur in twee twee milliliter micro centrifuge buizen.Na centrifugatie zoals vóór verwijder de supernatant en resuspend elke cel gehemelte in twee milliliter van verse blootstelling medium. Herhaal deze wasstap eens om elk spoor van het groeimedium te verwijderen. Combineer nu beide microcentrifugebuizen van celkweek in een zeven milliliter PTFE standaard flacon om de biosensorvoorraad te verkrijgen voor gebruik in de blootstellingstest.Controleer voor aanvang van het experiment de anaerobe monitor om ervoor te zorgen dat er geen zuurstof in de anaerobe kamer zit. Ontwerp de plaat lay-out volgens een 96 goed sjabloon. Om experimenten uit te voeren in technische replica's van drie zal dit zorgen voor 32 verschillende behandelingen, die het best wordt vertegenwoordigd met een vier bij acht raster om de flesjes op te zetten.Stel de vier bij acht raster volgens de testplaat lay-out. Plaats vervolgens zeven milliliter PTFE standaard flesjes in de lade. Flacons mogen alleen worden behandeld door de buitenkant van de flacon te manipuleren.Voeg het belichtingsmedium volume toe aan elke flacon die overeenkomt met elke behandeling. Voeg aan elke flacon het overeenkomstige volume toe van de te testen chemische variabele volgens de plaatlay-out. Voeg nu nitraat toe aan elke flacon, zodat de concentratie 200 micromolar is.Sluit deze stap uit voor constitutieve biosensor behandeling blanks. Om kwik toe te voegen aan de flesjes, neem eerst de vier tot acht micromolar voorraad en schud goed. Verdun de oplossing en het blootstellingsmedium in een PTFE-flacon van zeven milliliter tot een concentratie van 100 tot 250 nanomolar om een werkende kwikoplossing te maken.Voeg van deze werkoplossing kwik toe aan de benodigde flesjes volgens de plaatindeling. Na toevoeging van het kwik of cadmium handmatig schud de plaat in een orbitale beweging. Het experiment kan nu worden onderbroken, afhankelijk van de tijd die nodig is voor kwik of cadmium om in oplossing te speciaten.Wanneer het experiment wordt hervat, voorzichtig pipette biosensor voorraad heen en weer om homogeniteit te garanderen. Voeg vervolgens 100 microliter van de biosensorvoorraad toe aan elke flacon en schud de plaat handmatig zoals voorheen. Warm de plaatlezer op tot 37 graden Celsius en zet tien uur lang een kinetische run op met leest om de twee punten vijf tot vijf minuten.Een orbitale schudden tussen de metingen. Stel de run op om fluorescentiemetingen te doen met een fluorescentie-excitatie van 440 nanometer en een emissie van 500 nanometer. Nu pipette 200 microliters van elke PTFE flacon in de vier bij acht raster in de overeenkomstige putten van de 96 put plaat.Pipet vijf keer heen en weer voordat elke 200 microliters worden overgedragen. In plaats van het weggooien van de pipet tip, laat de pipet tip in de PTFE flacon bij te houden van pipetting vooruitgang. Plaats de 96 putplaat in de lade van de plaatlezer.Plaats vervolgens het deksel op de 96 put plaat en begin met de test. Hier zijn representatieve resultaten met gecorrigeerde fluorescentiegegevens als functie van de tijd. Fluorescentie wordt getoond met toenemende concentraties kwik tot de induceerbare biosensor.Alle waarden zijn leeg aan de geen kwikcontrole. De fluorescerende pieken kunnen worden gekwantificeerd om het fluorescerende signaal te tonen als functie van kwik of cadmiumconcentratie. Voor zowel de inducible als de constitutieve biosensoren moet de kwik- of cadmiumconcentratie in het midden van het lineaire bereik van de induceerbare sensoren worden gebruikt voor het testen van variabelen.Hier zijn voorbeelden van een niet overtuigend resultaat met zink. En een sluitend resultaat met magnesium en mangaan op kwik biologische beschikbaarheid aan de biosensor. Het resultaat met zink is niet overtuigend omdat de constitutieve fluorescentie vervalt met induceerbare fluorescentie die toxiciteit aangeeft.Tijdens een poging tot deze procedure is het belangrijk om te onthouden om de concentraties van cadmium of kwik in te voeren, omdat deze worden gebruikt om de biosensor te kalibreren. Na deze procedure kunnen andere methoden worden uitgevoerd, zoals thermodynamische modellering van waterige systemen om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals hoe specifieke chemische soorten kwik of cadmium hun biologische beschikbaarheid beïnvloeden. Vergeet niet dat het werken met cadmium en kwik en sterke zuren zoals zwavelzuur zeer gevaarlijk kan zijn en voorzorgsmaatregelen zoals het dragen van persoonlijke beschermingsmiddelen moeten altijd worden genomen tijdens het uitvoeren van deze procedure.Na de ontwikkeling van deze techniek maakte de weg vrij voor onderzoekers op het gebied van milieumicrobiologie om quasi real-time anaerobe kwik of cadmiumbiobes te onderzoeken.

Research

JoVE Journal

Environment

Evaluation of Integrated Anaerobic Digestion and Hydrothermal Carbonization for Bioenergy Production

Evaluatie van de geïntegreerde anaërobe vergisting en Hydrothermal Carbonisatie voor bio-

Lignocellulosic biomass is one of the most abundant yet underutilized renewable energy resources. Both anaerobic digestion (AD) and hydrothermal ...

Detection of Foodborne Bacterial Pathogens from Individual Filth Flies

Detectie van Foodborne bacteriële pathogenen uit Individuele Filth Flies

There is unanimous consensus that insects are important vectors of foodborne pathogens. However, linking insects as vectors of the pathogen causing a ...

Development of Sulfidogenic Sludge from Marine Sediments and Trichloroethylene Reduction in an Upflow Anaerobic Sludge Blanket Reactor

Ontwikkeling van Sulfidogenic Slib van mariene sedimenten en Trichloorethyleen Vermindering van een Upflow Anaerobic Sludge Blanket Reactor

The importance of microbial sulfate reduction relies on the various applications that it offers in environmental biotechnology. Engineered sulfate ...

Spotting Cheetahs: Identifying Individuals by Their Footprints

Spotting Cheetahs: identificeren van individuen door hun voetsporen

The cheetah (Acinonyx jubatus) is Africa's most endangered large felid and listed as Vulnerable with a declining population trend by the IUCN1. It ranges ...

Experimental Column Setup for Studying Anaerobic Biogeochemical Interactions Between Iron (Oxy)Hydroxides, Trace Elements, and Bacteria

Experimental Column Setup for Studying Anaerobic Biogeochemical Interactions Between Iron OxyHydroxides, Trace Elements, and Bacteria

Experimentele kolominstelling voor het bestuderen van anaërobe biogeochemische interacties tussen ijzer (Oxy) hydroxiden, sporenelementen en bacteriën

Fate and speciation of trace elements (TEs), such as arsenic (As) and mercury (Hg), in aquifers are closely related to physio-chemical conditions, such as ...

Fluorescent Paper Strips for the Detection of Diesel Adulteration with Smartphone Read-out

Fluorescerend papier stroken voor de detectie van Diesel vervalsing met Smartphone uitlezing

Three fluorescent molecular rotors of 4-dimethylamino-4-nitrostilbene (4-DNS) were investigated for their potential use as viscosity probes to indicate ...

A Precise and Autonomous System for the Detection of Insect Emergence Patterns

Een precieze en autonome systeem voor het opsporen van insecten ontstaan patronen

Existing systems to measure insect emergence patterns have limitations; they are only partially automated and are limited in the maximum number of ...

Detection of Tilapia Lake Virus Using Conventional RT-PCR and SYBR Green RT-qPCR

Detectie van Tilapia Lake Virus met behulp van conventionele rechts-PCR en SYBR groene RT-qPCR

The aim of this method is to facilitate the fast, sensitive and specific detection of Tilapia Lake Virus (TiLV) in tilapia tissues. This protocol can be ...

An Induction System for Clustered Stomata by Sugar Solution Immersion Treatment in Arabidopsis thaliana Seedlings

An Induction System for Clustered Stomata by Sugar Solution Immersion Treatment in Arabidopsis thaliana Seedlings

Een inductie systeem voor geclusterde stoma door suiker oplossing onderdompeling behandeling in Arabidopsis thaliana zaailingen

Stomatal movement mediates plant gas exchange, which is essential for photosynthesis and transpiration. Stomatal opening and closing are accomplished by a ...

Cultivation of Green Microalgae in Bubble Column Photobioreactors and an Assay for Neutral Lipids

Teelt van groene microalgen in Bubble kolom Photobioreactors en een kwantitatieve analyse voor neutrale lipiden

There is significant interest in the study of microalgae for engineering applications such as the production of biofuels, high value products, and for the ...