Name: an anaerobic biosensor assay for the detection of mercury and cadmium
Uploaded: 2018-12-17T13:00:00
Duration: 9 min 33 s
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Nous tenons à remercier les commentaires de deux réviseurs anonymes bien membres du laboratoire du Poulain pour discussion perspicace sur le développement de l’anaérobie biocapteur. Cette étude financée par une bourse de nouveau chercheur de la Province d’Ontario et d’une subvention à la découverte et un supplément d’accélérateur de Sciences naturelles et génie conseil de recherches à A.J.P..

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Les biocapteurs microbiens sont des outils utiles pour identifier les mécanismes par lesquels les métaux interagissent avec les microbes. Nous décrivons ici une méthode qui permet de quantifier en anaérobiose HgII et CdII biodisponibilité à une cellule hôte gram négatif (Escherichia coli) et de donner un résultat quantifiable en quelques heures. Un des atouts majeurs de ce protocole est qu’il permet un contrôle étendu de la spéciation des métaux dans le milieu de l’exposition en évitant les ligands de forte liaison ou composants qui peuvent conduire à la précipitation de métaux. Spéciation des métaux a été modélisée et testée dans ce milieu d’exposition à l’aide de PHREEQC17, mais d’autres logiciels de la spéciation des métaux peut être déployé. Dans le cas d’aucun ajout de ligands, Hg spéciation est censée être présent comme 97 % Hg(OH)2 et 3 % Hg (NH3)22 +, tandis que la spéciation Cd sera présenter que 59 % Cd-β-glycérophosphate, 25 % Cd2 +et 16 % CdSO4. À l’aide d’un logiciel de modélisation thermodynamique simple, l’utilisateur peut concevoir des supports d’exposition et d’essai pour la biodisponibilité du métal d’intérêt. En outre, la cellule-hôte biocapteur (NEB5αd’e. coli ) est viable sur une large gamme de pH (5 à 8,5) et de la concentration de NaCl (0-0,55 M)17.
Méthylation de l’HG est un processus anaérobie, et le protocole décrit dans la présente étude n’a pas une exigence pour l’oxygène, permettant une description plus précise du métabolisme anaérobie sur la biodisponibilité des métaux. Ceci est important car la présence d’oxygène altère gene expression profiles48,49 et par conséquent, le potentiel transport voies ; par conséquent, cette méthode présente un avantage par rapport à actuellement existant des solutions de rechange aérobies. La construction de biodétection présentée ici est potentiellement utilisable avec d’autres hôtes anaérobies qui pourraient être plus pertinents pour la méthylation du mercure (par exemple Geobacter, Desulfovibrio), mais peut-être moins docile qu’e. coli. Une limitation du courant de l’approche présentée ici est que notre limite de détection n’a pas encore atteint les niveaux de particules, contrairement aux actuels systèmes aérobies4,19,37. Il est toutefois important de noter que pour atteindre ces limites de détection faible plusieurs mesures doivent être prises44: J’ai) addition de ligand est nécessaire pour assurer que Hg reste en solution et ne pas s’adsorber sur la paroi cellulaire microbienne (Hg sera irréversible lié aux dans la cellule des thiols surfaces empêchant sa biodisponibilité25,27; voir la réponse de seuil pour le mercure dans la Figure 3 a), ii) modifications de la densité cellulaire, ou iii) modifier la construction génétique afin d’inclure des protéines de transport du mer-opéron ( merT et merP), le flux croissant de Hg à l’intérieur de la cellule50,51. Ces modifications seraient bénéfiques dans la détection de faibles concentrations de mercure, mais pas nécessairement idéale lors de l’évaluation des situations pertinentes pour l’environnement. Considérant que la précédente biocapteurs cadmium existent principalement comme une « preuve de principe », ils ont été conçus dans un milieu complexe qui ne permettre pas l’enquêteur évaluer le rôle de la spéciation, biodisponibilité41,42, 43 , 44.
Le biocapteur est un outil incroyablement utile pour déterminer les mécanismes dans lesquels les espèces métalliques sont biodisponibles. Parce que l’organisme hôte n’est pas un Hg-methylator, il est utilisable uniquement pour élaborer un modèle pour comment Hg peut inscrire des bactéries à gram négatif et pas une justification définitive pour comment Hg-methylators acquièrent Hg. D’autres méthodes existent pour déterminer la biodisponibilité du Hg, telles que la méthylation, comme un résultat de l’absorption ou l’utilisation d’une démarche de bilan massique10,15,20,45,46. Cela étant dit, la méthode présentée ici offre l’avantage de données en temps quasi réel sur la biodisponibilité en cellules viables. Nous ne recommandons pas que cette méthode permettant de quantifier les concentrations totales de mercure ou Cd dans une matrice d’environnementale. Malgré l’utilisation de biocapteurs pour déterminer les concentrations de métaux dans l' environnement36, beaucoup de méthodes standard plus facilement accessibles est disponibles tels que l’ICP-MS, FAAS (pour l’analyse de Cd) ou spectroscopie d’absorption atomique de vapeur froide (pour Hg analyse). Le biocapteur peut cependant être utilisée pour déterminer si une matrice donnée environnementale a le potentiel d’améliorer ou d’entraver la biodisponibilité ; Ceci est réalisé en effectuant des ajouts dosés.
Le pH du milieu exposition peut-être être modifié à n’importe où au sein de la gamme de 5 et 8,5, pourvu que l’acide libre MOPS (tampon) est échangé avec un autre acide libre d’un tampon avec le pKa approprié (voir liste des tampons appropriées (Ferreira et al. (2015) 47) et ajusté avec KOH au pH approprié quand faire les médias de l’exposition. En outre, la méthode n’est pas limitée aux Hg et Cd, mais pourrait être étendue à d’autres métaux à l’aide d’autres régulateurs de la transcription.
L’essai d’exposition peut-être être modifié pour étudier l’influence d’autres accepteurs d’électrons comme O2 et fumarate sur la biodisponibilité de Hg ou Cd. Des modifications mineures à la méthode d’utiliser O2 et fumarate comme accepteurs d’électrons sont disponibles sur demande.
En résumé, nous tenons à mettre l’accent sur les points suivants : j’ai) il est impératif que les concentrations de stocks de Cd et Hg sont connues à l’étape 2, que ceux-ci seront utilisés pour calibrer le biocapteur. II) le jour de l’exposition, la croissance des cellules doit être arrêtée à une OD600 de 0,6 (± 0,1) et que les soins sont franchie avec la resuspendant les cultures de cellules, comme le biocapteur est calibré à la densité de cette cellule. III) enfin, il est important que le milieu de l’exposition fait méticuleusement le jour de l’exposition. Pour assurer le succès du protocole, des cultures multiples doivent être cultivées en même temps (pour contourner la possibilité d’un échec de croissance) et le milieu de culture doit être refait chaque semaine (pour contourner la Métastabilité des médias et la possibilité de contamination). Il convient également de noter que les réplicats biologiques (cultures de cellules multiples) expriment variabilité lorsqu’il s’agit de la production de signaux. Bien que les réponses fluorescents peuvent varier d’une culture, les tendances fluorescents en réponse à une variable donnée reste le même tout au long de nombreuses répétitions biologiques.

Mercure (Hg) est un polluant global et sa biodisponibilité en Hg microbes de méthylation est le premier pas vers sa bioamplification dans les réseaux trophiques et ses possibles effets neurotoxiques chez les humains et la faune1. On pense actuellement que la méthylation Hg microbienne est un processus intracellulaire qui exige : i) les espèces de Hg à être biodisponibles2,3,4,5,6,7 et ii) pour la cellule physiologiquement capable de méthylation Hg8,9,10. Cadmium (Cd) s’accumule dans les organismes, mais fait pas la bioamplification dans les réseaux trophiques et est largement utilisé dans les processus industriels et commerciaux qui causent fréquemment des expositions aiguës dans les gens et l' environnement11. Bien que les microbes jouent plusieurs rôles clés dans le devenir du mercure dans l’environnement, la plupart des études sur la géochimie des Cd et écotoxicologie concentrent aux eucaryotes microbiens12. La consommation de produits agricoles (p. ex., riz) est la principale source d’exposition directe au cadmium ; dans ce cas, la biodisponibilité du Cd aux microbes de la rhizosphère influence directement le montant plantes peuvent s’accumuler13.
Les voies de transport Hg sont complexes et impliquent probablement un transport actif étape14. Lorsqu’un transporteur est impliqué, des travaux récents suggèrent que HgII utilise un ZnII ou MnII transporteur7,15,16,17. Alors que l’hypothèse CdII pour être transportés accidentellement dans le cytosol, par des voies de transport métal divalent (particulièrement MnII ou ZnII), mécanismes de CdII de transport intérieur, les cellules demeurent sentier de transport spéculative et Cd spécifique n’a été identifié13,18. Quelle que soit la nature des transporteurs concernés, trois facteurs mécanistes finalement déterminent la capacité des métaux à pénétrer dans une cellule : i) la spéciation des métaux dans la solution2,6,15, 16 , 17 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23, ii) les propriétés biophysiochemical de la membrane cellulaire17,24,25,26,27,28,29 ,30,31et iii) la capacité pour le métal accéder à un transport site7,32. Cadmium et le mercure sont peu susceptibles d’existe sous forme d’ions libres dans des conditions physiologiquement pertinentes microbiennes en raison de leur forte affinité pour dissous Organic Matter (DOM), chélation des contaminants (p. ex., EDTA), ou réduit soufre moitiés33, 34,35 (CdII peut exister comme un libre ion ou formulaire de paires d’ions en l’absence de ces ligands). Il y a un manque de méthodes efficaces pour déterminer comment ces espèces métalliques sont biodisponibles dans les conditions pertinentes à leur sort dans l’environnement. Par exemple, Hg est méthylée en vertu des conditions d’anaérobiose14et cadmium et le mercure sont des métaux mous (ou classe B cations), exigeant que leur spéciation fassent dans des conditions qui préservent l’intégrité des groupes du soufre réduit.
Les biocapteurs microbiens sont des cellules bactériennes qui émettent un signal quantifiable en réponse aux concentrations intracellulaires d’un métal, dans ce cas Hg ou un Cd. À ce titre, ils sont les outils idéaux pour comprendre comment les métaux dans une cellule36, sous réserve que les conditions d’exposition sont soigneusement contrôlées pour. Biocapteurs Hg contiennent généralement des fusions de gènes entre les circuits réglementaires du mer-opéron (y compris gènes codant pour le régulateur de la transcription Mathieu, ainsi que l’opérateur et le promoteur, régions de l’opéron) et la déclaration des gènes (par exemple, Lux, gfp, lac gènes). Lorsque le mercure est présent dans le cytoplasme, elle se liera à MerR, résultant dans la transcription des gènes considérées et ultérieures signal production19,37. Biocapteurs de Cd spécifiques sont généralement conçues à l’aide de la cadC, cadAC, zntA ou zntR codé de régulateurs de transcription38, mais il est à noter que MerR a une affinité plus faible, et pourtant quantifiable à Cd5. En raison de la restriction aérobie de la plupart couramment protéines journaliste luminescents ou fluo, jusqu'à ce que les biocapteurs microbiens récemment resta incapables d’offrir des aperçus de la biotransformation des métaux dans des conditions anoxiques. Cela rend détection anaérobie de la biodisponibilité des métaux très difficile sur une gamme des conditions pertinentes à leur devenir dans l’environnement, spécifiquement en présence d’oxydo-réduction des ligands sensibles (p. ex., sulfure et thiols)4, 5 , 39.
Pour atténuer l’obstacle méthodologique de vivre d’imagerie en l’absence d’oxygène, Drepper et al. (2007) ont mis au point une protéine fluorescente axée sur la flavine (FbFp), basé sur le domaine de tension légère oxygène de protéine SB2 de P. putida. Cette famille de protéines est en mesure de fluorescence en l’absence d’oxygène40. S’appuyant sur les travaux de Drepper et al., notre laboratoire a conçu un biocapteur anaérobique permettant l’étude de la biodisponibilité de l’Hg dans des conditions oxiques et anoxiques et sur une large gamme de salinité 17. Dans le présent document, nous décrivons comment préparer et utiliser le biocapteur de tester l’influence des variables environnementales sur la biodisponibilité de Hg ou Cd. Bien que nous avons développé le biocapteur pour HgII, nous avons choisi de réaliser des expériences avec CdII comme un moyen d’attirer l’attention du lecteur sur le fait que biocapteurs peuvent également répondre à des stresseurs multiples qui sont susceptibles de survenir conjointement dans l’environnement matrices ; dans ce cas le CdII a été étudiée car il est connu pour lier à l’autorité de régulation transcriptionnelle MerR5. Ici, nous montrons étalonnage représentative et fonctionnelle linéaire varie en ce qui concerne l’autre métal. Nous donnons aussi un exemple lorsque résultats du biocapteur est concluants (MgII et MnII sur la biodisponibilité de Hg) et non concluant (ZnII sur la biodisponibilité de Hg).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>7 ml standard vial, rounded interior</td>
			<td>Delta Scientific</td>
			<td>200-007-20</td>
			<td>34 recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vial tray, 21 mm openings</td>
			<td>Delta Scientific</td>
			<td>730-2001</td>
			<td>4 for (4 x 8 grid)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 mm Closure</td>
			<td>Delta Scientific</td>
			<td>600-024-01</td>
			<td>32 recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LID CORNER NOTCH BLK STR CS/50</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Corning 3931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 96- well clear-bottom nonbinding surface microplate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Corning 3651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anaerobic Chamber (glovebox)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>The air in the anaerobic chamber should be (97 % N2 &#177; 2 % and 3 % H2 &#177; 2 %)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Palladium catalyst</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Converts O2 to H2O in the anaerobic chamber. Not required but recommended.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>450 (&#177;10) nM filter for the microplate reader</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 (&#177;10) nM filter for the microplate reader</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anaerobic culture vial (balch tubes) + rubber stoppers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Modified for anaerobic culture tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MA-3000 (mercury analyzer)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH probe</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any pH probe will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical sterile polypropylene centrifuge tubes.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m polyethersulfone syringe filter + syringe</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile/clean glass bottles</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For growth media and standards</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile/clean plastic or PTFE bottles</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For alkali solutions (NaOH/KOH)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents powders: Na2MoO4, Na2SeO4, H3BO3, NaOH, KOH, MnSO4, ZnSO4, CoCl2, NiCl2, ampicillin sodium salt, Difco M9 Minimal Salts, Glucose, MgSO4, Thiamine HCl, NaNO3, l-leucine, l-isoleucine valine, EDTA sodium salt, FeSO4, Sodium Beta-Gylcerophosphate, Mops free acid, (NH4)2SO4, Hg(NO3)2, CdCl2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Milli-Q water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Autoclaved or filter sterilized is fine.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysogeny Broth</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical grade H2SO4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an anaerobic biosensor assay for the detection of mercury and cadmium

Biodisponibilité de mercure (Hg) aux microbes est une étape clé pour toxiques Hg bioamplification dans les réseaux trophiques. Les transformations de cadmium (Cd) et de la biodisponibilité de bactéries contrôlent la quantité qui s’accumulent dans les cultures vivrières de base. La biodisponibilité de ces métaux est tributaire de leur spéciation en solution, mais plus particulièrement dans des conditions anoxiques où Hg est méthylé de monomethylmercury toxique (MeHg) et Cd persiste dans la rhizosphère. Cellule entière biocapteurs microbiens donnent un signal quantifiable quand un métal entre le cytosol et est donc des outils utiles pour évaluer la biodisponibilité des métaux. Malheureusement, la plupart des efforts de biodétection ont jusqu'à présent été limités aux environnements oxiques due à la capacité limitée des protéines existantes de reporter à la fonction en l’absence d’oxygène. Dans cette étude, nous présentons nos efforts visant à développer et optimiser un dosage de biocapteur cellule entière capable de fonctionner en anaérobiose qui peut détecter des métaux dans des conditions anoxiques en temps quasi réel et quelques heures. Les auteurs décrivent comment le biocapteur peut aider à évaluer comment chimiques variables pertinentes pour les cycles environnementaux de métaux affecte leur biodisponibilité. Le protocole suivant inclut des méthodes pour (1) préparer les Hg et normes Cd dans des conditions anoxiques, (2) préparent le biocapteur en l’absence d’oxygène, (3) conception et exécutent une expérience pour déterminer comment une série de variable affecte la biodisponibilité Hg ou Cd et (4) pour quantifier et interpréter les données du biocapteur. Nous montrent les chaînes linéaires des biocapteurs et fournissent des exemples montrant la capacité de la méthode de distinguer entre la toxicité et la biodisponibilité des métaux en utilisant des souches fois métal-inductible et constitutives.

Une fois que les pics de fluorescence ont été quantifiés selon l’étape 5.3, le résultat des pics de fluorescence peut être représenté graphiquement selon la concentration variable qui illustrent comment cette variable affecte la biodisponibilité relative de Hg ou Cd. Par exemple, la courbe d’étalonnage de la fluorescence sur [HgII] Figure 2 permettra d’obtenir les données inductibles présentées dans la Figure 3 a. Pour HgII étalonnage, la volonté de courbe toujours contenir 3 composants pour la souche inductible par Hg ; une réponse de seuil d’environ 1 à 2 nM HgII avant la production de signal de fluorescence est linéairement proportionnelle à [HgII], la gamme linéaire où 5 nM HgII sera sûrement toujours au centre de cette plage et un plateau où augmenter [HgII] n’augmente plus le signal de fluorescence. Aucun changement dans la production du signal sur la souche constitutive n’indique que la toxicité du [HgII] n’affecte pas la production du signal. CDII dans la Figure 3 b, il y a toujours 2 composants pour la souche inductible ; une gamme linéaire où les 200-300 nM CdII sera sûrement toujours dans le centre de la gamme linéaire et un plateau. Une diminution de signal de fluorescence avec une augmentation [CdII] montre que des concentrations plus élevées de Cd sont toxiques pour les cellules et peuvent expliquer une baisse de la production inductible fluorescence après le plateau à 1000 nM CdII. Par conséquent, lorsque vous testez une biodisponibilité Hg ou un Cd par rapport à une variable d’environnementale, nous vous suggérons d’utiliser 5 nM pour HgII et 300 nM pour le CdII.
Dans certains cas, production du signal peut être correctement attribuée à biodisponibilité Hg ou Cd, mais dans d’autres cas, production du signal peut être affectée par la variation de l’état physiologique de l’hôte de cellule de biocapteurs (par exemple, le métal d’intérêt ou les conditions environnementales testées sont toxiques). Dans la Figure 4 a, 5 biodisponibilité de Hg nM a été testé sur un gradient de Zn (0-10 µM). En Hg-inductible et souches constitutives, il y a une diminution semblable au signal avec augmentation des concentrations de Zn. Par conséquent, on ne peuvent pas distinguer si le signal résultant d’une biodisponibilité réduite ou est le résultat de la toxicité du Zn. Dans la Figure 4 b et 4C, biodisponibilité de Hg de 5 nm a été testée sur un gradient de MgII (0-10 mM) et MnII (0-10 µM). Augmentation de MgII et MnII concentration diminue le signal de fluorescence de la souche inductible. En revanche, la souche constitutive n’a pas montré une diminution de fluorescence avec une augmentation de MgII et MnII concentration (MgII et MnII sont bénéfiques pour les cellules dans la production de la FbFp, comme en témoigne une augmentation du signal de fluorescence). Cela démontre que les cellules sont viables et la diminution de la fluorescence de la souche Hg-inductible résulte d’une diminution de biodisponibilité de Hg. Ces données souligne combien il est important pour tous les essais de biocapteurs fournir également des mesures constitutives de la condition physique de cellule.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58324/58324fig3.jpg"> Figure 3 : gammes linéaires du biocapteur avec Mercure et le Cadmium. Fluorescence maximale mesurée comme la fluorescence relative unités (RFU) ± 1 écart-type émis par e. coli NEB5α hébergeant le pUC57merR-Pp (Hg-inductible) et pUC19Balch-(Constitutive) avec l’ajout de A) HgII (0-15 nM) et B) CdII (0-1 000 nM) dans des conditions anaérobies. Fluorescence est que la moyenne des 3 techniques réplique à 37 ° c. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58324/58324fig3large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58324/58324fig4.jpg"> Figure 4 : exemple d’un résultat non concluant avec le Zinc et un résultat concluant avec magnésium et manganèse. Fluorescence maximale mesurée comme la fluorescence relative unités (RFU) ± 1 écart-type émis par e. coli NEB5α hébergeant le pUC57merR-Pp (Hg-inductible) et pUC19Balch-(Constitutive) avec l’ajout de A) ZnII (0-10 µM), B) MgII (0-10 mM), et C) MnII (0-10 µM) dans des conditions anaérobies. [HgII] a été fixé à 5 nM pour tous les traitements et la fluorescence est la moyenne des 3 répétitions techniques à 37 ° c. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58324/58324fig4large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>

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An Anaerobic Biosensor Assay for the Detection of Mercury and Cadmium

Nous présentons ici un protocole pour utiliser un biocapteur microbiens anaérobie de cellules entières pour évaluer comment les différentes variables environnementales affectent la biodisponibilité du Hg et Cd de bactéries en milieu anoxique.

Un dosage anaérobie biocapteurs pour la détection du mercure et du Cadmium

Mercury (Hg) bioavailability to microbes is a key step to toxic Hg biomagnification in food webs. Cadmium (Cd) transformations and bioavailability to ...

Cette méthode peut aider à répondre aux questions clés concernant le cycle biogéochimique du cadmium et du mercure, comme la façon dont différentes variables environnementales influent sur leur biodisponibilité aux bactéries. Le principal avantage de cette technique est qu’elle offre des données de biodisponibilité en temps quasi réel et des cellules viables indépendamment de la présence d’oxygène. Généralement, les personnes nouvelles à cette méthode auront du mal parce qu’il ya beaucoup de temps étapes sensibles qui nécessitent une attention très méticuleuse aux détails.La démonstration de la procédure sera Ben, un étudiant diplômé de mon laboratoire. Pour se préparer à l’analyse, récupérez le biocapteur inductible au mercure et le biocapteur exprimé de façon constitutive à partir d’un stock cryo de moins 80 degrés Celsius. Plaquez les cellules sur des plaques de bouillon lysogène contenant 120 microgrammes par millilitre d’ampicilline.Cultivez les cultures de plaques dans un incubateur à 37 degrés Celsius pendant la nuit. Entre 16 h 30 et 17 h.m. inoculent une culture en dix millilitres de LB avec de l’ampicilline et poussent toute la nuit à 37 degrés Celsius avec des secousses à 220 rpm.Entre neuf et dix heures .m le lendemain matin, apportez la culture ainsi que le milieu de croissance précédemment préparé dans la chambre anaérobie. Ajouter ensuite huit millilitres de milieu de croissance frais et 210 microgrammes par millilitre d’ampicilline dans un tube de balles stérile.Maintenant, recueillir deux millilitres de la culture cultivée pendant la nuit et transférer dans un tube de micro centrifugeuse de deux millilitres. Après avoir centrifugé à 10 000 RCF pendant 90 secondes, retirez le supernatant et résépendez en deux millilitres de milieu de croissance frais. Ajoutez ensuite la culture résuspendue au tube de balles contenant huit millilitres de milieu de croissance frais et d’ampicilline.À l’aide d’une technique stérile, placez soigneusement un bouchon en caoutchouc sur le tube de balles avant de l’enlever de la chambre anaérobie. Placez ensuite le tube dans un incubateur et développez-le anaérobiement à 37 degrés Celsius en secouant à 220 rpm. Entre trois et cinq p.m.apporter le tube de balch avec la culture, un nouveau tube stérile de balch, et le milieu de croissance dans la chambre anaérobie. Ajouter 100 microlitres de la culture à 10 millilitres de milieu de croissance frais avec de l’ampicilline dans le tube stérile de balch. À l’aide d’une technique stérile, placez soigneusement un bouchon en caoutchouc sur le tube de balles.Retirez le tube de la chambre anaérobie avant de le faire pousser pendant la nuit à 37 degrés Celsius en secouant à 220 rpm. Entre neuf et dix .m, le lendemain, transférez la culture et le milieu de croissance à la chambre anaérobie.Ajouter à nouveau huit millilitres de milieu de croissance et d’ampicilline dans un tube stérile de balles. Transférer deux millilitres de la culture cultivée pendant la nuit dans un tube de micro centrifugeuse de deux millilitres. Après centrifugation comme avant, enlever le supernatant et resuspendre les cellules en deux millilitres de milieu de croissance frais.Ajoutez ensuite la culture résuspendée au tube de balles contenant le milieu de croissance frais et l’ampicilline. À l’aide d’une technique stérile, placez soigneusement un bouchon en caoutchouc sur le tube de balles. Retirez-le de la chambre et cultivez anaérobiement à 37 degrés Celsius en secouant à 220 rpm.Surveillez la croissance de la culture à l’aide d’un spectrophotomètre en tourbillonnant la culture, puis en mesurant la densité optique à 600 nanomètres ou OD600. Après trois à quatre heures de croissance prévue, la culture devrait atteindre un OD600 de 6. Maintenant, apportez le tube dans la chambre anaérobie et transférez la culture dans deux tubes de micro centrifugeuse de deux millilitres.Après centrifugation comme avant enlever le supernatant et resuspendre chaque palais cellulaire en deux millilitres de milieu d’exposition frais. Répétez cette étape de lavage une fois pour enlever toute trace du milieu de croissance. Maintenant, combinez les deux tubes de micro centrifugeuse de la culture cellulaire dans un flacon standard PTFE de sept millilitres pour obtenir le stock de biocapteurs pour une utilisation dans l’analyse d’exposition.Avant de commencer l’expérience, vérifiez le moniteur anaérobie pour s’assurer qu’il n’y a pas d’oxygène dans la chambre anaérobie. Concevoir la disposition de la plaque selon un modèle de puits 96. Pour exécuter des expériences dans des répliques techniques de trois cela permettra de 32 traitements différents, qui est mieux représenté avec une grille de quatre par huit pour mettre en place les flacons.Configurer la grille quatre par huit en fonction de la disposition des plaques d’essai. Placez ensuite sept flacons ptfe standard millilitres dans le plateau. Les flacons ne doivent être manipulés qu’en manipulant l’extérieur du flacon.Ajouter le volume moyen d’exposition dans chaque flacon correspondant à chaque traitement. À chaque flacon ajouter le volume correspondant de la variable chimique à tester en fonction de la disposition de la plaque. Maintenant, ajoutez du nitrate à chaque flacon de sorte que la concentration est de 200 micromolaires.Exclure cette étape pour les blancs constitutifs de traitement des biocapteurs. Pour ajouter du mercure aux flacons, prenez d’abord le stock de quatre à huit micromolaires et secouez bien. Diluer la solution et le milieu d’exposition dans un flacon PTFE de sept millilitres à une concentration de 100 à 250 nanomolaires pour faire une solution de mercure de travail.À partir de cette solution de travail, ajouter du mercure aux flacons requis en fonction de la disposition des plaques. Après avoir ajouté le mercure ou le cadmium secouer manuellement la plaque dans un mouvement orbital. L’expérience peut être interrompue maintenant en fonction du temps nécessaire pour que le mercure ou le cadmium spéciate dans la solution.Lorsque l’expérience est reprise, pipette doucement biocapteur stock d’avant en arrière pour assurer l’homogénéité. Ajouter ensuite 100 microlitres du stock de biocapteurs à chaque flacon et secouer manuellement la plaque comme avant. Réchauffez le lecteur de plaque à 37 degrés Celsius et installez une course cinétique pendant dix heures avec des lectures toutes les deux pointes cinq à cinq minutes.Une orbitale secouant entre les lectures. Mettez en place la course pour prendre des mesures de fluorescence avec une excitation de fluorescence de 440 nanomètres et une émission de 500 nanomètres. Maintenant pipette 200 microlitres de chaque flacon PTFE dans la grille quatre par huit dans les puits correspondants de la plaque de puits 96.Pipette va-et-vient cinq fois avant de transférer chaque 200 microlitres. Au lieu de jeter la pointe pipette, laissez la pointe pipette dans le flacon PTFE pour garder une trace de la progression de pipetage. Placez la plaque de puits 96 dans le plateau du lecteur de plaque.Ensuite, placez le couvercle sur la plaque de puits 96 et commencer l’analyse. Voici des résultats représentatifs montrant des données corrigées de fluorescence en fonction du temps. La fluorescence est montrée avec des concentrations croissantes de mercure au biocapteur inductible.Toutes les valeurs sont vierges au contrôle sans mercure. Les pics fluorescents peuvent être quantifiés pour montrer le signal fluorescent en fonction de la concentration de mercure ou de cadmium. Tant pour les biocapteurs inductibles que pour les biocapteurs constitutifs, la concentration de mercure ou de cadmium au milieu de la plage linéaire des capteurs inductibles devrait être utilisée pour tester les variables.Voici des exemples d’un résultat non concluant avec le zinc. Et un résultat concluant avec le magnésium et le manganèse sur la biodisponibilité au mercure au biocapteur. Le résultat avec le zinc n’est pas concluant parce que la fluorescence constitutive se décompose avec la fluorescence inductible indiquant la toxicité.Tout en essayant cette procédure, il est important de se rappeler d’entrer dans les concentrations de cadmium ou de mercure car ceux-ci seront utilisés pour calibrer le biocapteur. À la suite de cette procédure, d’autres méthodes comme la modélisation thermodynamique des systèmes aqueux peuvent être effectuées pour répondre à d’autres questions telles que la façon dont des espèces chimiques spécifiques de mercure ou de cadmium affectent leur biodisponibilité. N’oubliez pas que travailler avec du cadmium et du mercure et des acides forts tels que l’acide sulfurique peut être extrêmement dangereux et des précautions telles que le port d’équipement de protection individuelle doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.Après son développement, cette technique a ouvert la voie à des chercheurs dans le domaine de la microbiologie environnementale pour explorer le mercure anaérobie en temps quasi réel ou la biodisponibilité au cadmium et les microbes génétiquement rétractables.

Research

JoVE Journal

Environment

Evaluation of Integrated Anaerobic Digestion and Hydrothermal Carbonization for Bioenergy Production

Évaluation de la digestion anaérobie intégré et hydrothermale carbonisation pour production de bioénergie

Lignocellulosic biomass is one of the most abundant yet underutilized renewable energy resources. Both anaerobic digestion (AD) and hydrothermal ...

Recherche

Environnement

Detection of Foodborne Bacterial Pathogens from Individual Filth Flies

Détection de bactéries pathogènes d&#39;origine alimentaire de mouches individuelle Filth

There is unanimous consensus that insects are important vectors of foodborne pathogens. However, linking insects as vectors of the pathogen causing a ...

Development of Sulfidogenic Sludge from Marine Sediments and Trichloroethylene Reduction in an Upflow Anaerobic Sludge Blanket Reactor

Développement de sulfurogènes boues de sédiments marins et la réduction de trichloroéthylène dans une couverture Réacteur à refoulement de boue anaérobie

The importance of microbial sulfate reduction relies on the various applications that it offers in environmental biotechnology. Engineered sulfate ...

Spotting Cheetahs: Identifying Individuals by Their Footprints

Spotting Cheetahs: l&#39;identification des personnes par leurs empreintes

The cheetah (Acinonyx jubatus) is Africa's most endangered large felid and listed as Vulnerable with a declining population trend by the IUCN1. It ranges ...

Experimental Column Setup for Studying Anaerobic Biogeochemical Interactions Between Iron (Oxy)Hydroxides, Trace Elements, and Bacteria

Experimental Column Setup for Studying Anaerobic Biogeochemical Interactions Between Iron OxyHydroxides, Trace Elements, and Bacteria

Installation de colonne expérimental pour l’étude anaérobies biogéochimiques entre les hydroxydes de fer (Oxy), oligo-éléments et les bactéries

Fate and speciation of trace elements (TEs), such as arsenic (As) and mercury (Hg), in aquifers are closely related to physio-chemical conditions, such as ...

Fluorescent Paper Strips for the Detection of Diesel Adulteration with Smartphone Read-out

Bandes de papier fluorescent pour la détection de l’adultération de Diesel avec lecture de Smartphone

Three fluorescent molecular rotors of 4-dimethylamino-4-nitrostilbene (4-DNS) were investigated for their potential use as viscosity probes to indicate ...

A Precise and Autonomous System for the Detection of Insect Emergence Patterns

Un système précis et autonome pour la détection des patrons d’émergence insectes

Existing systems to measure insect emergence patterns have limitations; they are only partially automated and are limited in the maximum number of ...

Detection of Tilapia Lake Virus Using Conventional RT-PCR and SYBR Green RT-qPCR

Détection de Tilapia lac Virus à l’aide de RT-PCR classique et SYBR Green RT-qPCR

The aim of this method is to facilitate the fast, sensitive and specific detection of Tilapia Lake Virus (TiLV) in tilapia tissues. This protocol can be ...

An Induction System for Clustered Stomata by Sugar Solution Immersion Treatment in Arabidopsis thaliana Seedlings

An Induction System for Clustered Stomata by Sugar Solution Immersion Treatment in Arabidopsis thaliana Seedlings

Un système d’Induction de stomates groupées par traitement de Immersion de Solution de sucre chez les plantules de Arabidopsis thaliana

Stomatal movement mediates plant gas exchange, which is essential for photosynthesis and transpiration. Stomatal opening and closing are accomplished by a ...

Cultivation of Green Microalgae in Bubble Column Photobioreactors and an Assay for Neutral Lipids

Culture de microalgues vertes en bulle colonne photobioréacteurs et un dosage des lipides neutres

There is significant interest in the study of microalgae for engineering applications such as the production of biofuels, high value products, and for the ...