Name: an anaerobic biosensor assay for the detection of mercury and cadmium
Uploaded: 2018-12-17T13:00:00
Duration: 9 min 33 s
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Wir möchten Kommentare von zwei anonymen Gutachtern als auch Mitglieder der Poulain Labor für aufschlussreiche Diskussion über die Entwicklung der anaeroben Biosensor zu danken. Eine frühe Forscher Auszeichnung aus der Provinz Ontario und ein Discovery Grant und eine Ergänzung der Beschleuniger aus den Naturwissenschaften und Engineering Research Council of Canada A.J.P finanziert dieser Studie.

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Mikrobielle Biosensoren sind nützliche Werkzeuge, die Mechanismen zu identifizieren, mit denen Metalle mit Mikroben interagieren. Hier beschreiben wir eine Methode, die anaerob Hg quantifizieren kannII und CdII Bioverfügbarkeit, ein gramnegatives Wirtszelle (E. Coli) und geben ein quantifizierbares Ergebnis innerhalb von wenigen Stunden. Eine der großen Stärken dieses Protokolls ist, dass es umfangreiche Kontrolle über Metall Speziation Mittel-und Belichtung durch die Vermeidung von starken Bindung Liganden oder Komponenten, die zu metallischen Niederschlägen führen können. Metall Speziation wurde modelliert und getestet in dieser Exposition Medium mit PHREEQC17, aber andere Metall Speziation Software eingesetzt werden darf. Im Falle keine zusätzlichen Liganden, Hg Speziation wird voraussichtlich als 97 % Hg(OH)2 und 3 % Hg (NH3)22 +, anwesend sein während Cd Speziation werden als 59 % Cd-β-Glycerophosphat, 25 % Cd2 +und 16 % CdSO4präsentieren. Der Benutzer kann mit einem einfachen Thermodynamische Modellierung Software, design Exposition Medien und testen für die Bioverfügbarkeit des Metalls von Interesse. Darüber hinaus ist die Biosensor Wirtszelle (E. Coli NEB5α) über einen weiten Bereich von pH (5-8,5) und NaCl-Konzentration lebensfähig (0-0,55 M)17.
Hg-Methylierung ist ein anaerober Prozess, und das Protokoll in dieser Studie beschriebenen keinen Voraussetzung für Sauerstoff, für eine genauere Beschreibung der anaeroben Stoffwechsel auf Metall Bioverfügbarkeit ermöglicht. Dies ist wichtig, weil das Vorhandensein von Sauerstoff gen Ausdruck Profile48,49 ändert und somit Potenzial Wege transportieren; Daher stellt diese Methode einen Vorteil gegenüber derzeit vorhandene aeroben Alternativen. Die hier vorgestellten Biosensoren-Konstrukt kann mit anderen anaeroben Hosts, die für Quecksilber-Methylierung (z. B. Geobacter, Desulfovibrio), aber vielleicht mehr relevant sein könnten genutzt werden weniger steuerbar als E. Coli. Eine Strombegrenzung des hier vorgestellten Ansatzes ist, dass unser Limit der Erkennung pM-Werte im Gegensatz zu bestehenden aerobe Systeme4,19,37noch nicht erreicht hat. Es ist jedoch wichtig zu beachten, dass diese niedrige Nachweisgrenzen erreichen mehrere Schritte44ergriffen werden müssen: ich) Liganden ist erforderlich, um sicherzustellen, dass Hg in Lösung bleibt und nicht auf die mikrobielle Zellwand (Hg werden irreversibel gebunden zu adsorbieren zur Zelle Oberfläche Thiole verhindert seine Bioverfügbarkeit25,27; Siehe die Schwelle Antwort für Hg in Abbildung 3A), Ii) Änderungen der Zelldichte oder Iii) ändern der genetischen Konstrukt um Transportproteine Mererweitert-Operon (nämlich MerT und MerP), zunehmende Hg Flux im Inneren der Zelle50,51. Diese Änderungen wäre bei der Aufdeckung von geringen Konzentrationen von Hg vorteilhaft, aber nicht unbedingt ideal ökologisch relevanten Sachverhalte zu beurteilen. Während frühere Kadmium Biosensoren in erster Linie als ein "Proof of Principle" existieren, wurden sie in komplexen Medien entwickelt, denen nicht die Ermittler zu beurteilen, die Rolle der Artbildung auf Bioverfügbarkeit41,42, 43 , 44.
Der Biosensor ist ein unglaublich nützliches Werkzeug bei der Bestimmung der Mechanismen, die in denen Metall Arten bioverfügbar sind. Da der Wirtsorganismus nicht Hg-Methylator ist, kann es nur verwendet werden, ein Modell für wie Hg geben Sie können gramnegative Bakterien und keine endgültige Begründung für wie Hg-Methylators Hg erwerben zu entwickeln. Gibt es andere Methoden zur Bestimmung von Hg Bioverfügbarkeit, z. B. Methylierung, als ein Ergebnis der Aufnahme oder der Einsatz einer Massenbilanz Ansatz10,15,20,45,46. Abgesehen davon bietet die hier vorgestellte Methode den Vorteil der quasi Bioverfügbarkeit Echtzeitdaten in lebensfähige Zellen. Wir empfehlen nicht, dass diese Methode verwendet werden, um insgesamt Hg oder Cd Level in einer Umwelt-Matrix zu quantifizieren. Trotz der vorgeschlagenen Verwendung von Biosensoren Metallkonzentrationen im Umfeld36zu bestimmen gibt es viele mehr zur Verfügung stehen standard-Methoden wie z. B. ICP-MS, FAAS (für Cd-Analyse) oder Kaltdampf-Atom-Absorptions-Spektroskopie (für Hg -Analyse). Jedoch kann der Biosensor verwendet, um festzustellen, ob eine gegebene Umwelt Matrix das Potenzial hat, zu verbessern oder behindern Bioverfügbarkeit; Dies wird erreicht, indem Sie standard Ergänzungen durchführen.
Der pH-Wert des Mediums Exposition kann geändert werden überall innerhalb des Bereichs von 5 und 8,5, vorausgesetzt der MOPS freie Säure (Puffer) mit einer Alternative freie Säure eines Puffers mit der entsprechenden PKA-Wert ausgetauscht werden (siehe Liste der entsprechenden Puffer (Ferreira Et Al. (2015) 47) und mit KOH zu den entsprechenden pH-Wert eingestellt, wenn die Exposition Medien machen. Darüber hinaus die Methode beschränkt sich nicht auf Hg und Cd, aber für andere Metalle mit anderen Regulierungsbehörden Transkription ausgeweitet werden könnte.
Die Exposition-Assay kann geändert werden, um den Einfluss der anderen Elektronen-Akzeptoren wie O2 und Fumarat auf Hg oder Cd Bioverfügbarkeit zu erkunden. Geringfügige Änderungen an der Methode, O2 und Fumarat als Elektronen-Akzeptoren zu nutzen sind auf Anfrage erhältlich.
Zusammenfassend wir folgende Punkte hervorheben möchten: ich) es ist zwingend notwendig, dass die Konzentrationen von Cd oder Hg Bestände in Schritt 2 bekannt sind, wie diese verwendet werden, um der Biosensor zu kalibrieren. II) am Tag Exposition muss das Wachstum von Zellen bei einer OD600 von 0,6 (± 0,1) gestoppt werden und die Sorgfalt beim resuspending der Zellkulturen als der Biosensor zu dieser Zelle Dichte kalibriert ist. III) zu guter Letzt ist es wichtig, dass Exposition Medium akribisch auf die Exposition Tag erfolgt. Um den Erfolg des Protokolls zu gewährleisten, sollten mehrere Kulturen angebaut werden, gleichzeitig (um die Möglichkeit einer Wachstumsstörung zu umgehen) und das Wachstumsmedium sollte wöchentlich erneuert werden (um die Metastabilität der Medien und der möglichen Kontamination zu umgehen). Anzumerken ist, dass biologische Wiederholungen (mehrere Zellkulturen) Variabilität äußern, wenn es darum geht, die Produktion zu signalisieren. Obwohl die fluoreszierenden Antworten von Kultur zu Kultur unterschiedlich sein können, sollte die fluoreszierenden Trends in Beantwortung einer bestimmten Variablen in zahlreichen biologischen Wiederholungen unverändert.

Quecksilber (Hg) ist ein globaler Schadstoff und seiner Bioverfügbarkeit, Hg methylating Mikroben ist der erste Schritt in Richtung der Biomagnifikation durch Nahrungsnetze und neurotoxischen Nebenwirkungen beim Menschen und Tiere1. Es wird derzeit vermutet, dass mikrobielle Hg-Methylierung ist eine intrazelluläre Prozess, erfordert: (i) die Arten der Hg zu bioverfügbaren2,3,4,5,6,7 und Ii) für die Zelle physiologisch Hg8,9,10methylating werden. Cadmium (Cd) Bioaccumulates in Organismen, aber tut nicht Biomagnifies im Nahrungsnetz und ist weit verbreitet in industriellen und gewerblichen Prozessen, die verursachen häufig akute Expositionen in den Menschen und der Umwelt11. Obwohl Mikroben in das Schicksal der Hg in der Umgebung mehrere wichtige Rollen spielen, konzentrieren sich die meisten Studien über Cd Geochemie und Ökotoxikologie auf mikrobielle Eukaryoten12. Verbrauch von landwirtschaftlichen Kulturen (z.B. Reis) ist die wichtigste Quelle für direkte Einwirkung von Cadmium; in diesem Fall die Bioverfügbarkeit von Cd Mikroben der Rhizosphäre beeinflusst direkt die Menge Pflanzen13ansammeln können.
Hg-Transportwege sind komplex und umfassen möglicherweise einen aktiven Transport Schritt14. Wenn ein Transporter beteiligt ist, den letzten Arbeit vorgeschlagen, dass HgII eine Zn nutztII oder MnII Transporter7,15,16,17. Während CdII vermutet wird, um versehentlich transportiert werden Mechanismen der CdII transport in das Zytosol durch zweiwertigen Metall Transportwege (besonders MnII oder ZnII), im Inneren der Zellen bleiben spekulativ und nicht Cd-spezifische Transport Weg wurde identifizierten13,18. Unabhängig von der Art der Transporter beteiligt, drei mechanistische Faktoren bestimmen letztlich die Fähigkeit der Metalle in eine Zelle eingeben: (i) das Metall Speziation in Lösung2,6,15, 16 , 17 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23, Ii) die Biophysiochemical Eigenschaften der Zellmembran17,24,25,26,27,28,29 ,30,31, und Iii) die Möglichkeit, dass das Metall auf einen Transport Seite7,32zugreifen. CD und Hg dürften existiert als freie Ionen mikrobielle physiologisch relevanten Bedingungen aufgrund ihrer hohen Affinität für gelöste organische Angelegenheit (DOM), chelatisierenden Verunreinigungen (z. B. EDTA) oder Schwefel Moieties33reduziert, 34,35 (CdII kann als eine freie Ionen oder Form-Ionenpaare in Ermangelung dieser Liganden vorhanden). Gibt es ein Mangel an effizienten Methoden bei der Bestimmung, wie diese Metall Arten bioverfügbar unter Bedingungen, die für ihr Schicksal in die Umwelt relevant sind. Zum Beispiel Hg ist unter anaeroben Bedingungen14methyliert und Cadmium und Hg sind weiche Metalle (oder Klasse B kationen), verlangt, dass ihre Artbildung unter Bedingungen untersucht werden, die die Integrität der reduzierten Schwefel Gruppen verwalten.
Mikrobielle Biosensoren sind bakterielle Zellen, die eine quantifizierbare Signal als Reaktion auf die intrazellulären Konzentrationen eines Metalls, in diesem Fall Hg oder Cd abgeben. Als solche sind sie ideale Instrumente zu verstehen, wie Metalle eine Zelle36, betreten, sofern die Bedingungen für sorgfältig kontrolliert werden. Hg-Biosensoren enthalten in der Regel gen Fusionen zwischen den regulatorischen Schaltung der Mer-Operon (einschließlich Gene Kodierung für die Transkription Regler MerRas sowie die Betreiber und Veranstalter Regionen die Operon) und reporting Gene (z.B. Lux, GLP, Lac Gene). Wenn Quecksilber in das Zytoplasma vorhanden ist, wird es an GESEG, was in der Transkription der berichtenden Gene und nachfolgende Signal Produktion19,37binden. Spezielle Cd Biosensoren dienen in der Regel mit CadC CadAC, ZntA oder ZntR codiert Transkription Regulierungsbehörden38, aber es ist erwähnenswert, dass GESEG eine niedrigere, aber messbare Affinität zu Cd5. Durch aerobe Beschränkung der meisten gängigen lumineszierenden oder fluoreszierende Reporter Proteine, bis vor kurzem mikrobielle Biosensoren nicht in der Lage blieb, bieten Einblicke in die Biotransformation von Metallen unter anoxischen Bedingungen. Dies erschwert anaeroben Nachweis von Metallen Bioverfügbarkeit über eine Reihe von Bedingungen für ihr Umweltverhalten, speziell im Beisein von Redox sensible Liganden (z. B. Sulfid und Thiole)4, 5 , 39.
Zur Linderung die methodische Hürde der Leben Bildgebung in der Abwesenheit von Sauerstoff, Drepper Et al. (2007) haben ein Flavin-basierte fluoreszierendes Protein (FbFp) entwickelt, basierend auf Licht Sauerstoff Spannung Domäne SB2 Protein von p. Putida. Dieser Proteinfamilie ist in der Lage, in der Abwesenheit von Sauerstoff40fluoreszieren. Aufbauend auf der Arbeit von Drepper Et Al., entwickelt unser Labor eine anaerobe Biosensor, so dass für das Studium der Hg Bioverfügbarkeit unter oxischen und anoxischen Bedingungen und über einen weiten Bereich von Salzgehalt 17. Im aktuellen Papier beschreiben wir wie Sie vorbereiten und verwenden der Biosensor, um ökologische Variablen Einfluss auf Hg oder Cd Bioverfügbarkeit zu testen. Obwohl wir der Biosensor für HgIIentwickelt, entschieden wir uns für Experimente mit CdII als ein Mittel, um die Aufmerksamkeit des Lesers auf die Tatsache lenken, dass Biosensoren auch auf mehrere Stressoren reagieren können, die in ökologischen zusammen auftreten dürften durchführen Matrizen; in diesem Fall war CdII untersucht, weil es zum Binden an der transcriptional Regulator GESEG5bekannt ist. Hier zeigen wir repräsentative Kalibrierung und funktionale lineare Bereiche in Bezug auf entweder Metall. Wir geben auch ein Beispiel, wenn der Biosensor Ergebnisse schlüssig (MgII und MnII auf Hg Bioverfügbarkeit) sind und nicht schlüssig (ZnII auf Hg Bioverfügbarkeit).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>7 ml standard vial, rounded interior</td>
			<td>Delta Scientific</td>
			<td>200-007-20</td>
			<td>34 recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vial tray, 21 mm openings</td>
			<td>Delta Scientific</td>
			<td>730-2001</td>
			<td>4 for (4 x 8 grid)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 mm Closure</td>
			<td>Delta Scientific</td>
			<td>600-024-01</td>
			<td>32 recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LID CORNER NOTCH BLK STR CS/50</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Corning 3931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 96- well clear-bottom nonbinding surface microplate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Corning 3651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anaerobic Chamber (glovebox)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>The air in the anaerobic chamber should be (97 % N2 &#177; 2 % and 3 % H2 &#177; 2 %)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Palladium catalyst</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Converts O2 to H2O in the anaerobic chamber. Not required but recommended.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>450 (&#177;10) nM filter for the microplate reader</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 (&#177;10) nM filter for the microplate reader</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anaerobic culture vial (balch tubes) + rubber stoppers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Modified for anaerobic culture tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MA-3000 (mercury analyzer)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH probe</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any pH probe will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical sterile polypropylene centrifuge tubes.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m polyethersulfone syringe filter + syringe</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile/clean glass bottles</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For growth media and standards</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile/clean plastic or PTFE bottles</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For alkali solutions (NaOH/KOH)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents powders: Na2MoO4, Na2SeO4, H3BO3, NaOH, KOH, MnSO4, ZnSO4, CoCl2, NiCl2, ampicillin sodium salt, Difco M9 Minimal Salts, Glucose, MgSO4, Thiamine HCl, NaNO3, l-leucine, l-isoleucine valine, EDTA sodium salt, FeSO4, Sodium Beta-Gylcerophosphate, Mops free acid, (NH4)2SO4, Hg(NO3)2, CdCl2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Milli-Q water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Autoclaved or filter sterilized is fine.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysogeny Broth</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical grade H2SO4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an anaerobic biosensor assay for the detection of mercury and cadmium

Quecksilber (Hg) Bioverfügbarkeit Mikroben ist ein wichtiger Schritt zu toxischen Hg Biomagnifikation in Nahrungsketten. Cadmium (Cd) Transformationen und Bioverfügbarkeit auf Bakterien steuern die Menge, die in Grundnahrungsmittel sammeln wird. Die Bioverfügbarkeit dieser Metalle ist abhängig von ihrer Speziation in Lösung, sondern vor allem unter anoxischen Bedingungen wo Hg ist, toxische Monomethylmercury (MeHg) methyliert und Cd besteht in der Rhizosphäre. Ganze Zelle mikrobielle Biosensoren geben eine quantifizierbare Signal, wenn eine Metall die Zellflüssigkeit betritt und folglich nützliche Werkzeuge sind, Metall Bioverfügbarkeit zu beurteilen. Leider haben die meisten Biosensoren Bemühungen bisher oxischen Umgebungen durch die begrenzte Fähigkeit der vorhandenen Reporter Proteine Funktion in Abwesenheit von Sauerstoff abhängig gemacht worden. In dieser Studie stellen wir unsere Bemühungen zu entwickeln und zu optimieren eine ganze Zelle Biosensor-Assay funktionstüchtige anaerob, die Metalle unter anoxischen Bedingungen in quasi-Echtzeit und innerhalb von Stunden erkennen kann. Wir beschreiben, wie der Biosensor helfen kann wie chemische Variablen relevant zu den ökologischen Radsport Metalle beeinflussen ihre Bioverfügbarkeit zu beurteilen. Das folgende Protokoll enthält Methoden zur Vorbereitung (1) Hg und Cd-Standards unter anoxischen Bedingungen, (2) Vorbereitung der Biosensor in Abwesenheit von Sauerstoff, (3) Gestaltung und führen ein Experiment, um festzustellen, wie eine Reihe von Variablen beeinflusst Hg oder Cd Bioverfügbarkeit und (4) zu quantifizieren und zu interpretieren Biosensor-Daten. Wir zeigen die lineare reicht von der Biosensoren und geben Beispiele zeigen die Methode Fähigkeit zur Unterscheidung zwischen Metall Bioverfügbarkeit und Toxizität durch die Verwendung von Metall-induzierbaren und konstitutive Stämme.

Sobald die Fluoreszenz-Gipfel nach Schritt 5.3 quantifiziert worden, kann das Ergebnis der Fluoreszenz Gipfel grafisch dargestellt werden, entsprechend der Variable Konzentration veranschaulicht, wie diese Variable betrifft die relative Bioverfügbarkeit von Hg oder Cd. Zum Beispiel wird die Kalibrierkurve des Fluoreszenz über [HgII] aus Abbildung 2 induzierbaren in Abbildung 3Apräsentierten Daten ergeben. Für HgII Kalibrierung, die Kurve wird immer enthalten 3 Komponenten für die Hg-induzierbaren Belastung; eine Schwelle Antwort von ca. 1-2 nM HgII vor der Fluoreszenz-Signal-Produktion ist linear proportional zur [HgII], linearen Bereich wo 5 nM HgII werden zuverlässig immer in der Mitte des Bereichs und ein Plateau wo erhöhen [HgII] wird nicht mehr Fluoreszenzsignal. Keine Änderung in der Signal-Produktion auf dem konstitutiven Stamm zeigt, dass die Toxizität von [HgII] Signal-Produktion nicht beeinflusst. Für CdII in Abbildung 3 bgibt es immer 2 Komponenten für die induzierbaren Belastung; ein linearer Bereich wo 200-300 nM CdII zuverlässig immer in der Mitte des linearen Bereichs und einem Plateau werden. Eine Abnahme der Fluoreszenzsignal mit zunehmender [CdII] zeigt, dass höhere Konzentrationen der Cd giftig für die Zellen sind und können eine Abnahme in der induzierbaren Fluoreszenz-Produktion nach der Hochebene bei 1000 nM CdIIerklären. Daher beim Hg oder Cd Bioverfügbarkeit in Bezug auf eine Umgebungsvariable zu testen, empfehlen wir, mit 5 nM für HgII und 300 nM für CdII.
In einigen Fällen kann Signal Produktion richtig auf Hg oder Cd Bioverfügbarkeit zurückgeführt werden, aber in anderen Fällen durch Variation in den physiologischen Zustand der Biosensor Zelle Host Signal Produktion beeinträchtigt werden kann (z. B. das Metall von Interesse oder Umweltbedingungen getestet sind giftig). In Abbildung 4A, 5 nM Hg Bioverfügbarkeit wurde über ein Gefälle von Zn getestet (0-10 µM). Im Hg-induzierbaren und konstitutive Stämme gibt es eine ähnliche Abnahme Signals mit steigenden Konzentrationen Zn. Daher kann nicht man unterscheiden, ob das Signal aus gesenkten Bioverfügbarkeit resultiert oder ergibt sich aus Zn-Toxizität. In Abbildung 4 b und 4 C, 5nM Hg Bioverfügbarkeit wurde getestet, über ein Gefälle von MgII (0-10 mM) und MnII (0-10 µM). Erhöhung der MgII und MnII -Konzentration verringert das Fluoreszenzsignal der induzierbaren Belastung. Auf der anderen Seite die konstitutive Belastung nicht zeigen einen Rückgang der Fluoreszenz mit zunehmender MgII und MnII -Konzentration (MgII und MnII sind vorteilhaft für die Zellen in der Produktion von FbFp, wie eine Zunahme der Fluoreszenzsignal). Dies zeigt, dass die Zellen lebensfähig sind und die Fluoreszenz Abnahme der Hg-induzierbaren Belastung aus einem Rückgang der Hg Bioverfügbarkeit resultiert. Diese Daten betont, wie wichtig es für alle Biosensor-Assays, auch konstitutive Messungen der allgemeinen Zelle Fitness ist.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58324/58324fig3.jpg"> Abbildung 3: lineare reicht von der Biosensor mit Quecksilber und Cadmium. Maximale Fluoreszenz gemessen als relative Fluoreszenz Einheiten (RFU) ± 1 Standardabweichung emittiert von E. Coli NEB5α beherbergen die pUC57merR-Pp (Hg-induzierbaren) und pUC19Balch-Pp (aufbauend) mit dem Zusatz von (A) HgII (0-15 nM) und B) CdII (0-1.000 nM) unter anaeroben Bedingungen. Fluoreszenz ist, dass der Durchschnitt der 3 Technische bei 37 ° c repliziert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58324/58324fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58324/58324fig4.jpg"> Abbildung 4: Beispiel für eine nicht eindeutige Ergebnis mit Zink und ein schlüssiges Ergebnis mit Magnesium und Mangan. Maximale Fluoreszenz gemessen als relative Fluoreszenz Einheiten (RFU) ± 1 Standardabweichung emittiert von E. Coli NEB5α beherbergen die pUC57merR-Pp (Hg-induzierbaren) und pUC19Balch-Pp (aufbauend) mit dem Zusatz von (A) ZnII (0-10 µM), B) MgII (0-10 mM), und C) MnII (0-10 µM) unter anaeroben Bedingungen. [HgII] wurde gegründet um 5 nM für alle Behandlungen und Fluoreszenz war der Durchschnitt der 3 Technische Wiederholungen bei 37 ° c. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58324/58324fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

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An Anaerobic Biosensor Assay for the Detection of Mercury and Cadmium

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um eine anaerobe mikrobielle Biosensor ganze Zelle verwenden, um wie verschiedene Umgebungsvariablen zu bewerten beeinflussen die Bioverfügbarkeit von Hg und Cd auf Bakterien im anoxischen Umgebungen.

Eine anaerobe Biosensor-Test zum Nachweis von Quecksilber und Cadmium

Mercury (Hg) bioavailability to microbes is a key step to toxic Hg biomagnification in food webs. Cadmium (Cd) transformations and bioavailability to ...

Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen bezüglich des biogeochemischen Zyklus von Cadmium und Quecksilber zu beantworten, wie z. B. wie verschiedene Umweltvariablen ihre Bioverfügbarkeit für Bakterien beeinflussen. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass sie quasi Echtzeit-Bioverfügbarkeitsdaten und lebensfähige Zellen bietet, unabhängig vom Vorhandensein von Sauerstoff. Im Allgemeinen werden Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten haben, weil es viele zeitkritische Schritte gibt, die sehr sorgfältige Liebe zum Detail erfordern.Demonstriert wird das Verfahren Ben, ein Grad Student aus meinem Labor. Um sich auf den Test vorzubereiten, holen Sie den quecksilberinduzierbaren Biosensor und den konstitutiv exprimierbaren Biosensor aus einem Kryobestand von minus 80 Grad Celsius ab. Die Zellen auf Lysogenesy-Brüheplatten mit 120 Mikrogramm pro Milliliter Ampicillin.Wachsen Sie die Plattenkulturen in einem Brutkasten bei 37 Grad Celsius über Nacht. Zwischen 16.30 und 17.m. impfen eine Kultur in zehn Millilitern LB mit Ampicillin und wachsen über Nacht bei 37 Grad Celsius mit Schütteln bei 220 U/min.Um neun und zehn .m am nächsten Morgen bringen die Kultur sowie das zuvor präparierte Wachstumsmedium in die anaerobe Kammer. Dann fügen Sie acht Milliliter frisches Wachstumsmedium und 210 Mikrogramm pro Milliliter Ampicillin in ein steriles Balch-Rohr.Sammeln Sie nun zwei Milliliter der über Nacht gewachsenen Kultur und übertragen Sie sie in ein Zwei-Milliliter-Mikrozentrifugenrohr. Nach der Zentrifugierung bei 10.000 RCF für 90 Sekunden, entfernen Sie den Überstand und resuspendieren in zwei Milliliter frisches Wachstumsmedium. Dann fügen Sie die resuspended Kultur auf die Balch Tube mit acht Milliliter frisches Wachstumsmedium und Ampicillin.Mit steriler Technik, legen Sie vorsichtig einen Gummistopfen auf das Balchrohr, bevor Sie es aus der anaeroben Kammer entfernen. Dann legen Sie die Röhre in einen Inkubator und wachsen anaerob bei 37 Grad Celsius mit Schütteln bei 220 U/min. Zwischen drei und fünf .m.das Balchrohr mit der Kultur, einem neuen sterilen Balchrohr und dem Wachstumsmedium in die anaerobe Kammer zu bringen. Fügen Sie 100 Mikroliter der Kultur zu 10 Milliliter frisches Wachstumsmedium mit Ampicillin in der sterilen Balch-Röhre hinzu. Mit steriler Technik, legen Sie vorsichtig einen Gummistopfen auf das Balchrohr.Entfernen Sie das Rohr aus der anaeroben Kammer, bevor Sie es über Nacht bei 37 Grad Celsius mit Schütteln bei 220 U/min anbauen. Zwischen neun und zehn .m am nächsten Tag, übertragen Sie die Kultur und das Wachstumsmedium zurück in die anaerobe Kammer.Fügen Sie wieder acht Milliliter Wachstumsmedium und Ampicillin in ein steriles Balchrohr. Zwei Milliliter der über Nacht gewachsenen Kultur in ein Zwei-Milliliter-Mikrozentrifugenrohr übertragen. Nach der Zentrifugation wie zuvor, entfernen Sie den Überstand und setzen Sie die Zellen in zwei Milliliter frischem Wachstumsmedium wieder aus.Dann fügen Sie die resuspended Kultur auf die Balch Tube mit dem frischen Wachstumsmedium und Ampicillin. Mit steriler Technik, legen Sie vorsichtig einen Gummistopfen auf das Balchrohr. Entfernen Sie es aus der Kammer und wachsen anaerob bei 37 Grad Celsius mit Schütteln bei 220 Rpm.Überwachen Sie das Wachstum der Kultur mit einem Spektralphotometer, indem Sie die Kultur wirbeln und dann die optische Dichte bei 600 Nanometern oder OD600 messen. Nach drei bis vier Stunden erwarteten Wachstums sollte die Kultur eine OD600 von 6 erreichen. Nun die Röhre in die anaerobe Kammer bringen und die Kultur in zwei Milliliter Mikrozentrifugenröhren übertragen.Nach zentrifugieren wie zuvor entfernen Sie den Überstand und suspendieren Sie jeden Zellpalate in zwei Milliliter frisches Expositionsmedium. Wiederholen Sie diesen Waschschritt einmal, um jede Spur des Wachstumsmediums zu entfernen. Kombinieren Sie nun beide Mikrozentrifugenröhren der Zellkultur in einer sieben Milliliter PTFE-Standard-Durchstechflasche, um den Biosensorbestand für den Expositionstest zu erhalten.Überprüfen Sie vor Beginn des Experiments den anaeroben Monitor, um sicherzustellen, dass sich kein Sauerstoff in der anaeroben Kammer befindet. Entwerfen Sie das Plattenlayout nach einer 96-Gut-Vorlage. Um Experimente in technischen Replikationen von drei durchzuführen, ermöglicht dies 32 verschiedene Behandlungen, die am besten mit einem vier mal acht Raster dargestellt werden, um die Fläschchen einzurichten.Richten Sie das Vier-mal-Acht-Raster entsprechend dem Assay-Platten-Layout ein. Legen Sie dann sieben Milliliter PTFE Standard-Fläschchen in das Tablett. Fläschchen sollten nur durch Manipulation der Außenseite der Durchstechflasche behandelt werden.Fügen Sie das mittlere Belichtungsvolumen in jede Durchstechflasche ein, die jeder Behandlung entspricht. Zu jeder Durchstechflasche das entsprechende Volumen der zu prüfenden chemischen Variable entsprechend dem Plattenlayout hinzufügen. Fügen Sie nun Nitrat in jede Durchstechflasche, so dass die Konzentration 200 Mikromolar beträgt.Schließen Sie diesen Schritt für konstitutive Biosensor-Behandlungsrohlinge aus. Um den Fläschchen Quecksilber hinzuzufügen, nehmen Sie zuerst die vier bis acht mikromolaren Bestände und schütteln Sie gut. Verdünnen Sie die Lösung und das Expositionsmedium in einer sieben Milliliter PTFE-Durchstechflasche auf eine Konzentration von 100 bis 250 Nanomolaren, um eine funktionierende Quecksilberlösung herzustellen.Von dieser Arbeitslösung, fügen Sie Quecksilber zu den erforderlichen Fläschchen entsprechend der Platte Layout. Nach Zugabe des Quecksilbers oder Cadmiums schütteln Sie die Platte manuell in einer Orbitalbewegung. Das Experiment kann nun in Abhängigkeit von der Zeit angehalten werden, die für die Speziierung von Quecksilber oder Cadmium in Lösung erforderlich ist.Wenn das Experiment wieder aufgenommen wird, sanft Pipette Biosensor Bestand hin und her, um Homogenität zu gewährleisten. Dann 100 Mikroliter des Biosensorbestands in jede Durchstechflasche geben und die Platte wie bisher manuell schütteln. Erwärmen Sie den Plattenleser auf 37 Grad Celsius und richten Sie einen kinetischen Lauf für zehn Stunden mit Lesungen alle zwei Punkte fünf bis fünf Minuten ein.Ein Orbitalschütteln zwischen den Messwerten. Richten Sie den Lauf ein, um Fluoreszenzmessungen mit einer Fluoreszenzerregung von 440 Nanometern und einer Emission von 500 Nanometern durchzuführen. Nun pipette 200 Mikroliter aus jeder PTFE-Durchstechflasche in den vier mal acht Gittern in die entsprechenden Brunnen der 96-Wellplatte.Pipette fünfmal hin und her, bevor je 200 Mikroliter übertragen werden. Anstatt die Pipettenspitze zu entsorgen, lassen Sie die Pipettenspitze in der PTFE-Durchstechflasche, um den Pipettierfortschritt zu verfolgen. Legen Sie die 96-Well-Platte in das Fach des Plattenlesers.Dann legen Sie den Deckel auf die 96 Brunnenplatte und beginnen Sie den Test. Hier sind repräsentative Ergebnisse, die korrigierte Fluoreszenzdaten als Funktion der Zeit zeigen. Fluoreszenz wird mit zunehmenden Quecksilberkonzentrationen an den induzierbaren Biosensor gezeigt.Alle Werte sind leer für die No-Quecksilber-Kontrolle. Die Fluoreszenzspitzen können quantifiziert werden, um das Fluoreszenzsignal in Abhängigkeit von Quecksilber- oder Cadmiumkonzentration anzuzeigen. Sowohl für den induzierbaren als auch für den konstitutiven Biosensor sollte die Quecksilber- oder Cadmiumkonzentration in der Mitte des induzierbaren Sensors linearer Bereich für die Prüfung von Variablen verwendet werden.Hier sind Beispiele für ein ergebnisloses Ergebnis mit Zink. Und ein schlüssiges Ergebnis mit Magnesium und Mangan auf Quecksilber Bioverfügbarkeit für den Biosensor. Das Ergebnis mit Zink ist nicht schlüssig, da die konstitutive Fluoreszenz mit induzierbarer Fluoreszenz zerfällt, die auf Toxizität hindeutet.Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, die Konzentrationen von Cadmium oder Quecksilber einzugeben, da diese verwendet werden, um den Biosensor zu kalibrieren. Nach diesem Verfahren können andere Methoden wie die thermodynamische Modellierung wässriger Systeme durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, wie z. B. wie bestimmte chemische Arten von Quecksilber oder Cadmium ihre Bioverfügbarkeit beeinflussen. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Cadmium und Quecksilber und starken Säuren wie Schwefelsäure extrem gefährlich sein kann und Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen von persönlicher Schutzausrüstung sollten immer während der Durchführung dieses Verfahrens getroffen werden.Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Umweltmikrobiologie, um quasi Echtzeit anaerobe Quecksilber- oder Cadmium-Bioverfügbarkeit und genetisch traktierbare Mikroben zu erforschen.

Research

JoVE Journal

Environment

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Forschung

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Development of Sulfidogenic Sludge from Marine Sediments and Trichloroethylene Reduction in an Upflow Anaerobic Sludge Blanket Reactor

Entwicklung sulfidogenen Schlamm aus marinen Sedimenten und Trichlorethylen Reduction in einer Upflow Anaerobic Sludge Blanket Reactor

The importance of microbial sulfate reduction relies on the various applications that it offers in environmental biotechnology. Engineered sulfate ...

Spotting Cheetahs: Identifying Individuals by Their Footprints

Spek Cheetahs: Identifizierung von Personen durch ihre Spuren

The cheetah (Acinonyx jubatus) is Africa's most endangered large felid and listed as Vulnerable with a declining population trend by the IUCN1. It ranges ...

Experimental Column Setup for Studying Anaerobic Biogeochemical Interactions Between Iron (Oxy)Hydroxides, Trace Elements, and Bacteria

Experimental Column Setup for Studying Anaerobic Biogeochemical Interactions Between Iron OxyHydroxides, Trace Elements, and Bacteria

Experimentelle Spalte Setup für das Studium der anaerober biogeochemischer Interaktionen zwischen Eisen (Oxy) Hydroxide, Spurenelemente und Bakterien

Fate and speciation of trace elements (TEs), such as arsenic (As) and mercury (Hg), in aquifers are closely related to physio-chemical conditions, such as ...

Fluorescent Paper Strips for the Detection of Diesel Adulteration with Smartphone Read-out

Fluoreszierende Papierstreifen zur Detektion von Diesel Verfälschung mit Smartphone auslesen

Three fluorescent molecular rotors of 4-dimethylamino-4-nitrostilbene (4-DNS) were investigated for their potential use as viscosity probes to indicate ...

A Precise and Autonomous System for the Detection of Insect Emergence Patterns

Eine präzise und autonomen System zur Erkennung von Insekten entstehen Muster

Existing systems to measure insect emergence patterns have limitations; they are only partially automated and are limited in the maximum number of ...

Detection of Tilapia Lake Virus Using Conventional RT-PCR and SYBR Green RT-qPCR

Erkennung von Tilapia See Virus mit konventionellen RT-PCR und SYBR Green RT-qPCR

The aim of this method is to facilitate the fast, sensitive and specific detection of Tilapia Lake Virus (TiLV) in tilapia tissues. This protocol can be ...

An Induction System for Clustered Stomata by Sugar Solution Immersion Treatment in Arabidopsis thaliana Seedlings

An Induction System for Clustered Stomata by Sugar Solution Immersion Treatment in Arabidopsis thaliana Seedlings

Ein Ansaugsystem für gruppierte Spaltöffnungen durch Zucker Lösung eintauchen Behandlung in Arabidopsis Thaliana Sämlinge

Stomatal movement mediates plant gas exchange, which is essential for photosynthesis and transpiration. Stomatal opening and closing are accomplished by a ...

Cultivation of Green Microalgae in Bubble Column Photobioreactors and an Assay for Neutral Lipids

Anbau von grünen Mikroalgen in Bubble Spalte Photobioreaktoren und ein Test für neutrale Lipide

There is significant interest in the study of microalgae for engineering applications such as the production of biofuels, high value products, and for the ...