Name: an anaerobic biosensor assay for the detection of mercury and cadmium
Uploaded: 2018-12-17T13:00:00
Duration: 9 min 33 s
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हम दो गुमनाम समीक्षक से टिप्पणी के रूप में अच्छी तरह से anaerobic के विकास पर व्यावहारिक चर्चा के लिए Poulain लैब के सदस्यों का शुक्रिया अदा करना होगा । ओंटारियो के प्रांत से एक प्रारंभिक शोधकर्ता पुरस्कार और एक खोज अनुदान और प्राकृतिक विज्ञान और इंजीनियरिंग अनुसंधान कनाडा के परिषद से एक त्वरक पूरक A.J.P. इस अध्ययन वित्त पोषित करने के लिए ।

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

सूक्ष्म जीवाणुओं जो धातुओं रोगाणुओं के साथ बातचीत कर रहे है तंत्र की पहचान करने के लिए उपयोगी उपकरण हैं । यहां, हम एक विधि है कि एक ग्राम नकारात्मक मेजबान सेल (ई. कोलाई) और एक quantifiable परिणाम देने के लिए पाराद्वितीय और सीडीद्वितीय उपलब्धता anaerobically यों तो कुछ ही घंटों के भीतर कर सकते है वर्णन । इस प्रोटोकॉल की प्रमुख शक्तियों में से एक यह है कि यह मजबूत बाध्यकारी लाइगैंडों या घटक है कि धातु वर्षण के लिए नेतृत्व कर सकते है परहेज द्वारा जोखिम के माध्यम में धातु speciation के व्यापक नियंत्रण की अनुमति देता है । धातु speciation मॉडलिंग की है और PHREEQC17का उपयोग कर इस जोखिम मध्यम में परीक्षण किया गया है, तथापि अंय धातु speciation सॉफ्टवेयर तैनात किया जा सकता है । कोई जोड़ा लाइगैंडों के मामले में, पारा speciation को ९७% पारा (OH)2 और 3% पारा (NH3)22 +के रूप में उपस्थित होने की उंमीद है, जबकि सीडी speciation ५९% सीडी के रूप में उपस्थित होंगे-β-Glycerophosphate, 25% सीडी2 +, और 16% CdSO4। एक सरल ऊष्मा मॉडलिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग करना, उपयोगकर्ता जोखिम मीडिया और ब्याज की धातु की जैव उपलब्धता के लिए परीक्षण डिजाइन कर सकते हैं । इसके अलावा, इस (5-8.5) और NaCl एकाग्रता (0-0.55 मी)17पीएच की एक विस्तृत श्रृंखला से अधिक व्यवहार्य है, (ई. कोलाई NEB5α) सेंसर मेजबान सेल ।
पारा मिथाइल एक anaerobic प्रक्रिया है, और इस अध्ययन में उल्लिखित प्रोटोकॉल ऑक्सीजन के लिए एक आवश्यकता नहीं है, धातु जैव उपलब्धता पर anaerobic चयापचय का अधिक सटीक विवरण के लिए अनुमति देता है । यह महत्वपूर्ण है क्योंकि ऑक्सीजन की उपस्थिति जीन अभिव्यक्ति प्रोफाइल४८,४९ और इसलिए, संभावित परिवहन रास्ते बदल; इसलिए इस विधि वर्तमान में exising एरोबिक विकल्प पर एक लाभ प्रस्तुत करता है । यहां प्रस्तुत की गई संवेदना का निर्माण संभावित रूप से अन्य anaerobic होस्ट के साथ किया जा सकता है जो बुध मिथाइल (उदा., Geobacter, Desulfovibrio) के लिए अधिक प्रासंगिक हो सकते हैं, लेकिन शायद ई. कोलाईसे कम हो । यहां प्रस्तुत दृष्टिकोण की एक मौजूदा सीमा है कि पता लगाने की हमारी सीमा अभी तक पीएम स्तर तक पहुंच नहीं है, मौजूदा एरोबिक सिस्टम के विपरीत4,19,३७। लेकिन यह महत्वपूर्ण है कि ध्यान दें कि इन कम पता लगाने की सीमा को प्राप्त करने के लिए कई कदम उठाए जाने की जरूरत है४४: i) ligand अतिरिक्त यह सुनिश्चित करना है कि पारा समाधान में रहता है और माइक्रोबियल सेल की दीवार पर adsorb नहीं है की आवश्यकता है (पारा अपरिवर्तनीय होगा बाध्य सेल सतह thiols अपनी जैव उपलब्धता को रोकने के लिए25,27; चित्रा 3ए में पारा के लिए दहलीज प्रतिक्रिया देखें), द्वितीय) सेल घनत्व में संशोधन, या iii) आनुवंशिक निर्माण के लिए मेर-ऑपरोन के परिवहन प्रोटीन शामिल करने के लिए संशोधित (अर्थात् merT और merP), बढ़ती पारा फ्लक्स कक्ष के अंदर५०,५१. ये संशोधन पारा के कम सांद्रता का पता लगाने में फायदेमंद है, लेकिन जरूरी नहीं कि आदर्श जब पर्यावरण की दृष्टि से प्रासंगिक स्थितियों का आकलन होगा । जबकि पिछले कैडमियम जैव सेंसर मुख्य रूप से एक "सिद्धांत का सबूत" के रूप में मौजूद हैं, वे जटिल मीडिया है कि अंवेषक की अनुमति नहीं है में डिजाइन किए गए जैव उपलब्धता४१,४२ पर speciation की भूमिका का आकलन करने के लिए, ४३ , ४४.
इस में एक अविश्वसनीय रूप से उपयोगी उपकरण है तंत्र के निर्धारण में जो धातु प्रजातियों में उपलब्ध है । क्योंकि मेजबान जीव एक पारा-methylator नहीं है, यह केवल कैसे पारा ग्राम नकारात्मक बैक्टीरिया और नहीं कैसे पारा-methylators पारा अधिग्रहण के लिए एक निश्चित औचित्य दर्ज कर सकते है के लिए एक मॉडल विकसित किया जा सकता है । अन्य विधियां जैसे कि मिथाइल के रूप में पारा जैव उपलब्धता का निर्धारण करने के लिए मौजूद हैं, एक परिणाम के रूप में या एक सामूहिक संतुलन दृष्टिकोण10,15,20,४५,४६का उपयोग करें । कहा जा रहा है कि, विधि यहां प्रस्तुत व्यावहारिक कोशिकाओं में अर्ध वास्तविक समय जैव उपलब्धता डेटा का लाभ प्रदान करता है । हम अनुशंसा करते है कि इस विधि के लिए एक पर्यावरणीय मैट्रिक्स में कुल पारा या सीडी का स्तर यों तो इस्तेमाल किया जा नहीं है । ३६पर्यावरण में धातु सांद्रता निर्धारित करने के लिए, कई और अधिक आसानी से उपलब्ध मानक तरीकों जैसे आईसीपी-MS, FAAS (सीडी विश्लेषण के लिए) या शीत वाष्प परमाणु अवशोषण स्पेक्ट्रोस्कोपी (पारा के लिए) के रूप में उपलब्ध हैं । विश्लेषण). हालांकि एक पर्यावरण मैट्रिक्स को बढ़ाने या जैव उपलब्धता में बाधा की क्षमता है यह निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । यह मानक जोड़ प्रदर्शन से प्राप्त की है ।
जोखिम मीडिया के पीएच को कहीं भी 5 और ८.५ की सीमा के भीतर बदल दिया जा सकता है, MOPS मुक्त एसिड (बफर) प्रदान की उपयुक्त pKa के साथ एक बफर के एक वैकल्पिक मुक्त एसिड के साथ विमर्श किया है (कृपया उचित बफ़र्स की सूची (फरेरा एट अल देखें । (२०१५) ४७) और उचित पीएच को KOH के साथ समायोजित जब जोखिम मीडिया बना । इसके अलावा, विधि पारा और सीडी तक ही सीमित नहीं है, लेकिन अंय प्रतिलेखन नियामकों का उपयोग कर अंय धातुओं के लिए बढ़ाया जा सकता है ।
जोखिम परख जैसे हे2 और fumarate पारा या सीडी जैव उपलब्धता पर अंय इलेक्ट्रॉन स्वीकार करने वालों के प्रभाव का पता लगाने के संशोधित किया जा सकता है । विधि के लिए मामूली संशोधन दोनों ओ2 और fumarate के रूप में इलेक्ट्रॉन स्वीकार करने का उपयोग अनुरोध पर उपलब्ध हैं ।
सारांश में हम निंनलिखित बातों पर जोर देना चाहूंगा: I) यह आवश्यक है कि सीडी या पारा शेयरों की सांद्रता चरण 2 में जाना जाता है, के रूप में इन के लिए इस्तेमाल किया जाएगा के रूप में इन सेंसर । जोखिम दिवस पर द्वितीय) , कोशिकाओं की वृद्धि ०.६ के एक आयुध डिपो६०० पर रोका जाना चाहिए (± ०.१) और है कि देखभाल के लिए सेल संस्कृतियों resuspend जब लिया जाता है, के रूप में इस कोशिका घनत्व के लिए पर तुले है । III) अंत में, यह महत्वपूर्ण है कि जोखिम के माध्यम जोखिम दिन पर कुशलता से किया जाता है । प्रोटोकॉल की सफलता सुनिश्चित करने के लिए, कई संस्कृतियों एक साथ उगाया जाना चाहिए (विकास की विफलता की संभावना को दरकिनार करने के लिए) और विकास के माध्यम साप्ताहिक (मीडिया और संभव संदूषण के metastability को दरकिनार करने के लिए) किया जाना चाहिए । यह भी ध्यान दिया जाना चाहिए कि जैविक प्रतिकृति (एकाधिक सेल संस्कृतियों) एक्सप्रेस परिवर्तनशीलता जब यह उत्पादन संकेत करने के लिए आता है । हालांकि फ्लोरोसेंट प्रतिक्रियाओं संस्कृति से संस्कृति के लिए भिंन हो सकते हैं, एक दिया चर के जवाब में फ्लोरोसेंट प्रवृत्तियों कई जैविक प्रतिकृति में ही रहना चाहिए ।

बुध (पारा) एक वैश्विक प्रदूषक और पारा methylating रोगाणुओं के लिए अपने जैव उपलब्धता है खाद्य जाले और उसके मानव और वंय जीवन में संभव neurotoxic प्रभाव के माध्यम से अपनी वृद्धि की दिशा में पहला कदम है1। यह वर्तमान में सोचा है कि माइक्रोबियल पारा मिथाइल एक intracellular प्रक्रिया की आवश्यकता है कि: i) पारा की प्रजातियों के लिए उपलब्ध हो2,3,4,5,6,7 और द्वितीय) कोशिका के लिए शारीरिक रूप से सक्षम होना methylating पारा8,9,10। कैडमियम (सीडी) जीवों में संचित, लेकिन foodwebs में biomagnifies नहीं है और व्यापक रूप से औद्योगिक और वाणिज्यिक प्रक्रियाओं है कि आमतौर पर लोगों और पर्यावरण11में तीव्र जोखिम के कारण में प्रयोग किया जाता है । हालांकि रोगाणुओं के माहौल में पारा के भाग्य में कई महत्वपूर्ण भूमिका निभा, सीडी geochemistry और ecotoxicology पर सबसे अधिक अध्ययन माइक्रोबियल eukaryotes12पर ध्यान केंद्रित । कृषि फसलों की खपत (जैसे, चावल) कैडमियम को प्रत्यक्ष जोखिम का मुख्य स्रोत है; इस मामले में, rhizosphere के रोगाणुओं के लिए सीडी की जैव उपलब्धता सीधे राशि पौधों13जमा कर सकते है प्रभावित करता है ।
पारा परिवहन रास्ते जटिल है और संभवतः एक सक्रिय परिवहन चरण14शामिल है । जब एक ट्रांसपोर्टर शामिल है, हाल ही में काम का सुझाव दिया है कि पाराद्वितीय एक Znद्वितीय या Mnद्वितीय ट्रांसपोर्टर7,15,16,17का उपयोग करता है । जबकि सीडीद्वितीय गलती से divalent धातु परिवहन रास्ते (विशेष रूप सेद्वितीय या Znद्वितीय), कोशिकाओं के अंदर सीडीद्वितीय परिवहन के तंत्र के माध्यम से cytosol में ले जाया जा कल्पना की है सट्टा, और कोई सीडी विशिष्ट परिवहन मार्ग13,18की पहचान की गई है । शामिल ट्रांसपोर्टरों की प्रकृति की परवाह किए बिना, तीन यंत्रवत कारकों अंततः एक सेल में प्रवेश करने के लिए धातुओं की क्षमता का निर्धारण: i) समाधान2,6,15में धातु speciation, 16 , 17 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23, ii) कोशिका झिल्ली के biophysiochemical गुण17,24,25,26,27,28,29 ,30,31, और iii) धातु के लिए एक परिवहन साइट7,३२का उपयोग करने की क्षमता । सीडी और पारा की संभावना नहीं है माइक्रोबियल शारीरिक रूप से प्रासंगिक विखंडित कार्बनिक पदार्थ (डोम), chelating संदूषण (जैसे, EDTA), या कम सल्फर moieties३३के लिए उच्च समानता के कारण स्थितियों के तहत मुक्त आयनों के रूप में मौजूद है, ३४,३५ (सीडीद्वितीय इन लाइगैंडों के अभाव में एक मुक्त आयन या फार्म आयन-जोड़े के रूप में मौजूद कर सकते हैं) । वहां कैसे इन धातु प्रजातियों के वातावरण में उनके भाग्य के लिए प्रासंगिक शर्तों के तहत उपलब्ध है निर्धारित करने में कुशल तरीकों की कमी है । उदाहरण के लिए, पारा anaerobic शर्तों14के तहत methylated है, और दोनों कैडमियम और पारा नरम धातुओं (या वर्ग बी cations) हैं, की आवश्यकता है कि उनकी speciation शर्तों के तहत जांच की है कि कम सल्फर समूहों की अखंडता बनाए रखने के ।
माइक्रोबियल जैविक संवेदी जीवाणु कोशिकाओं है कि एक धातु के intracellular सांद्रता के जवाब में एक quantifiable संकेत फेंकना, इस मामले में पारा या सीडी में हैं । जैसे, वे आदर्श उपकरण है समझने की कैसे धातुओं एक सेल३६, बशर्ते कि जोखिम शर्तों ध्यान के लिए नियंत्रित कर रहे है दर्ज करें । पारा-संवेदी आमतौर पर मेर-ऑपरोन के विनियामक सर्किट के बीच जीन फ्यूजन शामिल (प्रतिलेखन नियामक के लिए एंकोडिंग MerRas के रूप में अच्छी तरह से ऑपरेटर और ऑपरोन के प्रवर्तक क्षेत्रों सहित), और जीन रिपोर्टिंग (जैसे, लक्स, gfp, लाख जीन) । जब पारा कोशिका द्रव्य में मौजूद है, यह MerR को बांध, रिपोर्टिंग जीन और बाद में संकेत उत्पादन19,३७की प्रतिलेखन में जिसके परिणामस्वरूप होगा । विशिष्ट सीडी आमतौर पर cadC, cadAC, zntA या zntR इनकोडिंग प्रतिलेखन नियामकों३८का उपयोग कर डिजाइन किए हैं, लेकिन यह ध्यान देने योग्य बात है कि MerR एक कम है, अभी तक quantifiable संबंध सीडी5। सबसे अधिक इस्तेमाल किया luminescent या फ्लोरोसेंट रिपोर्टर प्रोटीन के एरोबिक प्रतिबंध के कारण, हाल ही में सूक्ष्म जीवाणुओं जब तक कि anoxic शर्तों के तहत धातुओं के जैविक रूपांतरण में अंतर्दृष्टि प्रदान करने में असमर्थ रहे । यह उनके पर्यावरणीय भाग्य के लिए प्रासंगिक स्थितियों की एक सीमा से अधिक बहुत मुश्किल धातुओं जैव उपलब्धता का anaerobic पता लगाने बनाता है, विशेष रूप से redox संवेदनशील लाइगैंडों की उपस्थिति में (जैसे, सल्फाइड और thiols)4, 5 , ३९.
ऑक्सीजन के अभाव में लाइव इमेजिंग की methodological बाधा को दूर करने के लिए Drepper एट अल. (२००७) एक फ्लेविन आधारित फ्लोरोसेंट प्रोटीन (FbFp) विकसित किया है, SB2 प्रोटीन के प्रकाश ऑक्सीजन वोल्टेज डोमेन के आधार पर पी putidaसे । यह प्रोटीन परिवार ऑक्सीजन४०के अभाव में fluoresce करने में सक्षम है । Drepper एट अलके काम पर बिल्डिंग, हमारी प्रयोगशाला एक anaerobic oxic और anoxic शर्तों के तहत पारा जैव उपलब्धता के अध्ययन के लिए अनुमति सेंसर डिजाइन और 17लवणता की एक विस्तृत श्रृंखला पर । वर्तमान समाचार पत्र में, हम का वर्णन कैसे तैयार करने के लिए और जैव सेंसर का उपयोग करने के लिए पारा या सीडी जैव उपलब्धता पर पर्यावरण ' चर प्रभाव का परीक्षण । हालांकि हम पाराद्वितीयके लिए विकसित संवेदक, हम एक के रूप में सीडीद्वितीय के साथ प्रयोग करने का फैसला किया तथ्य यह है कि अधिक से अधिक तनाव का जवाब भी कर सकते है पाठक का ध्यान आकर्षित करने का मतलब है कि सह की संभावना है पर्यावरण में होते है matrices इस मामले में सीडीद्वितीय की जांच की गई क्योंकि यह transcriptional नियामक MerR5से बाइंड करने के लिए जाना जाता है । यहां, हम या तो धातु के संबंध में प्रतिनिधि अंशांकन और कार्यात्मक रैखिक पर्वतमाला दिखाते हैं । हम भी एक उदाहरण देते है जब जैव सेंसर के परिणाम निर्णायक (पारा जैव उपलब्धता पर एमजीद्वितीय और Mnद्वितीय ) और अनिर्णायक (पारा जैव उपलब्धता पर Znद्वितीय ) ।

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>7 ml standard vial, rounded interior</td>
			<td>Delta Scientific</td>
			<td>200-007-20</td>
			<td>34 recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vial tray, 21 mm openings</td>
			<td>Delta Scientific</td>
			<td>730-2001</td>
			<td>4 for (4 x 8 grid)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 mm Closure</td>
			<td>Delta Scientific</td>
			<td>600-024-01</td>
			<td>32 recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LID CORNER NOTCH BLK STR CS/50</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Corning 3931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 96- well clear-bottom nonbinding surface microplate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Corning 3651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anaerobic Chamber (glovebox)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>The air in the anaerobic chamber should be (97 % N2 &#177; 2 % and 3 % H2 &#177; 2 %)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Palladium catalyst</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Converts O2 to H2O in the anaerobic chamber. Not required but recommended.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>450 (&#177;10) nM filter for the microplate reader</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 (&#177;10) nM filter for the microplate reader</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anaerobic culture vial (balch tubes) + rubber stoppers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Modified for anaerobic culture tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MA-3000 (mercury analyzer)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH probe</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any pH probe will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical sterile polypropylene centrifuge tubes.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m polyethersulfone syringe filter + syringe</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile/clean glass bottles</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For growth media and standards</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile/clean plastic or PTFE bottles</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For alkali solutions (NaOH/KOH)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents powders: Na2MoO4, Na2SeO4, H3BO3, NaOH, KOH, MnSO4, ZnSO4, CoCl2, NiCl2, ampicillin sodium salt, Difco M9 Minimal Salts, Glucose, MgSO4, Thiamine HCl, NaNO3, l-leucine, l-isoleucine valine, EDTA sodium salt, FeSO4, Sodium Beta-Gylcerophosphate, Mops free acid, (NH4)2SO4, Hg(NO3)2, CdCl2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Milli-Q water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Autoclaved or filter sterilized is fine.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysogeny Broth</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical grade H2SO4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an anaerobic biosensor assay for the detection of mercury and cadmium

पारा (पारा) रोगाणुओं को जैव उपलब्धता खाद्य जाले में विषाक्त पारा अधिक इज़ाफ़ा करने के लिए एक महत्वपूर्ण कदम है । कैडमियम (सीडी) परिवर्तनों और बैक्टीरिया को जैव उपलब्धता मात्रा है कि प्रधान खाद्य फसलों में जमा होगा नियंत्रण । इन धातुओं की जैव उपलब्धता समाधान में उनके speciation पर निर्भर है, लेकिन अधिक विशेष रूप से anoxic स्थितियों जहां पारा विषाक्त monomethylmercury (MeHg) को methylated है और सीडी rhizosphere में बनी हुई है । पूरे सेल माइक्रोबियल जैव सेंसर एक quantifiable संकेत दे जब एक धातु cytosol में प्रवेश करती है और इसलिए उपयोगी उपकरण धातु जैव उपलब्धता का आकलन कर रहे हैं । दुर्भाग्य से, सबसे अधिक संवेदन प्रयास अब तक मौजूदा रिपोर्टर प्रोटीन ऑक्सीजन के अभाव में कार्य करने की सीमित क्षमता के कारण वातावरण oxic करने के लिए विवश किया गया है । इस अध्ययन में, हम अपने को विकसित करने और एक पूरी सेल anaerobically कि अर्ध में anoxic हालत वास्तविक समय और घंटे के भीतर धातुओं का पता लगा सकते है काम करने में सक्षम परख का अनुकूलन प्रयास वर्तमान । हम का वर्णन कैसे जैव सेंसर की मदद कर सकते है कैसे रासायनिक चर धातुओं की पर्यावरण साइकिल चालन के लिए प्रासंगिक उनके जैव उपलब्धता को प्रभावित । निंनलिखित प्रोटोकॉल के लिए विधियां शामिल है (1) anoxic शर्तों के तहत पारा और सीडी मानकों को तैयार, (2) ऑक्सीजन के अभाव में जैव संवेदक तैयार, (3) डिजाइन और एक प्रयोग को लागू करने के लिए निर्धारित कैसे चर की एक श्रृंखला पारा या सीडी जैव उपलब्धता को प्रभावित करता है, और (4) को यों तो और अधिक सेंसर डेटा की व्याख्या । हम जैव सेंसर के रैखिक पर्वतमाला दिखाने के लिए और दोनों धातु-inducible और गठन उपभेदों का उपयोग करके धातु जैव उपलब्धता और विषाक्तता के बीच अंतर करने के लिए विधि की क्षमता दिखा उदाहरण प्रदान करते हैं.

एक बार प्रतिदीप्ति चोटियों ५.३ कदम के अनुसार किया गया है quantified, प्रतिदीप्ति चोटियों के परिणाम चर एकाग्रता के अनुसार रेखांकन किया जा सकता है कि कैसे चर या तो पारा या सीडी के सापेक्ष जैव उपलब्धता को प्रभावित करता है । उदाहरण के लिए, चित्रा 2 से अधिक [पाराद्वितीय] प्रतिदीप्ति के अंशांकन वक्र चित्रा 3ए में प्रस्तुत inducible डेटा निकलेगा । पाराद्वितीय अंशांकन के लिए, वक्र हमेशा पारा-inducible तनाव के लिए 3 घटकों को शामिल करेंगे; प्रतिदीप्ति संकेत उत्पादन से पहले के बारे में 1-2 एनएम पाराद्वितीय की दहलीज प्रतिक्रिया रेखीय [पाराद्वितीयके लिए आनुपातिक है], रैखिक सीमा जहां 5 एनएम पाराद्वितीय मज़बूती से हमेशा उस सीमा के केंद्र में होगा, और एक पठार जहां बढ़ती [पाराद्वितीय] अब प्रतिदीप्ति संकेत वृद्धि होगी । गठन पर संकेत उत्पादन में कोई परिवर्तन नहीं तनाव से पता चलता है कि [पाराद्वितीय] से विषाक्तता संकेत उत्पादन को प्रभावित नहीं करता है । चित्र 3 बीमें सीडीद्वितीय के लिए, वहां हमेशा inducible तनाव के लिए 2 घटक हैं; एक रैखिक रेंज जहां 200-300 एनएम सीडीद्वितीय मज़बूती से हमेशा रैखिक रेंज और एक पठार के केंद्र में होगा । [सीडीद्वितीय] बढ़ाने के साथ प्रतिदीप्ति संकेत में कमी से पता चलता है कि उच्च सीडी सांद्रता कोशिकाओं को विषाक्त कर रहे है और १००० एनएम सीडीद्वितीयमें पठार के बाद inducible प्रतिदीप्ति उत्पादन में कमी की व्याख्या कर सकते हैं । इसलिए, जब एक पर्यावरण चर के संबंध में पारा या सीडी जैव उपलब्धता परीक्षण, हम पारा द्वितीय के लिए 5 एनएम और सीडीद्वितीय के लिए ३०० एनएमका उपयोग सुझाव है ।
कुछ उदाहरणों में, संकेत उत्पादन ठीक से पारा या सीडी जैव उपलब्धता के लिए जिंमेदार ठहराया जा सकता है, लेकिन अंय मामलों में, संकेत उत्पादन जैव संवेदक सेल मेजबान के शारीरिक स्थिति में भिंनता से प्रभावित हो सकते है (जैसे, ब्याज की धातु या पर्यावरण की स्थिति का परीक्षण विषाक्त कर रहे हैं) । चित्रा 4aमें, 5 एनएम पारा जैव उपलब्धता Zn (0-10 µ m) के एक ढाल पर परीक्षण किया गया था । दोनों पारा-inducible और गठन उपभेदों में, वहां Zn सांद्रता बढ़ाने के साथ संकेत में एक समान कमी है । इसलिए, एक भेदभाव नहीं कर सकते कि संकेत कम जैव उपलब्धता से परिणाम या Zn विषाक्तता का एक परिणाम है । चित्रा 4B और 4cमें, 5nM पारा जैव उपलब्धता एमजीद्वितीय (0-10 मिमी) और Mnद्वितीय (0-10 µ मीटर) के एक ढाल पर परीक्षण किया गया था । बढ़ती मिलीग्रामद्वितीय और Mnद्वितीय सांद्रता inducible तनाव के प्रतिदीप्ति संकेत में कमी आई । दूसरी ओर, गठित तनाव एमजीद्वितीय और mn द्वितीय सांद्रता के साथ प्रतिदीप्ति में कमी नहीं दिखा था (एमजीद्वितीय और mnद्वितीय FbFp के उत्पादन में कोशिकाओं के लिए फायदेमंद हैं, के रूप में द्वारा प्रदर्शित प्रतिदीप्ति संकेत में वृद्धि) । यह दर्शाता है कि कोशिकाओं को व्यवहार्य है और पारा के प्रतिदीप्ति कमी-inducible तनाव परिणाम पारा जैव उपलब्धता में कमी से । इस डेटा को बल देता है कितना महत्वपूर्ण यह सभी के लिए है सभी सेंसर परख भी समग्र सेल फिटनेस के गठन की माप प्रदान करते हैं ।
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58324/58324fig3.jpg"> चित्रा 3: पारा और कैडमियम के साथ सेंसर की रैखिक पर्वतमाला. अधिकतम प्रतिदीप्ति रिश्तेदार प्रतिदीप्ति इकाइयों के रूप में मापा (RFU) ± 1 मानक विचलन ई. कोलाई NEB5α बंदरगाह द्वारा उत्सर्जित pUC57merR-पीपी (पारा-Inducible) और pUC19Balch-पीपी (गठन) के अलावा एक पाराद्वितीय (0-15 एनएम) और ख) anaerobic शर्तों के तहत सीडीद्वितीय (0-1000 एनएम) । प्रतिदीप्ति ३७ ˚ सी में 3 तकनीकी की नकल की औसत था । <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58324/58324fig3large.jpg" target="_blank">कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58324/58324fig4.jpg"> चित्रा 4: जस्ता और मैग्नीशियम और मैंगनीज के साथ एक निर्णायक परिणाम के साथ एक अनिर्णायक परिणाम का उदाहरण । अधिकतम प्रतिदीप्ति रिश्तेदार प्रतिदीप्ति इकाइयों के रूप में मापा (RFU) ± 1 मानक विचलन ई. कोलाई NEB5α बंदरगाह के द्वारा उत्सर्जित pUC57merR-पीपी (पारा-Inducible) और pUC19Balch-पीपी (गठन) एक के अलावा के साथ ) Znद्वितीय (0-10 µ मीटर), ख) एमजीद्वितीय (0-10 मिमी), और सी) एमएनद्वितीय (0-10 µ मीटर) के तहत anaerobic शर्तें । [पाराद्वितीय] सभी उपचार के लिए 5 एनएम के लिए निर्धारित किया गया था और प्रतिदीप्ति ३७ ˚ सी में 3 तकनीकी की नकल की औसत था । <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58324/58324fig4large.jpg" target="_blank">कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।</a>

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An Anaerobic Biosensor Assay for the Detection of Mercury and Cadmium

यहां, हम एक anaerobic पूरे सेल माइक्रोबियल जैव संवेदक का मूल्यांकन करने के लिए कैसे विभिंन पर्यावरणीय चर पारा और anoxic वातावरण में बैक्टीरिया को सीडी की जैव उपलब्धता को प्रभावित करने का उपयोग करने के लिए एक प्रोटोकॉल मौजूद ।

पारा और कैडमियम का पता लगाने के लिए एक Anaerobicीय संवेदक परख

Mercury (Hg) bioavailability to microbes is a key step to toxic Hg biomagnification in food webs. Cadmium (Cd) transformations and bioavailability to ...

यह विधि कैडमियम और पारे के बायोजियोकेमिकल साइकिलिंग के बारे में महत्वपूर्ण सवालों के जवाब देने में मदद कर सकती है जैसे कि विभिन्न पर्यावरणीय चर बैक्टीरिया के लिए उनकी जैव उपलब्धता को कैसे प्रभावित करते हैं। इस तकनीक का मुख्य लाभ यह है कि यह ऑक्सीजन की उपस्थिति के बावजूद अर्ध वास्तविक समय जैव उपलब्धता डेटा और व्यवहार्य कोशिकाओं प्रदान करता है। आम तौर पर इस विधि के लिए नए व्यक्ति संघर्ष करेंगे क्योंकि कई बार संवेदनशील कदम हैं जिन्हें विस्तार पर बहुत सावधानीपूर्वक ध्यान देने की आवश्यकता होती है।प्रक्रिया का प्रदर्शन बेन, मेरी प्रयोगशाला से एक स्नातक छात्र होगा । परख के लिए तैयार करने के लिए, पारा प्रेरक बायोसेंसर को पुनः प्राप्त करें और संविलियन ने शून्य से 80 डिग्री सेल्सियस क्रायो स्टॉक से बायोसेंसर व्यक्त किया। एम्पिसिलिन के 120 माइक्रोग्राम प्रति मिलीलीटर युक्त लिसोजेनी शोरबा प्लेटों पर कोशिकाओं को प्लेट करें।रात भर ३७ डिग्री सेल्सियस पर एक इनक्यूबेटर में थाली संस्कृतियों बढ़ो । 4:30 और 5 पी के बीच.m एम्पिसिलिन के साथ पौंड के दस मिलीलीटर में एक संस्कृति टीका और २२० आरपीएम पर मिलाते हुए के साथ ३७ डिग्री सेल्सियस पर रात भर बढ़ने ।नौ और दस के बीच में.m अगली सुबह संस्कृति के साथ ही पहले से तैयार विकास माध्यम को एनारोबिक चैंबर में लाते हैं। फिर एक बाँझ बाइच ट्यूब में नए विकास माध्यम के आठ मिलीलीटर और एम्पिसिलिन के मिलीलीटर प्रति मिलीलीटर 210 माइक्रोग्राम जोड़ें।अब रातोंरात उगाई गई संस्कृति के दो मिलीलीटर एकत्र करें और दो मिलीलीटर माइक्रो सेंट्रलाइज ट्यूब में स्थानांतरित करें। 90 सेकंड के लिए 10, 000 आरसीएफ पर अपकेंद्री के बाद, ताजा विकास माध्यम के दो मिलीलीटर में सुपरनेट और रीसस्लपेंड को हटा दें। फिर नए विकास माध्यम और एम्पिसिलिन के आठ मिलीलीटर युक्त बाल्च ट्यूब में पुनर्धारित संस्कृति जोड़ें।बाँझ तकनीक का उपयोग करके, इसे एनारोबिक कक्ष से हटाने से पहले बाल्च ट्यूब पर रबर डाट को ध्यान से रखें। फिर ट्यूब को इनक्यूबेटर में रखें और 220 आरपीएम पर मिलाते हुए 37 डिग्री सेल्सियस पर एनारोबिक रूप से विकसित करें। तीन से पांच पी .m के बीच।संस्कृति के साथ बाल्च ट्यूब लाओ, एक नया बाँझ बाल्च ट्यूब, और विकास माध्यम अवायविक कक्ष में। बाँझ बाल्च ट्यूब में एम्पीसिलिन के साथ ताजा विकास माध्यम के 10 मिलीलीटर के लिए संस्कृति के 100 माइक्रोलीटर जोड़ें। बाँझ तकनीक का उपयोग करके, बाल्च ट्यूब पर एक रबर डाट सावधानी से रखें।220 आरपीएम पर मिलाते हुए 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर बढ़ने से पहले एनारोबिक चैंबर से ट्यूब निकालें। अगले दिन नौ से दस ए .m के बीच, संस्कृति और विकास माध्यम को वापस एनारोबिक चैंबर में स्थानांतरित करें।फिर से एक बाँझ बाच ट्यूब में विकास माध्यम और एम्पिसिलिन के आठ मिलीलीटर जोड़ें। रातोंरात उगाई गई संस्कृति के दो मिलीलीटर को दो मिलीलीटर माइक्रो सेंट्रलाइज ट्यूब में स्थानांतरित करें। पहले की तरह अपकेंद्री के बाद, सुपरनेट को हटा दें और कोशिकाओं को नए विकास माध्यम के दो मिलीलीटर में फिर से खर्च करें।फिर ताजा विकास माध्यम और एम्पिसिलिन युक्त बाल्च ट्यूब में पुनर्निचित संस्कृति जोड़ें। बाँझ तकनीक का उपयोग करके, बाल्च ट्यूब पर एक रबर डाट सावधानी से रखें। इसे कक्ष से निकालें और 220 आरपीएम पर मिलाते हुए 37 डिग्री सेल्सियस पर एनारोबिक रूप से बढ़ें।संस्कृति को भंवर से जोड़कर स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके संस्कृति के विकास की निगरानी करें और फिर 600 नैनोमीटर या OD600 पर ऑप्टिकल घनत्व को मापने के लिए। तीन से चार घंटे की उम्मीद के विकास के बाद संस्कृति को 6 के OD600 तक पहुंचना चाहिए । अब ट्यूब को एनारोबिक चैंबर में लाएं और संस्कृति को दो दो मिलीलीटर माइक्रो सेंट्रलाइज ट्यूब में स्थानांतरित करें।पहले के रूप में अपकेंद्रण के बाद सुपरनैटेंट को हटाने और ताजा जोखिम माध्यम के दो मिलीलीटर में प्रत्येक कोशिका तालु पुनः खर्च करते हैं । ग्रोथ मीडियम के किसी भी निशान को दूर करने के लिए इस वॉशिंग स्टेप को एक बार दोहराएं। अब एक्सपोजर परख में उपयोग के लिए बायोसेंसर स्टॉक प्राप्त करने के लिए सेल संस्कृति के दोनों माइक्रो सेंट्रलाइज ट्यूब्स को सात मिलीलीटर पीएफई मानक शीशी में मिलाएं।प्रयोग शुरू करने से पहले एनारोबिक मॉनिटर की जांच करें ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि एनारोबिक चैंबर में ऑक्सीजन न हो। 96 अच्छी तरह से टेम्पलेट के अनुसार प्लेट लेआउट डिजाइन करें। तीन की तकनीकी प्रतिकृति में प्रयोगों को चलाने के लिए यह 32 विभिन्न उपचारों के लिए अनुमति देगा, जो शीशियों को स्थापित करने के लिए चार बाय आठ ग्रिड के साथ सबसे अच्छा प्रतिनिधित्व करता है।परख प्लेट लेआउट के अनुसार चार बाय आठ ग्रिड सेट करें। इसके बाद ट्रे में सात मिलीलीटर पीएफई मानक शीशियां रखें। शीशियों को केवल शीशी के बाहर हेरफेर करके संभाला जाना चाहिए।प्रत्येक उपचार के अनुरूप प्रत्येक शीशी में एक्सपोजर मध्यम मात्रा जोड़ें। प्रत्येक शीशी के लिए प्लेट लेआउट के अनुसार परीक्षण किए जाने वाले रासायनिक चर की संबंधित मात्रा जोड़ें। अब हर शीशी में नाइट्रेट डालें ताकि एकाग्रता 200 माइक्रोमोलर हो।संविलियन बायोसेंसर उपचार रिक्त स्थान के लिए इस कदम को बाहर करें। शीशियों में पारे को जोड़ने के लिए सबसे पहले चार से आठ माइक्रोमोलर स्टॉक लें और अच्छी तरह हिलाएं। एक काम पारा समाधान बनाने के लिए 100 से 250 नैनोमोलर की एकाग्रता के लिए एक सात मिलीलीटर PTFE शीशी में समाधान और जोखिम माध्यम पतला।इस वर्किंग सॉल्यूशन से प्लेट लेआउट के हिसाब से जरूरी शीशियों में मरकरी डालें। पारा या कैडमियम जोड़ने के बाद मैन्युअल रूप से प्लेट को कक्षीय गति में हिलाएं। प्रयोग अब हल में विशिष्ट करने के लिए पारा या कैडमियम के लिए आवश्यक समय के आधार पर रोका जा सकता है ।जब प्रयोग फिर से शुरू हो जाता है, तो एकरूपता सुनिश्चित करने के लिए धीरे-धीरे बायोसेंसर स्टॉक को आगे-पीछे करें। फिर प्रत्येक शीशी में बायोसेंसर स्टॉक के 100 माइक्रोलीटर जोड़ें और मैन्युअल रूप से प्लेट को पहले की तरह हिलाएं। ३७ डिग्री सेल्सियस के लिए थाली पाठक गर्म और हर दो बिंदु पांच से पांच मिनट पढ़ता है के साथ दस घंटे के लिए एक गतिज रन की स्थापना की ।रीडिंग के बीच में मिलाते हुए एक कक्षीय । 440 नैनोमीटर के फ्लोरेसेंस उत्तेजन और 500 नैनोमीटर के उत्सर्जन के साथ फ्लोरेसेंस माप लेने के लिए रन सेट करें। अब 96 अच्छी तरह से प्लेट के इसी कुओं में चार द्वारा आठ ग्रिड में प्रत्येक पीएफई शीशी से 200 माइक्रोलीटर पिपेट करें।प्रत्येक 200 माइक्रोलीटर स्थानांतरित करने से पहले पांच बार पिपेट। पिपेट टिप को त्यागने के बजाय, पाइपेट की प्रगति का ट्रैक रखने के लिए पीएफई शीशी में पिपेट टिप छोड़ दें। 96 अच्छी तरह से प्लेट रीडर की ट्रे में रखें।फिर ढक्कन को 96 अच्छी प्लेट पर रखें और परख शुरू करें। यहां प्रतिनिधि परिणाम समय के एक समारोह के रूप में सही फ्लोरेसेंस डेटा दिखा रहे हैं । फ्लोरेसेंस को अकांक्षित बायोसेंसर के लिए पारे की बढ़ती सांद्रता के साथ दिखाया गया है।सभी मूल्यों को कोई पारा नियंत्रण के लिए खाली हैं । फ्लोरोसेंट चोटियों को पारा या कैडमियम एकाग्रता के एक समारोह के रूप में फ्लोरोसेंट संकेत दिखाने के लिए निर्धारित किया जा सकता है। प्रेरक और संविलियन दोनों बायोसेंसर के लिए, प्रेरक सेंसर रैखिक रेंज के बीच में पारा या कैडमियम एकाग्रता का उपयोग परीक्षण चर के लिए किया जाना चाहिए।यहां जिंक के साथ एक अनिर्णादार परिणाम के उदाहरण दिए गए हैं । और बायोसेंसर के लिए पारा जैव उपलब्धता पर मैग्नीशियम और मैंगनीज के साथ एक निर्णायक परिणाम । जिंक के साथ परिणाम बेनतीजा है क्योंकि संविलियन फ्लोरेसेंस विषाक्तता का संकेत देने वाले अकावधान के साथ क्षय होता है।इस प्रक्रिया का प्रयास करते समय कैडमियम या पारा की सांद्रता में प्रवेश करना याद रखना महत्वपूर्ण है क्योंकि इनका उपयोग बायोसेंसर को जांचने के लिए किया जाएगा। इस प्रक्रिया के बाद, जलीय प्रणालियों के थर्मोडायनामिक मॉडलिंग जैसे अन्य तरीकों को अतिरिक्त प्रश्नों के उत्तर देने के लिए किया जा सकता है जैसे कि पारा या कैडमियम की विशिष्ट रासायनिक प्रजातियां उनकी जैव उपलब्धता को कैसे प्रभावित करती हैं। यह न भूलें कि कैडमियम और पारा और सल्फ्यूरिक एसिड जैसे मजबूत एसिड के साथ काम करना बेहद खतरनाक हो सकता है और इस प्रक्रिया को करते समय व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण पहनने जैसी सावधानियां हमेशा बरती जानी चाहिए।इसके विकास के बाद इस तकनीक ने पर्यावरण माइक्रोबायोलॉजी के क्षेत्र में शोधकर्ताओं के लिए अर्ध वास्तविक समय अवायविक पारा या कैडमियम बायोअवयबिलिटी और आनुवंशिक रूप से पथिक रोगाणुओं का पता लगाने का मार्ग प्रशस्त किया।

Research

JoVE Journal

Environment

Evaluation of Integrated Anaerobic Digestion and Hydrothermal Carbonization for Bioenergy Production

Bioenergy निर्माण के लिए समेकित anaerobic पाचन और जलतापीय अथ जलकर कोयला का मूल्यांकन

Lignocellulosic biomass is one of the most abundant yet underutilized renewable energy resources. Both anaerobic digestion (AD) and hydrothermal ...

Detection of Foodborne Bacterial Pathogens from Individual Filth Flies

व्यक्तिगत गंदगी मक्खियों से खाद्यजनित बैक्टीरियल रोगज़नक़ों की जांच

There is unanimous consensus that insects are important vectors of foodborne pathogens. However, linking insects as vectors of the pathogen causing a ...

Development of Sulfidogenic Sludge from Marine Sediments and Trichloroethylene Reduction in an Upflow Anaerobic Sludge Blanket Reactor

एक Upflow अवायवीय कीचड़ कंबल रिएक्टर में समुद्री तलछट और ट्राइक्लोरोथिलीन कमी से Sulfidogenic कीचड़ का विकास

The importance of microbial sulfate reduction relies on the various applications that it offers in environmental biotechnology. Engineered sulfate ...

Spotting Cheetahs: Identifying Individuals by Their Footprints

उनके पैरों के निशान से पहचान व्यक्तियों: चीता खोलना

The cheetah (Acinonyx jubatus) is Africa's most endangered large felid and listed as Vulnerable with a declining population trend by the IUCN1. It ranges ...

Experimental Column Setup for Studying Anaerobic Biogeochemical Interactions Between Iron (Oxy)Hydroxides, Trace Elements, and Bacteria

Experimental Column Setup for Studying Anaerobic Biogeochemical Interactions Between Iron OxyHydroxides, Trace Elements, and Bacteria

आयरन (ऑक्सी) Hydroxides, ट्रेस तत्वों, और बैक्टीरिया के बीच Anaerobic Biogeochemical इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए प्रायोगिक कॉलम सेटअप

Fate and speciation of trace elements (TEs), such as arsenic (As) and mercury (Hg), in aquifers are closely related to physio-chemical conditions, such as ...

Fluorescent Paper Strips for the Detection of Diesel Adulteration with Smartphone Read-out

Smartphone के साथ डीजल अपमिश्रण का पता लगाने के लिए फ्लोरोसेंट कागज स्ट्रिप्स पढ़ें-आउट

Three fluorescent molecular rotors of 4-dimethylamino-4-nitrostilbene (4-DNS) were investigated for their potential use as viscosity probes to indicate ...

A Precise and Autonomous System for the Detection of Insect Emergence Patterns

कीट उद्भव पैटर्न का पता लगाने के लिए एक सटीक और स्वायत्त प्रणाली

Existing systems to measure insect emergence patterns have limitations; they are only partially automated and are limited in the maximum number of ...

Detection of Tilapia Lake Virus Using Conventional RT-PCR and SYBR Green RT-qPCR

पारंपरिक आरटी-पीसीआर और SYBR ग्रीन आरटी-qPCR का उपयोग कर Tilapia झील वायरस का पता लगाने

The aim of this method is to facilitate the fast, sensitive and specific detection of Tilapia Lake Virus (TiLV) in tilapia tissues. This protocol can be ...

An Induction System for Clustered Stomata by Sugar Solution Immersion Treatment in Arabidopsis thaliana Seedlings

An Induction System for Clustered Stomata by Sugar Solution Immersion Treatment in Arabidopsis thaliana Seedlings

Arabidopsis थालियाना अंकुर में चीनी समाधान विसर्जन उपचार द्वारा संकुल Stomata के लिए एक प्रेरण प्रणाली

Stomatal movement mediates plant gas exchange, which is essential for photosynthesis and transpiration. Stomatal opening and closing are accomplished by a ...

Cultivation of Green Microalgae in Bubble Column Photobioreactors and an Assay for Neutral Lipids

बुलबुला कॉलम Photobioreactors में ग्रीन सूक्ष्म शैवाल की खेती और तटस्थ लिपिड के लिए एक परख

There is significant interest in the study of microalgae for engineering applications such as the production of biofuels, high value products, and for the ...