Name: an anaerobic biosensor assay for the detection of mercury and cadmium
Uploaded: 2018-12-17T13:00:00
Duration: 9 min 33 s
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Vorremmo ringraziare commenti da due revisori anonimi come ben membri del Poulain Lab per penetranti discussione sullo sviluppo del biosensore anaerobico. Un precoce Researcher Award dalla provincia dell'Ontario e una sovvenzione di Discovery e un supplemento di acceleratore da scienze naturali e ingegneria Research Council of Canada per A.J.P finanziato questo studio.

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Microbiche biosensori sono strumenti utili per identificare i meccanismi con cui i metalli stanno interagendo con microbi. Qui, descriviamo un metodo che consente di quantificare anaerobicamente HgII e CdII biodisponibilità di una cellula ospite gram-negativi (Escherichia coli) e dare un risultato quantificabile entro poche ore. Uno dei maggiori punti di forza di questo protocollo è che permette un controllo esteso di speciazione nel mezzo di esposizione evitando di ligandi di forte legame o componenti che possono portare alla precipitazione del metallo. Speciazione è stato modellato e testato in questo mezzo di esposizione utilizzando PHREEQC17, tuttavia altri software di speciazione può essere distribuito. Nel caso di nessun aggiunto ligandi, Hg speciazione è previsto per essere presenti come 97% Hg(OH)2 e 3% Hg (NH3)22 +, mentre Cd speciazione sarà presente come 59% Cd-β-glicerofosfato, 25% Cd2 +e 16% CdSO4. Utilizzando un semplice software di modellazione termodinamico, l'utente può progettare esposizione media e testare per la biodisponibilità del metallo di interesse. Inoltre, la cellula ospite biosensore (NEB5α die. coli ) è praticabile su una vasta gamma di pH (5-8,5) e la concentrazione di NaCl (0-0,55 M)17.
Hg la metilazione è un processo anaerobico, e il protocollo descritto in questo studio non è un requisito per l'ossigeno, consentendo per la descrizione più accurata del metabolismo anaerobico sulla biodisponibilità del metallo. Questo è importante perché la presenza di ossigeno altera gene expression profili48,49 e quindi, potenziale di trasporto vie; Pertanto, questo metodo presenta un vantaggio sopra attualmente esistente aerobiche alternative. Il costrutto di biosensori presentato qui potenzialmente può essere utilizzato con altri host anaerobica che potrebbero essere più pertinenti per la metilazione di mercurio (ad esempio Geobacter, Desulfovibrio), ma forse meno trattabili di e. coli. Una limitazione di corrente dell'approccio presentato qui è che il nostro limite di rilevazione non ha ancora raggiunto i livelli di pM, contrariamente alle esistenti sistemi aerobici4,19,37. È tuttavia importante notare che per raggiungere questi limiti di rilevabilità basso diversi passaggi devono essere scattata44: io) aggiunta di legante è necessaria per assicurare che Hg rimane in soluzione e non adsorbe sulla parete della cellula microbica (Hg sarà irreversibile con associazione alla cella tioli superfici impedendo la sua biodisponibilità25,27; Vedi la risposta di soglia per Hg in Figura 3A), ii) modifiche alla densità delle cellule, o iii) modificare il costrutto genetico per includere proteine di trasporto della mer-operone (vale a dire merT e merP), crescente flusso di Hg all'interno la cella50,51. Queste modifiche sarebbe utile nella rilevazione di basse concentrazioni di Hg, ma non necessariamente ideale quando valutare situazioni ambientali rilevanti. Considerando che precedente biosensori di cadmio esistano principalmente come una "prova di principio", furono progettati nel complesso media che non permettono al ricercatore di valutare il ruolo della speciazione su biodisponibilità41,42, 43 , 44.
Il biosensore è uno strumento incredibilmente utile nel determinare meccanismi in cui specie metalliche sono biodisponibili. Perché l'organismo ospite non è un Hg-methylator, può essere utilizzato solo per sviluppare un modello per come Hg possono entrare batteri gram-negativi e non una definitiva spiegazione razionale per quanto Hg-methylators acquisire Hg. Esistono altri metodi per determinare la biodisponibilità di Hg, come metilazione, come un risultato dell'assorbimento o l'utilizzo di un bilancio di massa approccio10,15,20,45,46. Detto questo, il metodo presentato qui offre il vantaggio di quasi tempo reale biodisponibilità dati in cellule vitali. Non è consigliabile questo metodo essere utilizzato per quantificare i livelli totali di Hg o Cd in una matrice ambientale. Nonostante l'uso proposto di biosensori per determinare le concentrazioni di metalli nel ambiente36, molti più facilmente disponibili metodi standard sono disponibili quali ICP-MS, FAAS (per analisi di Cd) o spettroscopia di assorbimento atomico di vapore freddo (per Hg analisi). Il biosensore può tuttavia essere utilizzato per determinare se una data matrice ambientale ha il potenziale per migliorare o ostacolare la biodisponibilità; Ciò si ottiene eseguendo aggiunte standard.
Il pH dell'esposizione media può essere alterato per ovunque all'interno della gamma di 5 e 8.5, purché l'acido libero di MOPS (buffer) viene scambiato con un acido libero alternativo di un buffer con il pKa appropriato (si veda elenco di buffer appropriato (Ferreira et al. (2015) 47) e regolato con KOH al pH appropriato quando si effettua l'esposizione media. Inoltre, il metodo non è limitato a Hg e Cd, ma potrebbe essere esteso ad altri metalli con altri regolatori della trascrizione.
Il test di esposizione può essere modificato per esplorare l'influenza di altri accettori come O2 e fumarato sulla biodisponibilità di Hg o Cd. Piccole modifiche al metodo di utilizzare sia O2 e fumarato come accettori sono disponibili su richiesta.
In sintesi ci piacerebbe sottolineare i seguenti punti: io) è imperativo che le concentrazioni di stock di Cd e Hg sono noti nel passaggio 2, questi verranno utilizzati per calibrare il biosensore. II) il giorno di esposizione, la crescita delle cellule deve essere interrotta in un OD600 di 0,6 (± 0,1) e che la cura è presa quando risospensione delle colture cellulari, come il biosensore è calibrato per la densità delle cellule. III) , infine, è importante che il mezzo di esposizione fatta meticolosamente il giorno dell'esposizione. Per garantire il successo del protocollo, le colture multiple devono essere coltivate contemporaneamente (per eludere la possibilità di guasto di sviluppo) e il mezzo di crescita dovrebbe essere rifatto settimanale (per eludere la metastabilità dei media e della possibile contaminazione). Si deve anche osservare che replicati biologici (più colture cellulari) esprimono la variabilità quando si tratta di produzione del segnale. Anche se le risposte fluorescente possono variare da cultura a cultura, le tendenze fluorescente in risposta a una determinata variabile dovrebbero rimanere lo stesso nel corso di numerose repliche biologiche.

Mercurio (Hg) è un inquinante globale e la sua biodisponibilità per Hg metilazione microbi è il primo passo verso la biomagnificazione attraverso reti alimentari e suoi possibili effetti neurotossici in essere umano e della fauna selvatica1. Attualmente si pensa che la metilazione Hg microbica è un processo intracellulare che richiede: i) la specie di Hg per essere bioavailable2,3,4,5,6,7 e ii) per la cella per essere fisiologicamente in grado di metilazione Hg8,9,10. Cadmio (Cd) bioaccumulabile negli organismi, ma fa non magnificazione in foodwebs e viene ampiamente utilizzata nei processi industriali e commerciali che comunemente causano le esposizioni acute nelle persone e l' ambiente11. Anche se i microbi svolgono diversi ruoli chiave nel destino di Hg nell'ambiente, maggior parte degli studi su Cd geochimica ed ecotossicologia concentrarsi su eucarioti microbici12. Consumo di colture agricole (per esempio, riso) è la principale fonte di esposizione diretta al cadmio; in questo caso, la biodisponibilità del Cd ai microbi di rizosfera influenza direttamente la quantità piante possono accumularsi13.
Percorsi di trasporto HG sono complesse e possibilmente coinvolgono un trasporto attivo passaggio14. Quando è coinvolto un trasportatore, il lavoro recente ha suggerito che HgII utilizza un ZnII o MnII trasportatore7,15,16,17. Considerando che CdII è supposto per essere accidentalmente trasportato nel citosol attraverso percorsi di trasporto metalli bivalenti (particolarmente MnII o ZnII), meccanismi di CdII trasporto dentro le cellule rimangono via trasporto speculativa e no Cd-specifico è stato identificato13,18. Indipendentemente dalla natura dei trasportatori coinvolti, tre fattori meccanicistici in definitiva determinano la capacità dei metalli per immettere una cella: i) la speciazione del metallo nella soluzione2,6,15, 16 , 17 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23, ii) le proprietà biophysiochemical della membrana cellulare17,24,25,26,27,28,29 ,30,31e iii) la possibilità per il metallo accedere a un sito di trasporto7,32. È improbabile che esiste come ioni liberi in condizioni microbiche fisiologicamente rilevanti a causa della loro alta affinità per dissolto Organic Matter (DOM), CD e Hg chelanti contaminanti (ad esempio, EDTA), o ridotto zolfo moiety33, 34,35 (CdII può esistere come un libero dello ione o forma coppie ioniche in assenza di questi leganti). C'è una mancanza di metodi efficienti nel determinare come queste specie metalliche sono biodisponibili in condizioni pertinenti al loro destino nell'ambiente. Per esempio, Hg è metilato sotto condizioni anaerobiche14, e sia cadmio Hg sono metalli teneri (o cationi di classe B), che richiedono che i loro speciazione essere studiati in condizioni tali da mantengono l'integrità dei gruppi ridotti dello zolfo.
Microbiche biosensori sono cellule batteriche che emettono un segnale quantificabile in risposta alle concentrazioni intracellulari di un metallo, in questo caso Hg o Cd. Come tali, essi sono strumenti ideali per capire come metalli inserire una cella36, purché le condizioni di esposizione vengono accuratamente controllate per. Biosensori di Hg in genere contengono fusioni del gene fra i circuiti regolatori del mer-operone (inclusi geni codificanti per il regolatore della trascrizione Armando nonché l'operatore e promotore regioni dell'operone) e reporting geni (per esempio, Lux, gfp, lac geni). Quando il mercurio è presente nel citoplasma, assocerà al MerR, conseguente trascrizione dei geni segnalazione e successivo segnale produzione19,37. Specifiche Cd biosensori sono solitamente progettati utilizzando cadC, cadAC, zntA o zntR codificati trascrizione regolatori38, ma vale la pena notare che MerR ha un'affinità più bassa, ancora quantificabile a Cd5. A causa di restrizione aerobico della maggior parte comunemente utilizzato proteine reporter fluorescenti o luminescenti, fino a recentemente microbiche biosensori è rimasto incapace di offrire intuizioni la biotrasformazione dei metalli in condizioni anossiche. Questo rende anaerobica rilevamento della biodisponibilità di metalli molto difficile in una gamma di condizioni pertinenti al loro destino ambientale, in particolare in presenza di redox sensibili ligandi (ad es., solfuro e tioli)4, 5 , 39.
Per alleviare la transenna metodologica di live imaging in assenza di ossigeno, Drepper et al. (2007) hanno sviluppato una proteina fluorescente flavina-base (FbFp), basato su dominio di tensione di ossigeno luce della proteina SB2 da p. putida. Questa famiglia di proteine è in grado di essere flourescente in assenza di ossigeno40. Basandosi sul lavoro di Drepper et al., il nostro laboratorio progettato un biosensore anaerobico permettendo per lo studio della biodisponibilità di Hg in condizioni ossidanti e anossiche e sopra una vasta gamma di salinità 17. Nella carta attuale, descriviamo come preparare e utilizzare il biosensore per testare influenza le variabili di ambiente sulla biodisponibilità di Hg o Cd. Anche se abbiamo sviluppato il biosensore per HgII, abbiamo scelto di eseguire esperimenti con CdII come un mezzo per attirare l'attenzione del lettore sul fatto che i biosensori possono anche rispondere a fattori di stress multipli che sono suscettibili di co-accadono in campo ambientale matrici; in questo caso CdII è stato studiato perché è noto da associare al regolatore trascrizionale MerR5. Qui, indichiamo calibrazione rappresentativo e funzionale lineare gamme rispetto o metallo. Diamo anche un esempio quando i risultati di biosensore sono conclusivi (MgII e MnII sulla biodisponibilità di Hg) e inconcludenti (ZnII sulla biodisponibilità di Hg).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>7 ml standard vial, rounded interior</td>
			<td>Delta Scientific</td>
			<td>200-007-20</td>
			<td>34 recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vial tray, 21 mm openings</td>
			<td>Delta Scientific</td>
			<td>730-2001</td>
			<td>4 for (4 x 8 grid)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 mm Closure</td>
			<td>Delta Scientific</td>
			<td>600-024-01</td>
			<td>32 recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LID CORNER NOTCH BLK STR CS/50</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Corning 3931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 96- well clear-bottom nonbinding surface microplate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Corning 3651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anaerobic Chamber (glovebox)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>The air in the anaerobic chamber should be (97 % N2 &#177; 2 % and 3 % H2 &#177; 2 %)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Palladium catalyst</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Converts O2 to H2O in the anaerobic chamber. Not required but recommended.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>450 (&#177;10) nM filter for the microplate reader</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 (&#177;10) nM filter for the microplate reader</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anaerobic culture vial (balch tubes) + rubber stoppers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Modified for anaerobic culture tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MA-3000 (mercury analyzer)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH probe</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any pH probe will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical sterile polypropylene centrifuge tubes.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m polyethersulfone syringe filter + syringe</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile/clean glass bottles</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For growth media and standards</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile/clean plastic or PTFE bottles</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For alkali solutions (NaOH/KOH)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents powders: Na2MoO4, Na2SeO4, H3BO3, NaOH, KOH, MnSO4, ZnSO4, CoCl2, NiCl2, ampicillin sodium salt, Difco M9 Minimal Salts, Glucose, MgSO4, Thiamine HCl, NaNO3, l-leucine, l-isoleucine valine, EDTA sodium salt, FeSO4, Sodium Beta-Gylcerophosphate, Mops free acid, (NH4)2SO4, Hg(NO3)2, CdCl2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Milli-Q water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Autoclaved or filter sterilized is fine.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysogeny Broth</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical grade H2SO4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an anaerobic biosensor assay for the detection of mercury and cadmium

Biodisponibilità di mercurio (Hg) ai microbi è un passo fondamentale per tossici Hg biomagnificazione in reti alimentari. Trasformazioni di cadmio (Cd) e la biodisponibilità di batteri controllano la quantità che si accumula nelle colture di alimento di base. La biodisponibilità di questi metalli dipende dalla loro speciazione in soluzione, ma più specialmente sotto condizioni anossiche dove Hg è metilato per tossici monomethylmercury (MeHg) e Cd persiste nella rizosfera. Intero-cellula microbiche biosensori dare un segnale quantificabile quando un metallo entra nel citosol e quindi è strumenti utili per valutare la biodisponibilità del metallo. Purtroppo, maggior parte degli sforzi di biosensori finora sono stata vincolata agli ambienti ossidanti a causa della limitata capacità di proteine reporter esistenti di funzionare in assenza di ossigeno. In questo studio, presentiamo il nostro sforzo per sviluppare e ottimizzare un'analisi di cellule intere biosensore in grado di funzionare anaerobicamente in grado di rilevare metalli in condizioni anossiche in tempo quasi-reale ed entro le ore. Descriviamo come il biosensore può aiutare a valutare come chimiche variabili rilevanti per il ciclismo ambientale di metalli influenzano la loro biodisponibilità. Il seguente protocollo include metodi per (1) preparare Hg e Cd standard in condizioni anossiche, (2) preparare il biosensore in assenza di ossigeno, (3) progettazione ed eseguire un esperimento per determinare l'influenza di una serie di variabile biodisponibilità Hg o Cd e (4) quantificare e interpretare i dati biosensore. Mostreremo le gamme lineari dei biosensori e fornire esempi che mostrano la capacità del metodo di distinguere tra metallo biodisponibilità e tossicità utilizzando ceppi sia metallo-viscoelastico e costitutive.

Una volta che i picchi di fluorescenza sono stati quantificati secondo punto 5.3, il risultato dei picchi di fluorescenza possa essere rappresentati graficamente secondo la concentrazione variabile che illustra come tale variabile influenza la biodisponibilità relativa di Hg o Cd. Ad esempio, la curva di taratura della fluorescenza sopra [HgII] dalla Figura 2 produrrà i dati viscoelastici presentati in Figura 3A. Per HgII calibrazione, la curva sarà sempre contengono 3 componenti per il ceppo Hg-inducible; una risposta di soglia di circa 1-2 nM HgII prima produzione del segnale di fluorescenza è linearmente proporzionale [HgII], la gamma lineare dove 5 nM HgII sarà affidabile sempre al centro di tale intervallo e un altopiano dove [HgII] non è più consigliabile aumentare segnale di fluorescenza. Nessun cambiamento nella produzione del segnale sul ceppo costitutivo dimostra che la tossicità da [HgII] non pregiudica la produzione del segnale. Per CdII in Figura 3B, ci sono sempre 2 componenti per il ceppo inducibile; una gamma lineare dove 200-300 nM CdII sarà affidabile sempre al centro del campo lineare e un plateau. Una diminuzione del segnale di fluorescenza con crescente [CdII] Mostra che le più alte concentrazioni di Cd sono tossiche per le cellule e possono spiegare una diminuzione della produzione di fluorescenza viscoelastica dopo l'altopiano a 1000 nM CdII. Pertanto, quando si prova Cd o Hg biodisponibilità rispetto a una variabile di ambiente, si consiglia di utilizzare 5 nM per HgII e 300 nM per CdII.
In alcuni casi, produzione del segnale può essere correttamente attribuito alla biodisponibilità Hg o Cd, ma in altri casi, la produzione del segnale può essere influenzata da variazione dello stato fisiologico della cellula ospite biosensore (ad es., il metallo di interesse o condizioni ambientali testate sono tossiche). In Figura 4A, biodisponibilità di Hg 5 nM è stato testato su una sfumatura di Zn (0-10 µM). Hg-inducible sia in ceppi costitutive, c'è una simile diminuzione nel segnale con un aumento delle concentrazioni di Zn. Di conseguenza, uno non può discriminare se il segnale deriva dalla biodisponibilità abbassata o è il risultato di tossicità di Zn. In Figura 4B e 4C, 5nM biodisponibilità di Hg è stato testato su una sfumatura di MgII (0-10 mM) e MnII (0-10 µM). Mg di aumentare le concentrazioni diII II e Mn sono diminuito il segnale di fluorescenza del ceppo inducibile. D'altra parte, il ceppo costitutivo non ha mostrato una diminuzione in fluorescenza con l'aumento di Mg concentrazioni diII II e Mn (MgII e MnII sono benefiche per le cellule nella produzione di FbFp, come dimostrato da un aumento del segnale di fluorescenza). Questo dimostra che le cellule sono vitali e la diminuzione di fluorescenza del ceppo Hg-inducible deriva da una diminuzione della biodisponibilità di Hg. Questi dati sottolinea quanto sia importante per tutti i saggi di biosensore anche fornire misurazioni costitutive della forma fisica generale delle cellule.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58324/58324fig3.jpg"> Figura 3: gamme lineari del biosensore con mercurio e cadmio. La fluorescenza massima misurata come fluorescenza relativa unità (RFU) ± 1 Deviazione Standard emessi da e. coli NEB5α che harboring il pUC57merR-Pp (Hg-inducibile) e pUC19Balch-Pp (Constitutive) con l'aggiunta di A) HgII (0-15 nM) e B) CdII (0-1.000 nM) in condizioni anaerobiche. Fluorescenza è stata che la media di 3 tecnici replica a 37 ˚ c. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58324/58324fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58324/58324fig4.jpg"> Figura 4: esempio di un risultato inconcludente con zinco e un risultato conclusivo con magnesio e Manganese. La fluorescenza massima misurata come fluorescenza relativa unità (RFU) ± 1 Deviazione Standard emessi da e. coli NEB5α che harboring il pUC57merR-Pp (Hg-inducibile) e pUC19Balch-Pp (Constitutive) con l'aggiunta di A) ZnII (0-10 µM), B) MgII (0-10 mM), e C) MnII (0-10 µM) in condizioni anaerobiche. [HgII] è stata impostata a 5 nM per tutti i trattamenti e fluorescenza era la media dei 3 replicati tecnici a 37 ˚ c. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58324/58324fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

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An Anaerobic Biosensor Assay for the Detection of Mercury and Cadmium

Qui, presentiamo un protocollo per l'utilizzo di un biosensore microbico anaerobico di cellule intere di valutare come le diverse variabili ambientali influenzano la biodisponibilità di Hg e Cd ai batteri in ambienti anossici.

Un dosaggio di biosensore anaerobico per la rilevazione di mercurio e cadmio

Mercury (Hg) bioavailability to microbes is a key step to toxic Hg biomagnification in food webs. Cadmium (Cd) transformations and bioavailability to ...

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave riguardanti il ciclo biogeochimico del cadmio e del mercurio, ad esempio come le diverse variabili ambientali influenzano la loro biodisponibilità ai batteri. Il vantaggio principale di questa tecnica è che offre dati di biodisponibilità quasi in tempo reale e cellule vitali indipendentemente dalla presenza di ossigeno. Generalmente le persone nuove a questo metodo avranno difficoltà perché ci sono molti passaggi sensibili al tempo che richiedono un'attenzione molto meticolosa ai dettagli.A dimostrare la procedura sarà Ben, uno studente laureato del mio laboratorio. Per prepararsi al saggio, recuperare il biosensore induttibile al mercurio e il biosensore espresso in modo costitutivo da un porcile criogenico di meno 80 gradi Celsius. Placcare le cellule su piastre di brodo di lisogenia contenenti 120 microgrammi per millilitro di ampicillina.Far crescere le colture di piastre in un'incubatrice a 37 gradi Celsius durante la notte. Tra le 16:30 e le 17:00.m. inoculare una coltura in dieci millilitri di LB con ampicillina e crescere durante la notte a 37 gradi Celsius con scuotimento a 220 giri/min.Tra le nove e le dieci .m la mattina successiva portare la cultura e il mezzo di crescita precedentemente preparato nella camera anaerobica. Quindi aggiungere otto millilitri di mezzo di crescita fresco e 210 microgrammi per millilitro di ampicillina in un tubo di balsamo sterile.Ora raccogli due millilitri della coltura coltivata durante la notte e trasferisci in un tubo di micro centrifuga a due millilitri. Dopo aver centrifugato a 10.000 RCF per 90 secondi, rimuovere il supernatante e rimescolare in due millilitri di mezzo di crescita fresco. Quindi aggiungere la coltura rimorsiata al tubo di balsamo contenente otto millilitri di mezzo di crescita fresco e ampicillina.Utilizzando una tecnica sterile, posizionare con cura un tappo di gomma sul tubo di balsamo prima di rimuoverlo dalla camera anaerobica. Quindi posizionare il tubo in un'incubatrice e crescere anaerobically a 37 gradi Celsius con scuotimento a 220 giri/min. Tra le tre e le cinque p.m.portare il tubo di balsamo con la coltura, un nuovo tubo di balsamo sterile e il mezzo di crescita nella camera anaerobica. Aggiungere 100 microlitri della coltura a 10 millilitri di mezzo di crescita fresco con ampicillina nel tubo di balsamo sterile. Utilizzando una tecnica sterile, posizionare con cura un tappo di gomma sul tubo di balsamo.Rimuovere il tubo dalla camera anaerobica prima di coltivarlo durante la notte a 37 gradi Celsius con scuotimento a 220 giri/min. Tra le nove e le .m giorno successivo, trasferire la cultura e il mezzo di crescita alla camera anaerobica.Aggiungere nuovamente otto millilitri di mezzo di crescita e ampicillina in un tubo di balsamo sterile. Trasferire due millilitri della coltura coltivata durante la notte in un tubo di micro centrifuga a due millilitri. Dopo la centrifugazione come prima, rimuovere il supernatante e rimescolare le cellule in due millilitri di mezzo di crescita fresco.Quindi aggiungere la coltura rimorsiata al tubo di balsamo contenente il mezzo di crescita fresco e l'ampicillina. Utilizzando una tecnica sterile, posizionare con cura un tappo di gomma sul tubo di balsamo. Rimuoverlo dalla camera e crescere anaerobically a 37 gradi Celsius con scuotimento a 220 giri/min.Monitorare la crescita della coltura utilizzando uno spettrofotometro vortice la coltura e quindi misurare la densità ottica a 600 nanometri o OD600. Dopo tre o quattro ore di crescita prevista, la cultura dovrebbe raggiungere un OD600 di 6. Ora porta il tubo nella camera anaerobica e trasferisci la coltura in due tubi di micro centrifuga a due millilitri.Dopo la centrifugazione come prima rimuovere il supernatante e rimescolare ogni palato cellulare in due millilitri di mezzo di esposizione fresca. Ripetere questa fase di lavaggio una volta per rimuovere qualsiasi traccia del mezzo di crescita. Ora combina entrambi i tubi di micro centrifuga della coltura cellulare in una fiala standard PTFE da sette millilitri per ottenere il materiale del biosensore da utilizzare nel saggio di esposizione.Prima di iniziare l'esperimento controllare il monitor anaerobico per assicurarsi che non vi sia ossigeno nella camera anaerobica. Progettare il layout della piastra secondo un modello di pozzo 96. Per eseguire esperimenti in repliche tecniche di tre questo consentirà 32 trattamenti diversi, che è meglio rappresentato con una griglia quattro per otto per impostare le fiale.Impostare la griglia quattro per otto in base al layout della piastra di dosaggio. Quindi posizionare sette flaconcini standard PTFE millilitro nel vassoio. Le fiale devono essere gestite solo manipolando l'esterno del flaconcino.Aggiungere il volume medio di esposizione in ogni flaconcino corrispondente a ciascun trattamento. Ad ogni flaconcino aggiungere il volume corrispondente della variabile chimica da testare in base alla disposizione della piastra. Ora aggiungere nitrato a ogni flaconcino in modo che la concentrazione sia di 200 micromolari.Escludere questo passaggio per gli spazi vuoti costitutivi per il trattamento del biosensore. Per aggiungere mercurio alle fiale, prima prendi il titolo da quattro a otto micromolare e scuoti bene. Diluire la soluzione e il mezzo di esposizione in una fiala PTFE da sette millilitri a una concentrazione da 100 a 250 nanomolare per creare una soluzione di mercurio funzionante.Da questa soluzione di lavoro, aggiungere mercurio alle fiale richieste in base al layout della piastra. Dopo aver aggiunto il mercurio o il cadmio scuotere manualmente la piastra in un moto orbitale. L'esperimento può essere messo in pausa ora a seconda del tempo necessario al mercurio o al cadmio per speciare in soluzione.Quando l'esperimento viene ripreso, pipettare delicatamente il materiale del biosensore di pipette avanti e indietro per garantire l'omogeneità. Quindi aggiungere 100 microlitri del materiale biosensore a ogni fiala e scuotere manualmente la piastra come prima. Riscaldare il lettore di lastre a 37 gradi Celsius e impostare una corsa cinetica per dieci ore con letture ogni due punti da cinque a cinque minuti.Uno scuotimento orbitale tra una lettura e l'altro. Impostare la corsa per effettuare misurazioni della fluorescenza con un'eccitazione a fluorescenza di 440 nanometri e un'emissione di 500 nanometri. Ora pipetta 200 microlitri da ogni flaconcino PTFE nella griglia quattro per otto nei pozzi corrispondenti della piastra del pozzo 96.Pipetta avanti e indietro cinque volte prima di trasferire ogni 200 microlitri. Anziché scartare la punta della pipetta, lasciare la punta della pipetta nel flaconcino PTFE per tenere traccia dell'avanzamento della pipetta. Posizionare la piastra del pozzo 96 nel vassoio del lettore di lastre.Quindi posizionare il coperchio sulla piastra del pozzo 96 e iniziare il saggio. Ecco i risultati rappresentativi che mostrano i dati corretti sulla fluorescenza in funzione del tempo. La fluorescenza è mostrata con concentrazioni crescenti di mercurio al biosensore indutbile.Tutti i valori sono vuoti per il controllo no mercury. I picchi fluorescenti possono essere quantificati per mostrare il segnale fluorescente in funzione della concentrazione di mercurio o cadmio. Sia per i biosensori induttibili che per i biosensori costitutivi, la concentrazione di mercurio o cadmio al centro dell'intervallo lineare dei sensori induttibili deve essere utilizzata per le variabili di prova.Ecco esempi di un risultato inconcludente con lo zinco. E un risultato conclusivo con magnesio e manganese sulla biodisponibilità di mercurio al biosensore. Il risultato con lo zinco è inconcludente perché la fluorescenza costitutiva decade con fluorescenza induttiva che indica tossicità.Durante il tentativo di questa procedura è importante ricordare di inserire le concentrazioni di cadmio o mercurio in quanto queste verranno utilizzate per calibrare il biosensore. Seguendo questa procedura, altri metodi come la modellazione termodinamica dei sistemi acquosi possono essere eseguiti per rispondere a domande aggiuntive come specifiche specie chimiche di mercurio o cadmio influenzano la loro biodisponibilità. Non dimenticare che lavorare con cadmio e mercurio e acidi forti come l'acido solforico può essere estremamente pericoloso e precauzioni come l'uso di dispositivi di protezione individuale dovrebbero sempre essere prese durante l'esecuzione di questa procedura.Dopo il suo sviluppo questa tecnica ha spianato la strada ai ricercatori nel campo della microbiologia ambientale per esplorare il mercurio anaerobico quasi in tempo reale o la biodisponibilità di cadmio e i microbi geneticamente trattabili.

Research

JoVE Journal

Environment

Evaluation of Integrated Anaerobic Digestion and Hydrothermal Carbonization for Bioenergy Production

Valutazione della gestione integrata digestione anaerobica e carbonizzazione idrotermale per Bioenergy Production

Lignocellulosic biomass is one of the most abundant yet underutilized renewable energy resources. Both anaerobic digestion (AD) and hydrothermal ...

Ricerca

Ambiente

Detection of Foodborne Bacterial Pathogens from Individual Filth Flies

Rilevazione di origine alimentare batterica Pathogens da mosche individuale Filth

There is unanimous consensus that insects are important vectors of foodborne pathogens. However, linking insects as vectors of the pathogen causing a ...

Development of Sulfidogenic Sludge from Marine Sediments and Trichloroethylene Reduction in an Upflow Anaerobic Sludge Blanket Reactor

Sviluppo di Sulfidogenic fanghi da Marine Sedimenti e Tricloroetilene Riduzione in una coperta reattore Upflow anaerobica dei fanghi

The importance of microbial sulfate reduction relies on the various applications that it offers in environmental biotechnology. Engineered sulfate ...

Spotting Cheetahs: Identifying Individuals by Their Footprints

Spotting Cheetahs: Identificazione degli individui per le loro impronte

The cheetah (Acinonyx jubatus) is Africa's most endangered large felid and listed as Vulnerable with a declining population trend by the IUCN1. It ranges ...

Experimental Column Setup for Studying Anaerobic Biogeochemical Interactions Between Iron (Oxy)Hydroxides, Trace Elements, and Bacteria

Experimental Column Setup for Studying Anaerobic Biogeochemical Interactions Between Iron OxyHydroxides, Trace Elements, and Bacteria

Installazione colonna sperimentale per lo studio anaerobici biogeochimici interazioni tra batteri, oligoelementi e idrossidi di ferro (ossi)

Fate and speciation of trace elements (TEs), such as arsenic (As) and mercury (Hg), in aquifers are closely related to physio-chemical conditions, such as ...

Fluorescent Paper Strips for the Detection of Diesel Adulteration with Smartphone Read-out

Strisce di carta fluorescente per la rilevazione dell'adulterazione di Diesel con lettura di Smartphone

Three fluorescent molecular rotors of 4-dimethylamino-4-nitrostilbene (4-DNS) were investigated for their potential use as viscosity probes to indicate ...

A Precise and Autonomous System for the Detection of Insect Emergence Patterns

Un sistema preciso ed autonomo per l'individuazione di modelli di emersione degli insetti

Existing systems to measure insect emergence patterns have limitations; they are only partially automated and are limited in the maximum number of ...

Detection of Tilapia Lake Virus Using Conventional RT-PCR and SYBR Green RT-qPCR

Rilevamento di Tilapia Lago Virus mediante RT-PCR convenzionale e SYBR Green RT-qPCR

The aim of this method is to facilitate the fast, sensitive and specific detection of Tilapia Lake Virus (TiLV) in tilapia tissues. This protocol can be ...

An Induction System for Clustered Stomata by Sugar Solution Immersion Treatment in Arabidopsis thaliana Seedlings

An Induction System for Clustered Stomata by Sugar Solution Immersion Treatment in Arabidopsis thaliana Seedlings

Un sistema di induzione per cluster stomi da trattamento di immersione di soluzione di zucchero nei semenzali di Arabidopsis thaliana

Stomatal movement mediates plant gas exchange, which is essential for photosynthesis and transpiration. Stomatal opening and closing are accomplished by a ...

Cultivation of Green Microalgae in Bubble Column Photobioreactors and an Assay for Neutral Lipids

Coltivazione di microalghe verdi in bolla colonna fotobioreattori e un saggio di lipidi neutri

There is significant interest in the study of microalgae for engineering applications such as the production of biofuels, high value products, and for the ...