Name: an anaerobic biosensor assay for the detection of mercury and cadmium
Uploaded: 2018-12-17T13:00:00
Duration: 9 min 33 s
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嫌気性バイオ センサーの開発に洞察力に富んだ議論のためアメリプーラン ラボのよくメンバーとして 2 つの匿名のレビューアーからのコメントに感謝したいと思います。オンタリオ州と発見グラントから初期賞と店に自然科学から工学研究評議会カナダのアクセラレータ サプリメント本研究を資金しました。

著者が明らかに何もありません。

微生物バイオ センサーは、金属は、微生物との相互作用のメカニズムを識別するために便利なツールです。ここでは、Hg を定量化することができます, 方法について述べるIIと CdIIバイオアベイラビリティのグラム陰性菌の宿主細胞 (エシェリヒア属大腸菌) し、数時間以内定量的な結果を与える。このプロトコルの主な長所の 1 つは、強い結合リガンドまたは金属析出する可能性がありますコンポーネントを回避することによって露出媒体の重金属のスペシエーションの広範な制御をことが。重金属のスペシエーションをモデル化されており、PHREEQC17を使用してこの露出媒体のテストしかし他の重金属のスペシエーション ソフトウェアを展開可能性があります。ないの追加の配位子、Hg 種分化は 97% Hg(OH)2および 3 %hg (NH3)22 +として存在するはずの場合 Cd 種形成がある間は 59% の Cd-β-グリセロリン酸、25 %cd2 +、および 16% CdSO4として提示します。簡単な熱力学的モデリング ソフトウェアを使用して、ユーザーは露出メディアをデザインおよび興味の金属のバイオアベイラビリティをテストできます。さらに、バイオ センサー宿主細胞 (大腸菌NEB5α) は塩化ナトリウム濃度と pH (5 8.5) の広い範囲にわたって実行可能な (0 0.55 M)17。
Hg メチル化嫌気性プロセスは、この研究に記載されているプロトコルには酸素、金属のバイオアベイラビリティに嫌気性代謝のより正確な説明を可能にするための要件はありません。これは重要ですので、酸素の存在は、遺伝子発現プロファイル48,49を変更し、したがって、潜在的な輸送経路;したがってこのメソッドは、現在好気性の選択肢を既存優位をプレゼントします。ここで紹介バイオセンシング構造かもしれない水銀のメチル化 (例えば、Geobacter、デスルフォビブリオ属) のより関連するかもしれない他の嫌気性ホストで使用され、潜在的大腸菌よりも少なく扱いやすい。ここで紹介した方法の 1 つの現在の制限は、検出限界がまだ既存好気性システム4,19,37に反して、午後レベルに達していないこと。44を取られる必要しかしこれらの低い検出限界を達成することに注意する重要ないくつかの手順です: 私) 配位子の添加は Hg ソリューションのままで、(Hg 不可逆的なバインドされる微生物の細胞壁に吸着がないことを確認しておく必要そのバイオアベイラビリティ25,27には; を防止する表面のチオールをセルに参照図 3Aで Hg の閾値反応)、ii) 細胞密度、または iii への変更) merの輸送蛋白質を含むように遺伝的構成を変更-オペロン (すなわちマートとmerP)、Hg フラックスの増加セル50,51中。これらの変更は、環境に関連する状況を評価する際、Hg の低濃度を検出するに有益であるが、必ずしも理想的ではないでしょう。彼らがバイオアベイラビリティ41,42,の種分化の役割を評価するために調査官を許可しない複雑なメディアで設計されていたバイオ センサー カドミウム前は主に「原理の証明」として存在するのに対し43,44。
バイオ センサーは、金属種に bioavailable メカニズムを決定する際に非常に便利なツールです。ホストの有機体は Hg methylator ではないために、Hg がグラム陰性菌とない決定的な根拠を入力 Hg methylators が Hg を取得する方法をするための方法のためのモデルの開発にのみ使用があります。吸収の結果または質量バランス アプローチ10,15,20,45,46の使用として Hg バイオアベイラビリティ、メチル化などを確定するため他の方法が存在します。という、ここで紹介した方法は、実行可能なセルの準リアルタイム バイオアベイラビリティ データの利点を提供します。環境マトリックスで Hg または Cd の合計レベルが定量化されるこの方法はお勧めしません。ICP-MS、FAAS (Cd 分析用) (Hg の冷蒸気原子吸光法など多くのより容易に利用可能な標準的な方法があります36環境中微量金属濃度を決定するためのバイオ センサーの提案の使用にもかかわらず分析)。バイオ センサーはただし、かどうか特定環境の行列を拡張またはバイオアベイラビリティ; を妨げる可能性がありますを決定するために使用これを実現するには、標準の追加を実行します。
露出メディアの pH への変更は任意の場所 5 と 8.5 の範囲内で適切な pKa を持つバッファーの代替遊離酸とモップ無料酸 (バッファー) を交換提供 (適切なバッファー (フェレイラらのリストをご覧ください(2015)47)、露出メディアを作るとき、適切な pH に島で調整。さらに、メソッドは、他の転写制御因子を使用して他の金属を拡張することが Hg、Cd に限定されていません。
Hg または Cd のバイオアベイラビリティの O2とフマル酸など他の電子アクセプターの影響を探索する露出アッセイを変更可能性があります。電子アクセプターとして O2とフマル酸を利用する方法にマイナーな修正のリクエストも承ります。
要約すると次の点を強調したいと思います:私)これらはバイオ センサーのキャリブレーションに使用される Cd または Hg 株式の濃度が手順 2 であることが不可欠です。II) 0.6 (± 0.1) の外径600露出日に細胞の成長を停止し、その注意は、バイオ センサー、細胞培養を再はこの細胞の密度に調整されてとき。III)最後に、露出媒体は露出日で細かいところまで行われることが重要です。(成長障害の可能性を回避する) に同時にプロトコルの成功を確保するため複数の文化を成長させる必要があり、成長培地は (メディアと可能な汚染の準安定性を回避する) に週間リメイクする必要があります。また、信号を生産するとき、生物学的複製 (複数細胞培養) が変動を表現することに注意する必要があります。蛍光応答文化によって異なりますが、特定の変数への応答で蛍光の動向は依然と多数の生物的複製を通じて同じする必要があります。

水銀 (Hg) が地球汚染物質と微生物をメチル化 Hg に、バイオアベイラビリティは食物網とその人間に可能な神経毒性影響と野生生物1を介してその biomagnification への第一歩。その微生物の水銀のメチル化は必要とする細胞内のプロセスが現在考えられる: i) bioavailable2,3,4,5,6,7 Hg の種、ii) 生理 Hg8,9,10をメチル化できる細胞のため。生物、カドミウム (Cd) bioaccumulates が foodwebs で biomagnifies しないのは、人々 と環境11急性暴露を原因として一般的な産業および商業プロセスで広く使用されています。微生物は環境に Hg の運命のいくつかの重要な役割を再生、Cd 地球化学や生態毒性に関するほとんどの研究微生物真核生物12に焦点を当てます。農作物 (米など) の消費量はカドミウム; への直接暴露の主な情報源です。この場合、根圏の微生物への Cd のバイオアベイラビリティに直接影響量の植物は13を蓄積することができます。
Hg 輸送経路は複雑であり、おそらく能動輸送ステップ14を含みます。最近仕事が HgIIが、Zn を使用することを提案した、トランスポーターが関与しているIIまたは MnIIトランスポーター7,15,16,17。CdIIは、誤って運ばれる仮定される一方二価金属輸送経路 (特に MnIIまたは ZnII) を介して細胞質に CdIIのメカニズム輸送中セルのまま投機的なおよびない Cd 固有の輸送経路は、識別された13,18をされています。トランスポーターの関与によらず、3 つの機械的要因は、最終的にセルに入力する金属の能力を決定する: ソリューション2,6,15, i) 重金属のスペシエーション16,17,19,20,21,22,23ii) 細胞膜17,24,25,26,27,28,29 biophysiochemical プロパティ ,30,31, および iii) 金属輸送サイト7,32にアクセスするための能力。(例えばEDTA)、汚染物質をキレート減らしたり硫黄鎖33、Cd、Hg は高親和性の溶存有機物 (DOM)、起因微生物生理学的条件下で無料のイオンとして存在する可能性が高い 34,35 (CdIIは、無料イオンまたはイオン対これらの ligands の不在として存在できます)。どのようにこれらの金属種が環境で彼らの運命に関連する条件の下で bioavailable を決定する効率的な方法が無い。例えば、Hg は嫌気条件14、下でメチル化、カドミウムと水銀が、種分化を還元型硫黄グループの整合性を維持する条件の下で調査することを必要とする軟質金属 (またはクラス B の陽イオン)。
微生物バイオ センサーは、この場合 Hg または Cd、金属の細胞内の濃度の応答で定量化可能なシグナルを出す細菌のセルです。な露出条件は、慎重に制御される金属が36セルを入力する方法を理解するための理想的なツールがあります。Hg バイオ センサーには通常merの調節の回路間融合遺伝子が含まれて-オペロン (含む遺伝子転写レギュレータ MerRas の演算子やプロモーターとしてよくオペロンの領域)、および遺伝子を報告 (などルクス、gfp、lac遺伝子)。水銀が細胞質に存在するダイズ、レポート遺伝子とその後の信号生産19,37の転写の結果にバインドします。特定の Cd バイオ センサー、通常cadCを使用して設計されていますcadAC、zntAまたはzntRエンコード転写レギュレータ38, しかし、ダイズが Cd5に低く、まだ定量化可能な親和性を持っていることは注目に値するです。ほとんどの好気性の制限により最近微生物バイオ センサーが残る無酸素条件下での金属の生体内変化についての洞察を提供することができないまで、通常発光や蛍光レポーター蛋白質を使用されます。これは、金属バイオアベイラビリティの嫌気性の検出が非常に困難条件の範囲で特に酸化還元 (例えば、硫化物とチオール) 敏感な配位子4,の存在下での彼らの環境運命に関連します。5,39。
軽減するための方法論的ハードル ライブ イメージング、Drepperらの酸素の不在で(2007 年) P. putidaから SB2 タンパク質の光酸素電圧ドメインに基づいて、フラビン ベースの蛍光蛋白質 (FbFp) を開発。このタンパク質ファミリーは酸素40の不在で蛍光を発することができます。建物 Drepperらの仕事は、私たちの研究室は Hg バイオアベイラビリティと塩分17の広い範囲にわたって好気、無酸素条件下での研究を可能にする嫌気性バイオ センサーを設計されています。現在の紙の準備および Hg または Cd のバイオアベイラビリティに影響を環境変数をテストするのには、バイオ センサーを使用する方法をについて説明します。バイオ センサーも共同環境で発生する可能性のある複数のストレスに応答するという事実に読者の注意を引くための手段として CdIIで実験を行うことにしました HgIIのバイオ センサーを開発しましたが行列;この場合 CdII転写レギュレータ ダイズ5にバインドする知られているために調べた。ここでは、代表的な校正といずれかの金属に関して線形機能の範囲を示します。我々 はまた与える例をバイオ センサーの結果は、決定的な (MgIIと MnII Hg バイオアベイラビリティ) と結論 (ZnII Hg バイオアベイラビリティ)。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>7 ml standard vial, rounded interior</td>
			<td>Delta Scientific</td>
			<td>200-007-20</td>
			<td>34 recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vial tray, 21 mm openings</td>
			<td>Delta Scientific</td>
			<td>730-2001</td>
			<td>4 for (4 x 8 grid)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 mm Closure</td>
			<td>Delta Scientific</td>
			<td>600-024-01</td>
			<td>32 recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LID CORNER NOTCH BLK STR CS/50</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Corning 3931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 96- well clear-bottom nonbinding surface microplate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Corning 3651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anaerobic Chamber (glovebox)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>The air in the anaerobic chamber should be (97 % N2 &#177; 2 % and 3 % H2 &#177; 2 %)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Palladium catalyst</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Converts O2 to H2O in the anaerobic chamber. Not required but recommended.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>450 (&#177;10) nM filter for the microplate reader</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 (&#177;10) nM filter for the microplate reader</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anaerobic culture vial (balch tubes) + rubber stoppers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Modified for anaerobic culture tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MA-3000 (mercury analyzer)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH probe</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any pH probe will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical sterile polypropylene centrifuge tubes.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m polyethersulfone syringe filter + syringe</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile/clean glass bottles</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For growth media and standards</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile/clean plastic or PTFE bottles</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For alkali solutions (NaOH/KOH)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents powders: Na2MoO4, Na2SeO4, H3BO3, NaOH, KOH, MnSO4, ZnSO4, CoCl2, NiCl2, ampicillin sodium salt, Difco M9 Minimal Salts, Glucose, MgSO4, Thiamine HCl, NaNO3, l-leucine, l-isoleucine valine, EDTA sodium salt, FeSO4, Sodium Beta-Gylcerophosphate, Mops free acid, (NH4)2SO4, Hg(NO3)2, CdCl2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Milli-Q water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Autoclaved or filter sterilized is fine.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysogeny Broth</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical grade H2SO4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an anaerobic biosensor assay for the detection of mercury and cadmium

微生物への水銀 (Hg) のバイオアベイラビリティは、有毒の Hg biomagnification 食物網の重要なステップです。カドミウム (Cd) 変換と細菌にバイオアベイラビリティが主食作物に蓄積量を制御します。これらの金属のバイオアベイラビリティはソリューションでは、しかしより特に水銀は有毒な monomethylmercury (MeHg) にメチル化 Cd が根に続く無酸素条件下での種分化に依存します。全細胞微生物バイオ センサーは、金属細胞質に入るし、金属の生体利用性を評価するために有用なツールしたがっているとき、定量化可能な信号を与えます。残念ながら、バイオセンシングに対するほとんどの取り組みは、酸素の存在下で機能する既存のレポーター蛋白質の機能が制限されるため好気環境に制約されているところ。本研究では, 準リアルタイムで、時間以内無酸素条件下で金属を検出する開発し、全細胞バイオ センサー法で機能を最適化する取り組みを提案します。我々 はバイオ センサーは、バイオアベイラビリティの金属に影響を与える環境のサイクリングに関連するどのように化学変数を評価助けることができる方法について説明します。次のプロトコルには (1) Hg を準備するためのメソッドが含まれています、Cd 規格 (2) 無酸素条件下で酸素、(3) デザインの不在でバイオ センサーを準備し、変数のシリーズが Hg または Cd のバイオアベイラビリティと (4) に与える影響を判断する実験を実行定量化とバイオ センサー データを解釈します。グルコの線形範囲を示し、金属誘導型耐性と構成の両方の系統を用いた金属のバイオアベイラビリティと毒性とを区別するメソッドの機能を示す例を提供します。

蛍光ピークはステップ 5.3 に従って定量化されている、一度、Hg または Cd のいずれかの相対バイオアベイラビリティに影響を与える変数を説明変数の濃度に応じて蛍光ピークの結果がグラフ化できます。たとえば、図 2の [HgII] で蛍光の較正曲線図 3 aに示した誘導データが得られます。HgIIの校正曲線は常に Hg 誘導ひずみ; の 3 つのコンポーネントが含まれています。閾値反応についての蛍光信号の生産の前に 1-2 nM HgIIは [HgII] に正比例直線範囲どこ5 nM HgIIは、その範囲と高原の中心に確実に常になりますどこ[HgII] を増やすして蛍光信号には、もはや。[HgII] の毒性は、信号の生産には影響を与えません信号生産構成のひずみの変化を示さない。図 3BのII Cd の誘導ひずみ; 2 つのコンポーネントが常にどこ200-300 nM CdIIに線形の範囲と高原の中心部になります確実に常に線形範囲。[CdII] に伴い蛍光シグナルの低下は、Cd 濃度が高い細胞に有毒である、1000 nm CdII高原後誘導蛍光生産の減少を説明できることを示しています。したがって、環境変数に関して Hg または Cd のバイオアベイラビリティをテストするとき、私達を使用して提案する5 Hg の nMIIと300 Cd の nMII。
信号生産いくつかのインスタンスで Hg または Cd のバイオアベイラビリティに正しく起因することができますが、他のケースで信号の生産は、バイオ細胞ホストの生理状態の変化によって影響を受けます (例えば興味の金属またはテスト環境は有害) です。図 4 aで 5 nM Hg バイオアベイラビリティは Zn のグラデーションにわたってテストされた (0-10 μ M)。両方 Hg 誘導型耐性と構成系統、Zn 濃度の増加と信号の同じような減少があります。したがって、1 つは信号低下のバイオアベイラビリティに起因または亜鉛の毒性の結果であるかどうか識別できません。図 4 b 、4 C、5 nm Hg バイオアベイラビリティは、Mg のグラデーションにわたってテストされたII (0-10 mM) と MnII (0-10 μ M)。Mg の増加II , MnII濃度減少誘導ひずみの蛍光信号。その一方で、構成のひずみが Mg の増加とともに蛍光性の減少を示さなかったII , Mn のII濃度 (MgII , MnIIにとって有益です、FbFp の生産で細胞によって示されるように蛍光信号の増加)。これは、セルが実行可能な Hg バイオアベイラビリティの減少から Hg 誘導ひずみの蛍光減少の結果を示しています。このデータを強調、また全体的なセル フィットネスの構成の測定を提供するためにすべてのバイオ センサー アッセイ方法重要。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58324/58324fig3.jpg"> 図 3: 水銀およびカドミウムを用いるバイオ センサーの直線範囲。最大蛍光測定相対蛍光ユニット (RFU) ± 1 標準偏差大腸菌NEB5α から放出される pUC57merR Pp (Hg 誘導) と pUC19Balch Pp (構成) の添加をかくまっているA) HgII (0-15 nM)B) CdII (0-1,000 nM) 嫌気性の条件の下で。蛍光だった 3 技術の平均が 37 ° C でレプリケートされます。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58324/58324fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58324/58324fig4.jpg"> 図 4: 亜鉛と不確定な結果とマグネシウム, マンガンによる決定的な結果の例です。最大蛍光測定相対蛍光ユニット (RFU) ± 1 標準偏差大腸菌NEB5α から放出される pUC57merR Pp (Hg 誘導) と pUC19Balch Pp (構成) の添加をかくまっているA) ZnII (0-10 μ M)、B) MgII (0-10 mM)、およびC) MnII (0-10 μ M) 嫌気性の条件の下で。[HgII] が 5 に設定されたすべてのトリートメントや蛍光の nM は 37 ° C で技術的な反復実験 3 の平均。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58324/58324fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

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An Anaerobic Biosensor Assay for the Detection of Mercury and Cadmium

ここでは、どのように異なる環境変数を評価する嫌気性の細胞化バイオ センサーを使用するプロトコルを提案無酸素環境で細菌に Hg と Cd のバイオアベイラビリティに影響を与えます。

水銀、カドミウムの検出のための嫌気性バイオ アッセイ

Mercury (Hg) bioavailability to microbes is a key step to toxic Hg biomagnification in food webs. Cadmium (Cd) transformations and bioavailability to ...

この方法は、異なる環境変数が細菌に対するバイオアベイラビリティにどのような影響を与えるかなど、カドミウムと水銀の生物地球化学的サイクリングに関する重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、酸素の存在に関係なく、準リアルタイムのバイオアベイラビリティデータと生存細胞を提供することです。一般的に、この方法に新しい個人は、細部に非常に細心の注意を払う必要がある多くの時間に敏感なステップがあるので苦労します。手順をデモンストレーションするベン、私の研究室の大学院生になります。アッセイの準備のために、水銀誘導性バイオセンサーと構成的に発現したバイオセンサーをマイナス80°Cのクライオストックから取り出します。アンピシリン1ミリリットル当たり120マイクログラムを含むリソゲニースーププレートに細胞をプレートします。一晩摂氏37度でインキュベーターでプレート培養を成長させます。4:30と5p.mの間にアンピシリンとLBの10ミリリットルの培養物を接種し、220rpmで振ると摂氏37度で一晩成長する。翌朝、9時から10時.m時に、培養物と以前に調製した成長培地を嫌気室に持ち込む。その後、新鮮な成長培地の8ミリリットルと無菌バルチリンチューブにアンピシリンのミリリットルあたり210マイクログラムを追加します。今、一晩成長した培養物の2ミリリットルを収集し、2ミリリットルマイクロ遠心分離チューブに移します。10,000 RCFで90秒間遠心分離した後、上清を取り除き、新鮮な成長培地の2ミリリットルで再懸濁します。次に、新鮮な成長培地とアンピシリンの8ミリリットルを含むバルチチューブに再懸濁培養液を加えます。滅菌技術を使用して、気性チャンバーから取り外す前に、慎重にバルチチューブにゴム栓を置きます。その後、チューブをインキュベーターに入れ、220rpmで振ると摂氏37度で嫌気性で成長します。3と5 p.mの間。培養液、新しい滅菌バルチチューブ、および成長培地と共に、バルチチューブを嫌気室に持ち込みます。滅菌バルチチューブにアンピシリンを用いた新鮮な成長培地10ミリリットルに培養液100マイクロリットルを加える。滅菌技術を使用して、慎重にバルチ管の上にゴム栓を置きます。嫌気性チャンバーからチューブを取り出してから、摂氏37度で一晩成長し、220rpmで揺れます。翌日の9時から10時.mの間で、培養液と成長培地を嫌気室に戻す。再び滅菌バルチチューブに成長培地とアンピシリンの8ミリリットルを追加します。一晩成長した培養物の2ミリリットルを2ミリリットルのマイクロ遠心分離管に移す。前のように遠心分離に続いて、上清を取り除き、新鮮な成長培地の2ミリリットルで細胞を再懸濁する。次に、新鮮な成長培地とアンピシリンを含むバルチチューブに再懸濁培養液を加える。滅菌技術を使用して、慎重にバルチ管の上にゴム栓を置きます。チャンバーから取り出し、220rpmで揺れで摂氏37度で嫌気性成長をします。分光光度計を使用して培養物の成長を監視し、その後600ナノメートルまたはOD600で光学密度を測定します。3~4時間の予想成長の後、培養は6のOD600に達するはずです。今嫌気室にチューブを持って来て、2つのミリリットルマイクロ遠心分離管に培養を移します。前のように遠心分離に続いて上清を除去し、新鮮な暴露媒体の2ミリリットルで各細胞の口蓋を再懸濁する。この洗浄工程を一度繰り返して、成長培地の痕跡を除去する。次に、細胞培養の両方のマイクロ遠心チューブを7ミリリットルPTFE標準バイアルに組み合わせて、露出アッセイに使用するためのバイオセンサーストックを取得します。実験を開始する前に、嫌気性モニターをチェックして、嫌気性チャンバーに酸素がないことを確認してください。96ウェルテンプレートに従ってプレートレイアウトを設計します。3つの技術的な複製で実験を実行するには、バイアルを設定するために4で8グリッドで最もよく表される32の異なる治療を可能にします。アッセイプレートレイアウトに従って、4つ8グリッドを設定します。その後、トレイに7ミリリットルPTFE標準バイアルを入れ。バイアルは、バイアルの外側を操作することによってのみ処理する必要があります。各治療に対応する各バイアルに露光媒体のボリュームを追加します。各バイアルにプレートのレイアウトに従ってテストされる化学変数の対応する容積を加える。今、濃度が200マイクロモルになるように、各バイアルに硝酸塩を追加します。構成バイオセンサー治療ブランクの場合は、このステップを除外してください。バイアルに水銀を加えるために、最初に4〜8マイクロモルストックを取り、よく振ります。溶液と露光媒体を7ミリリットルのPTFEバイアルで100~250ナノモルの濃度に希釈し、水銀溶液を働かせる。この作業ソリューションから、プレートレイアウトに従って必要なバイアルに水銀を追加します。水銀またはカドミウムを添加した後、手動で軌道運動でプレートを振る。水銀またはカドミウムが溶液中で分化するのに必要な時間に応じて、実験は今一時停止することができます。実験が再開されたら、ピペットバイオセンサーストックを前後に静かに入れ、均質性を確保します。その後、各バイアルにバイオセンサーストックの100マイクロリットルを追加し、手動でプレートを振ります。プレートリーダーを摂氏37度に温め、2ポイント5〜5分ごとに読み取りで10時間の運動走行を設定します。読み取り値の間の軌道の揺れ。440ナノメートルの蛍光励起と500ナノメートルの放出で蛍光測定を取るために実行を設定します。今ピペット200マイクロリットルは、4つ、8グリッドの各PTFEバイアルから96ウェルプレートの対応する井戸に入ります。ピペットは、各200マイクロリットルを移す前に5回前後に行き来する。ピペットチップを捨てる代わりに、ピペットチップをPTFEバイアルに残してピペットの進行状況を追跡します。96ウェルプレートをプレートリーダーのトレイに入れ、その後、96ウェルプレートに蓋を置き、アッセイを開始します。ここでは、補正された蛍光データを時間の関数として示す代表的な結果を示す。蛍光は、誘導可能なバイオセンサーへの水銀濃度の増加とともに示される。すべての値は、水銀コントロールなしに空白です。蛍光ピークは、水銀またはカドミウム濃度の関数として蛍光シグナルを示すために定量することができる。誘導性と構成バイオセンサーの両方に対して、リンベクレンジの水銀またはカドミウム濃度を使用して、変数をテストする必要があります。亜鉛の結果が決定的でない例を次に示します。そして、バイオセンサーへの水銀バイオアベイラビリティにマグネシウムおよびマンガンとの決定的な結果.亜鉛を用いた結果は、毒性を示す誘導蛍光で構成蛍光が減衰するため決定的ではない。この手順を試みる間、これらはバイオセンサーの較正に使用されるようにカドミウムまたは水銀のいずれかの濃度を入力することを忘れないでください。この手順に従って、水系の熱力学的モデリングのような他の方法は、水銀またはカドミウムの特定の化学種がそれらの生物学的利用能にどのように影響するかなどの追加の質問に答えるために行うことができる。カドミウムや水銀、硫酸などの強酸を使用することは非常に危険であり、個人的な保護具の着用などの予防措置は、常にこの手順を実行している間に取られるべきであることを忘れないでください。その開発の後、この技術は、環境微生物学の分野の研究者が準リアルタイム嫌気性水銀またはカドミウムバイオアベイラビリティと遺伝的に難解な微生物を探求する道を開いた。

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An Induction System for Clustered Stomata by Sugar Solution Immersion Treatment in Arabidopsis thaliana Seedlings

An Induction System for Clustered Stomata by Sugar Solution Immersion Treatment in Arabidopsis thaliana Seedlings

シロイヌナズナの幼苗における砂糖ソリューション浸漬処理による気孔のクラスター化の誘導システム

Stomatal movement mediates plant gas exchange, which is essential for photosynthesis and transpiration. Stomatal opening and closing are accomplished by a ...

Cultivation of Green Microalgae in Bubble Column Photobioreactors and an Assay for Neutral Lipids

中性脂質のバブル列フォトバイオリアクターとアッセイで緑の微細藻類の栽培

There is significant interest in the study of microalgae for engineering applications such as the production of biofuels, high value products, and for the ...

水銀、カドミウムの検出のための嫌気性バイオ アッセイ

水銀、カドミウムの検出のための嫌気性バイオアッセイ