Name: an anaerobic biosensor assay for the detection of mercury and cadmium
Uploaded: 2018-12-17T13:00:00
Duration: 9 min 33 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Anaerobic Biosensor Assay for the Detection of Mercury and Cadmium at JoVE.com

Vi vil gjerne takke kommentarer fra to anonyme korrekturlesere som godt medlemmer av laboratoriet Poulain innsiktsfulle diskusjon på utviklingen av det anaerob biosensor. En tidlig forsker pris fra provinsen Ontario og Discovery stipend og en akselerator supplement fra naturvitenskap og Engineering Forskningsrådet Canada til A.J.P. finansiert denne studien.

Forfatterne ikke avsløre.

Mikrobiell biosensors er nyttige verktøy til å identifisere mekanismer som bruker metall mikrober. Her beskriver vi en metoden det anaerob kan kvantifisere HgII og CdII biotilgjengelighet Gram-negative verten celle (E. coli) og gi en målbare resultat i noen timer. En av de store styrkene til denne protokollen er at den tillater omfattende kontroll av metall artsdannelse i eksponering medium ved å unngå sterke bindende ligander eller komponenter som kan føre til metall nedbør. Metall artsdannelse er modellert og testet i denne eksponering mediet bruker PHREEQC17, men andre metall artsdannelse programvare kan distribueres. Hvis ingen ekstra ligander, Hg artsdannelse forventes å være til stede som 97% Hg(OH)2 og 3% Hg (NH3)22 +, mens Cd artsdannelse skal presentere som 59% Cd-β-Glycerophosphate, 25% Cd2 +og 16% CdSO4. Bruker en enkel termodynamisk modellering programvare, kan brukeren design eksponering media og teste biotilgjengeligheten av metall rundt. I tillegg biosensor vert cellen (E. coli NEB5α) er levedyktig over et bredt spekter av pH (5 8.5) og NaCl konsentrasjon (0-0,55 M)17.
HG metylering er en anaerob prosess, og protokollen i denne studien har ikke et behov for oksygen, slik at mer presis beskrivelse av anaerob stoffskiftet på metall biotilgjengelighet. Dette er viktig fordi oksygeninnhold endrer genet uttrykket profiler48,49 , og dermed potensial transportere baner; Derfor presenterer denne metoden en fordel over gjeldende exising aerobic alternativer. Den biosensing konstruere presenteres her kan potensielt brukes med andre anaerob verter som er mer relevante for kvikksølv metylering (f.eks Geobacter, Desulfovibrio), men kanskje mindre tett enn E. coli. En gjeldende begrensning av tilnærming presenteres her er at våre grensen for påvisning ikke har ennå nådd pM nivåer, i motsetning til eksisterende aerobic systemer4,19,37. Det er imidlertid viktig å merke seg at for å oppnå disse lav oppdagelsen grensene flere tiltak må tas44: jeg) ligand tillegg er nødvendig for å sikre at Hg forblir i løsningen og ikke adsorberes på mikrobiell cellen veggen (Hg vil bli irreversible bundet til celle overflaten thiols hindrer sin biotilgjengelighet25,27; se terskelen svaret for Hg i figur 3A), ii) endringer celle tetthet eller iii) endre den genetiske konstruere å inkludere transport proteiner av mer-operon ( merT og merP), økende Hg fluks inni cellen50,51. Disse endringene vil være gunstig oppdage lave konsentrasjoner av Hg, men ikke nødvendigvis ideelt når vurdere miljøvennlige relevante situasjoner. Mens tidligere kadmium biosensors finnes hovedsakelig som en "proof of prinsippet", er de utformet i komplekse medier som ikke tillater etterforskeren å vurdere rollen artsdannelse på biotilgjengelighet41,42, 43 , 44.
Biosensor er en utrolig nyttig verktøyet å bestemme mekanismer som metall arter er bioavailable. Fordi verten organisme ikke er en Hg-methylator, kan det bare brukes til å utvikle en modell for hvordan Hg kan angi Gram-negative bakterier og ikke en definitiv begrunnelse for hvordan Hg-methylators skaffe Hg. Det finnes andre metoder for å bestemme Hg biotilgjengelighet, som metylering, som et resultat av opptak eller bruk av en masse balanse tilnærming10,15,20,45,46. Som blir sagt, tilbyr metoden presenteres her fordelen av kvasi sanntid biotilgjengelighet data i levedyktig celler. Vi anbefaler ikke at denne metoden brukes å kvantifisere totale Hg eller Cd nivåer i en miljømessig matrise. Til tross for den foreslåtte bruken av biosensors å bestemme metall konsentrasjonene i miljøet36, er mange lettere tilgjengelig standard metoder tilgjengelige som ICP-MS, FAAS (for Cd analyse) eller kald damp atomic absorpsjon spektroskopi (for Hg analyse). Biosensor kan imidlertid brukes til å fastslå om en gitt miljømessige matrise har potensial til å forbedre eller hemme biotilgjengelighet; Dette oppnås ved å utføre standard filer.
PH i media eksponering kan endres til hvor som helst innen 5 og 8.5, forutsatt MOPPER gratis syre (buffer) utveksles med alternative gratis syre en buffer med den aktuelle pKa (se listen over aktuelle buffere (Ferreira et al. (2015) 47) og justert med KOH til riktig pH når media eksponering. I tillegg metoden er ikke begrenset til Hg og Cd, men kan bli utvidet til andre metaller med andre transkripsjon regulatorer.
Eksponering analysen kan endres for å utforske påvirkning av andre elektron acceptors som O2 og fumarate på Hg eller Cd biotilgjengelighet. Mindre endringer til metoden å utnytte både O2 og fumarate som elektron acceptors er tilgjengelig på forespørsel.
Oppsummert ønsker vi å understreke følgende punkter: jeg) er det viktig at konsentrasjonen av Cd eller Hg aksjer er kjent i trinn 2, som dette vil bli brukt til å kalibrere biosensor. II) eksponering dag, veksten av celler må stoppes på et OD600 på 0,6 (± 0.1) og at omsorg tas når resuspending cellekulturer, som biosensor er kalibrert til denne cellen tetthet. III) endelig er det viktig at eksponering mediet er laget omhyggelig ved eksponering. For å sikre suksess for protokollen, flere kulturer bør dyrkes samtidig (å omgå muligheten for vekst svikt) og vekstmediet skal gjenvinnes ukentlig (for å omgå metastability av media og mulig smitte). Det bør også bemerkes at biologiske replikat (flere cellekulturer) express variasjon når det gjelder signal produksjon. Selv om fluorescerende svarene kan variere fra kultur til kultur, bør fluorescerende trender som svar på en gitt variabel forbli den samme gjennom mange biologiske gjentak.

Kvikksølv (Hg) er en global forurensende sin biotilgjengelighet til Hg methylating mikrober er første skritt mot sin biomagnification gjennom næringskjeder og mulig nevrotoksiske effekter i menneskelig og dyreliv1. Det er tenkt at mikrobielle Hg metylering er en intracellulær prosess som krever: i) artene av Hg skal bioavailable2,3,4,5,6,7 II) for cellen være fysiologisk i stand til methylating Hg8,9,10. Kadmium (Cd) bioaccumulates i organismer, men gjør ikke biomagnifies i foodwebs og er mye brukt i industrielle og kommersielle prosesser som vanligvis forårsaker akutt eksponeringer i mennesker og miljø11. Selv om mikrober spille flere sentrale roller i skjebnen til Hg i miljøet, fokus de fleste studier Cd geokjemi og økotoksikologi på mikrobiell eukaryoter12. Forbruket av jordbruksprodukter (f.eks ris) er hovedkilden til direkte eksponering mot kadmium; i dette tilfellet biotilgjengeligheten av Cd for mikrober av rhizosphere direkte påvirker mengden planter kan akkumulere13.
HG transport veier er komplekse og muligens involverer en aktiv transport trinn14. Når en transporter er involvert, siste verk foreslo at HgII bruker en ZnII eller MnII transporter7,15,16,17. Mens CdII er antatt transporteres tilfeldigvis i stoffer gjennom divalent metall transport veier (spesielt MnII eller ZnII) mekanismer for CdII transportere innsiden cellene forblir spekulative og ikke Cd-spesifikke transport veien har vært identifisert13,18. Uansett hva transportørene, tre mekanistisk faktorer til slutt bestemmer evne til metaller inn en celle: i) av metall artsdannelse i løsning2,6,15, 16 , 17 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23, ii) biophysiochemical egenskaper av cellemembranen17,24,25,26,27,28,29 ,30,31og iii) muligheten for metall til en transport område7,32. CD og Hg er usannsynlig å finnes som ledig ioner under mikrobiell fysiologisk relevante forhold på grunn av deres høy affinitet for oppløst organisk saken (DOM), chelaterande forurensninger (f.eks EDTA) eller redusert svovel moieties33, 34,35 (CdII kan finnes som en gratis ion eller skjemaet ion-parene i fravær av disse ligander). Det er en mangel på effektiv metoder å avgjøre hvordan disse metall artene er bioavailable under forhold som er relevante for deres skjebne i miljøet. For eksempel Hg er denaturert under anaerobe forholdene14, og både kadmium og Hg er myke metaller (eller klasse B kasjoner), som krever at deres artsdannelse undersøkes under forhold som opprettholde integriteten til redusert svovel grupper.
Mikrobiell biosensors er bakterielle celler som avgir et kvantifiserbare signal svar intracellulær konsentrasjonen av metall, i dette tilfellet Hg eller Cd. Som sådan, er de ideelt verktøy for å forstå hvordan metaller inn en celle36, forutsatt at eksponering forhold er nøye kontrollert. HG biosensors inneholder vanligvis genet fusjoner mellom regulatoriske krets av mer-operon (inkludert gener koding for transkripsjon regulator MerRas samt operatør og promoter regioner i operon) og rapportering gener (f.eks Lux, gfp, lac gener). Når kvikksølv i cytoplasma, vil det binde til MerR, noe som resulterer i transkripsjon av rapportering gener og påfølgende signal produksjon19,37. Bestemt Cd biosensors utformes vanligvis i cadC, cadAC, zntA eller zntR kodet transkripsjon regulatorer38, men det er verdt å merke seg at MerR har en lavere, men kvantifiserbare affinitet til Cd5. På grunn av aerobic begrensning av de fleste vanlig selvlysende eller fluorescerende reporter proteiner, inntil nylig mikrobiell biosensors forble ikke tilby innsikt i biotransformation av metaller under anoksisk forhold. Dette gjør anaerob påvisning av metaller biotilgjengelighet svært vanskelig over en rekke forhold gjelder for deres miljøskjebne, spesielt i nærvær av redoks følsom ligander (f.eks sulfide og thiols)4, 5 , 39.
For å avhjelpe de metodologiske hinderet å live bildebehandling i fravær av oksygen, Drepper et al. (2007) har utviklet en flavin-baserte fluorescerende protein (FbFp), basert på lys oksygen spenning domene SB2 protein fra P. putida. Denne protein familien er kjøpedyktig fluoresce i fravær av oksygen40. Bygge på arbeidet til Drepper et al., utviklet vår lab en anaerob biosensor muliggjør studiet av Hg biotilgjengelighet under oksisk og anoksisk og over et bredt spekter av saltholdighet 17. I dagens papir beskriver vi hvordan å forberede og bruke biosensor for å teste miljøvariabler innflytelse på Hg eller Cd biotilgjengelighet. Selv om vi utviklet biosensor HgII, valgte vi å utføre eksperimenter med CdII å trekke leserens oppmerksomhet til det faktum at biosensors også kan svare til flere stressfaktorer som co opptrer i miljømessig matriser; i dette tilfellet CdII ble undersøkt fordi det er kjent for å binde til transcriptional regulator MerR5. Her viser vi representant kalibrering og funksjonelle lineær områder med hensyn til enten metall. Vi også gi et eksempel når den biosensor resultater er avgjørende (MgII og MnII på Hg biotilgjengelighet) og mangelfulle (ZnII på Hg biotilgjengelighet).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>7 ml standard vial, rounded interior</td>
			<td>Delta Scientific</td>
			<td>200-007-20</td>
			<td>34 recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vial tray, 21 mm openings</td>
			<td>Delta Scientific</td>
			<td>730-2001</td>
			<td>4 for (4 x 8 grid)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 mm Closure</td>
			<td>Delta Scientific</td>
			<td>600-024-01</td>
			<td>32 recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LID CORNER NOTCH BLK STR CS/50</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Corning 3931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 96- well clear-bottom nonbinding surface microplate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Corning 3651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anaerobic Chamber (glovebox)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>The air in the anaerobic chamber should be (97 % N2 &#177; 2 % and 3 % H2 &#177; 2 %)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Palladium catalyst</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Converts O2 to H2O in the anaerobic chamber. Not required but recommended.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>450 (&#177;10) nM filter for the microplate reader</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 (&#177;10) nM filter for the microplate reader</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anaerobic culture vial (balch tubes) + rubber stoppers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Modified for anaerobic culture tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MA-3000 (mercury analyzer)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH probe</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any pH probe will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical sterile polypropylene centrifuge tubes.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m polyethersulfone syringe filter + syringe</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile/clean glass bottles</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For growth media and standards</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile/clean plastic or PTFE bottles</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For alkali solutions (NaOH/KOH)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents powders: Na2MoO4, Na2SeO4, H3BO3, NaOH, KOH, MnSO4, ZnSO4, CoCl2, NiCl2, ampicillin sodium salt, Difco M9 Minimal Salts, Glucose, MgSO4, Thiamine HCl, NaNO3, l-leucine, l-isoleucine valine, EDTA sodium salt, FeSO4, Sodium Beta-Gylcerophosphate, Mops free acid, (NH4)2SO4, Hg(NO3)2, CdCl2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Milli-Q water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Autoclaved or filter sterilized is fine.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysogeny Broth</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical grade H2SO4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an anaerobic biosensor assay for the detection of mercury and cadmium

Kvikksølv (Hg) biotilgjengelighet for mikrober er et viktig skritt til giftige Hg biomagnification i næringskjeder. Kadmium (Cd) transformasjoner og biotilgjengelighet for bakterier styre hvor som vil akkumuleres i stift matavlinger. Biotilgjengeligheten av disse metallene er avhengig av deres artsdannelse i løsningen, men mer spesielt under anoksisk forhold der Hg er denaturert til giftige monomethylmercury (MeHg) og Cd vedvarer i rhizosphere. Hele celle mikrobiell biosensors gir et kvantifiserbare signal når et metall inn stoffer og er derfor nyttig verktøy å vurdere metall biotilgjengelighet. Dessverre har mest biosensing innsats så langt vært begrenset til oksisk miljøer på grunn av den begrensede evnen til eksisterende reporter proteiner til funksjonen i fravær av oksygen. I denne studien presenterer vi vår innsats for å utvikle og optimalisere en hel celle biosensor analysen kan fungere anaerob som kan oppdage metaller under anoksisk tilstand i kvasi sanntid og innen timer. Beskriver vi hvordan biosensor kan hjelpe vurdere hvordan kjemiske variabler gjelder miljømessig sykling metaller påvirker deres biotilgjengelighet. Følgende protokollen inneholder metoder for å (1) forberede Hg og Cd-standarder under anoksisk forhold, (2) – biosensor i fravær av oksygen, (3) design og gjennomføre et eksperiment for å finne ut hvordan en rekke variabel påvirker Hg eller Cd biotilgjengelighet og (4) å kvantifisere og tolke biosensor data. Vi viser lineær områdene av biosensors og gi eksempler viser metodens evne til å skille mellom metall bioavailability og toksisitet ved å benytte både metall-induserbart og konstituerende stammer.

Når fluorescens toppene har vært kvantifisert etter trinn 5.3, kan resultatet av fluorescens toppene fremstilles grafisk ifølge variabel konsentrasjonen illustrerer hvordan variabelen påvirker relative biotilgjengeligheten av Hg eller Cd. For eksempel vil kalibreringskurven av fluorescens over [HgII] fra figur 2 gi induserbart dataene som vises i figur 3A. For HgII kalibrering kurven vil alltid inneholde 3 komponenter for Hg-induserbart belastningen; terskelen svar på ca 1-2 nM HgII før fluorescens signal produksjon er lineært proporsjonal med [HgII], lineær området der 5 nM HgII blir pålitelig alltid i midten av dette området, og et platå der økende [HgII] vil ikke øke fluorescens signal. Ingen endring i signal produksjon på konstituerende belastningen viser at toxicity fra [HgII] ikke påvirker signal produksjon. For CdII i figur 3Ber det alltid 2 komponenter for induserbart belastningen; en lineær området der 200-300 nM CdII pålitelig alltid vil være i sentrum av lineær området og et platå. En nedgang i fluorescens signal med økende [DVDII] viser at høyere Cd konsentrasjoner er giftig for cellene og kan forklare en nedgang i induserbart fluorescens produksjon etter platået på 1000 nM CdII. Derfor når testing Hg eller Cd biotilgjengelighet med hensyn til en miljømessig variabel, foreslår vi bruke 5 nM for HgII og 300 nM for CdII.
I noen tilfeller signal produksjon kan riktig tilskrives Hg eller Cd biotilgjengelighet, men i andre tilfeller signal produksjon kan påvirkes av variasjon i fysiologisk tilstand hos biosensor celle verten (f.eks metall rundt eller miljøforhold testet er giftig). I figur 4A, 5 nM Hg biotilgjengelighet ble testet over en gradient Zn (0-10 µM). Både Hg-induserbart og konstituerende stammer er det en tilsvarende reduksjon i signal med økende Zn konsentrasjoner. Derfor kan ikke en diskriminere signalet skyldes senket biotilgjengelighet eller er et resultat av Zn toksisitet. I figur 4B og 4 C, 5nM Hg biotilgjengelighet ble testet over en gradient MgII (0-10 mM) og MnII (0-10 µM). Økende MgII og MnII konsentrasjoner redusert fluorescens signalet fra induserbart belastningen. På den annen side, grunnleggende belastningen ikke viste en nedgang i fluorescens med økende MgII og MnII konsentrasjoner (MgII og MnII er gunstig for cellene i produksjon av FbFp, som demonstrert av en økning i fluorescens signalet). Dette viser at cellene levedyktig og fluorescens reduksjon av Hg-induserbart belastningen skyldes en nedgang i Hg biotilgjengelighet. Dataene understreker hvor viktig det er for alle biosensor analyser å også tilby grunnleggende målinger av cellen totalhelse.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58324/58324fig3.jpg"> Figur 3: lineær celleområder biosensor med kvikksølv og kadmium. Maksimal fluorescens måles som relativ fluorescens enheter (RFU) ± 1 standardavvik slippes ut av E. coli NEB5α skjuler pUC57merR-Pp (Hg-induserbart) og pUC19Balch-Pp (Constitutive) med tillegg av A) HgII (0-15 nM) og B) CdII (0-1000 nM) under anaerob forhold. Fluorescens var gjennomsnittet av 3 teknisk replikerer på 37 grader. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58324/58324fig3large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58324/58324fig4.jpg"> Figur 4: eksempel på en usikker resultat med sink og en konkluderende resultat med Magnesium og mangan. Maksimal fluorescens måles som relativ fluorescens enheter (RFU) ± 1 standardavvik slippes ut av E. coli NEB5α skjuler pUC57merR-Pp (Hg-induserbart) og pUC19Balch-Pp (Constitutive) med tillegg av A) ZnII (0-10 µM), B) MgII (0-10 mM), og C) MnII (0-10 µM) under anaerob forhold. [HgII] ble satt til 5 nM for alle behandlinger og fluorescens var gjennomsnittet av 3 teknisk gjentak på 37 grader. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58324/58324fig4large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>

Watch this Scientific Journal Video about An Anaerobic Biosensor Assay for the Detection of Mercury and Cadmium at JoVE.com

An Anaerobic Biosensor Assay for the Detection of Mercury and Cadmium

Her presenterer vi en protokoll for å bruke en anaerob hele celle mikrobiell biosensor for å vurdere hvordan ulike miljømessige variabler påvirker biotilgjengeligheten av Hg og Cd for bakterier i anoksisk miljøer.

En anaerob Biosensor analysen for påvisning av kvikksølv og kadmium

Mercury (Hg) bioavailability to microbes is a key step to toxic Hg biomagnification in food webs. Cadmium (Cd) transformations and bioavailability to ...

Denne metoden kan bidra til å svare på viktige spørsmål om biogeokjemisk sykling av kadmium og kvikksølv som hvordan ulike miljøvariabler påvirker deres biotilgjengelighet til bakterier. Den største fordelen med denne teknikken er at den tilbyr kvasi sanntidbiotilgjengelighetsdata og levedyktige celler uavhengig av tilstedeværelsen av oksygen. Vanligvis enkeltpersoner nye til denne metoden vil slite fordi det er mange tid følsomme skritt som krever svært omhyggelig oppmerksomhet på detaljer.Å demonstrere prosedyren vil være Ben, en grad student fra laboratoriet mitt. For å forberede analysen, hent kvikksølvinduserbar biosensor og den konstituerende uttrykte biosensoren fra en minus 80 grader Celsius cryo lager. Plate cellene på Lysogeny kjøttkraft plater som inneholder 120 mikrogram per milliliter ampicillin.Dyrke platekulturene i en inkubator ved 37 grader Celsius over natten. Mellom 4:30 og 5 p.m. inokulerer en kultur i ti milliliter LB med ampicillin og vokse over natten på 37 grader Celsius med risting på 220 rpm.På mellom ni og ti .m neste morgen bringe kulturen samt tidligere forberedt vekstmedium inn i anaerob kammeret. Deretter legger du til åtte milliliter frisk vekst medium og 210 mikrogram per milliliter ampicillin i en steril balch tube.Samle nå to milliliter av den voksne kulturen over natten og overfør til et to milliliter mikro sentrifugerør. Etter sentrifugering på 10, 000 RCF i 90 sekunder, fjerne supernatant og resuspend i to milliliter av frisk vekst medium. Deretter legger du til den gjenbrukte kulturen til balch-røret som inneholder åtte milliliter frisk vekstmedium og ampicillin.Bruk steril teknikk, legg forsiktig en gummipropp på balchrøret før du fjerner den fra det anaerobe kammeret. Plasser deretter røret i en inkubator og vokse anaerobically ved 37 grader Celsius med risting på 220 rpm. Mellom tre og fem .m.bringe balch røret med kulturen, en ny steril balch tube, og vekstmediet inn i anaerob kammeret. Tilsett 100 mikroliter av kulturen til 10 milliliter frisk vekstmedium med ampicillin i det sterile balchrøret. Bruk steril teknikk, legg forsiktig en gummipropp på ballerøret.Fjern røret fra det anaerobe kammeret før du vokser det over natten ved 37 grader Celsius med risting ved 220 o/min. Mellom ni og ti .m neste dag, overføre kulturen og vekstmediet tilbake til det anaerobe kammeret.Igjen legge åtte milliliter vekst medium og ampicillin i en steril balch tube. Overfør to milliliter av den voksne kulturen over natten til et to milliliter mikro sentrifugerør. Etter sentrifugering som før, fjern de overnaturante og gjenoppuspend cellene i to milliliter med frisk vekstmedium.Tilsett deretter den gjenbrukte kulturen til balchrøret som inneholder det friske vekstmediet og ampicillin. Bruk steril teknikk, legg forsiktig en gummipropp på ballerøret. Fjern den fra kammeret og vokse anaerobically ved 37 grader Celsius med risting på 220 rpm.Overvåk kulturens vekst ved hjelp av et spektrofotometer ved å virvle kulturen og deretter måle den optiske tettheten ved 600 nanometer eller OD600. Etter tre til fire timer med forventet vekst, bør kulturen nå en OD600 på 6. Ta nå røret i det anaerobe kammeret og overfør kulturen til to to milliliter mikro sentrifugerør.Etter sentrifugering som før fjerne supernatant og resuspend hver celle gane i to milliliter av frisk eksponering medium. Gjenta dette vasketrinnet én gang for å fjerne spor av vekstmediet. Nå kombinerer du begge mikro sentrifugerørene av cellekulturen i et syv milliliter PTFE standard hetteglass for å oppnå biosensorlageret for bruk i eksponeringsanalysen.Før du starter forsøket, må du kontrollere den anaerobe monitoren for å sikre at det ikke er oksygen i det anaerobe kammeret. Design plateoppsettet i henhold til en 96-brønnmal. For å kjøre eksperimenter i tekniske replikeringer av tre vil dette tillate 32 forskjellige behandlinger, som best er representert med et fire og åtte rutenett for å sette opp hetteglassene.Sett opp de fire og åtte rutenettet i henhold til analyseplateoppsettet. Plasser deretter syv milliliter PTFE standard hetteglass i skuffen. Hetteglass skal kun håndteres ved å manipulere utsiden av hetteglasset.Tilsett eksponeringsvolumet i hvert hetteglass som tilsvarer hver behandling. Til hvert hetteglass legger du til det tilsvarende volumet av den kjemiske variabelen som skal testes i henhold til plateoppsettet. Legg nå nitrat til hvert hetteglass slik at konsentrasjonen er 200 mikromos.Ekskluder dette trinnet for konstituerende biosensorbehandling blanks. For å tilsette kvikksølv til hetteglassene, ta først de fire til åtte mikromosebestanden og rist godt. Fortynn oppløsningen og eksponeringsmediet i et syv milliliter PTFE hetteglass til en konsentrasjon på 100 til 250 nanomolar for å lage en fungerende kvikksølvløsning.Fra denne arbeidsløsningen, tilsett kvikksølv til de nødvendige hetteglassene i henhold til plateoppsettet. Etter å ha lagt kvikksølv eller kadmium manuelt riste platen i en orbital bevegelse. Eksperimentet kan settes på pause nå avhengig av tiden det tar for at kvikksølv eller kadmium skal ses i løsningen.Når eksperimentet gjenopptas, forsiktig pipette biosensor lager frem og tilbake for å sikre homogenitet. Tilsett deretter 100 mikroliter av biosensorlageret til hvert hetteglass og rist platen manuelt som før. Varm opp plateleseren til 37 grader Celsius og sett opp en kinetisk løp i ti timer med leser hvert to punkt fem til fem minutter.En orbital risting mellom avlesninger. Sett opp løpet for å ta fluorescensmålinger med en fluorescens eksitasjon på 440 nanometer og et utslipp på 500 nanometer. Nå pipette 200 mikroliter fra hvert PTFE hetteglass i fire og åtte gitter inn i tilsvarende brønner av 96 brønnplaten.Pipetten frem og tilbake fem ganger før du overfører hver 200 mikroliter. I stedet for å kaste pipettespissen, la pipettespissen stå i PTFE hetteglasset for å holde oversikt over rørsettfremdriften. Plasser 96-brønnplaten i skuffen på plateleseren.Plasser deretter lokket på 96-brønnplaten og start analysen. Her er representative resultater som viser korrigerte fluorescensdata som en tidsfunksjon. Fluorescens er vist med økende konsentrasjoner av kvikksølv til den induknelige biosensoren.Alle verdier er tomme for ingen kvikksølvkontroll. De fluorescerende toppene kan kvantifiseres for å vise fluorescerende signal som en funksjon av kvikksølv eller kadmiumkonsentrasjon. For både de indukne og de konstitutive biosensorene bør kvikksølv- eller kadmiumkonsentrasjonen midt i det indukne sensorer lineære området brukes til å teste variabler.Her er eksempler på et ufullstendig resultat med sink. Og et avgjørende resultat med magnesium og mangan på kvikksølvbiotilgjengelighet til biosensoren. Resultatet med sink er ufullstendig fordi den konstitutive fluorescensen forfaller med induserbar fluorescens som indikerer toksisitet.Mens du prøver denne prosedyren er det viktig å huske å gå inn i konsentrasjonene av enten kadmium eller kvikksølv som disse vil bli brukt til å kalibrere biosensor. Etter denne prosedyren kan andre metoder som termodynamisk modellering av vandige systemer utføres for å svare på flere spørsmål som hvordan spesifikke kjemiske arter av kvikksølv eller kadmium påvirker deres biotilgjengelighet. Ikke glem at arbeid med kadmium og kvikksølv og sterke syrer som svovelsyre kan være ekstremt farlig og forholdsregler som bruk av personlig verneutstyr bør alltid tas mens du utfører denne prosedyren.Etter utviklingen banet denne teknikken vei for forskere innen miljømikrobiologi for å utforske kvasi sanntid anaerob kvikksølv eller kadmium biotilgjengelighet og genetisk tractable mikrober.

Research

JoVE Journal

Environment

Evaluation of Integrated Anaerobic Digestion and Hydrothermal Carbonization for Bioenergy Production

Evaluering av Integrert Anaerob Fordøyelse og Hydrothermal Semente for bioenergiproduksjon

Lignocellulosic biomass is one of the most abundant yet underutilized renewable energy resources. Both anaerobic digestion (AD) and hydrothermal ...

Detection of Foodborne Bacterial Pathogens from Individual Filth Flies

Deteksjon av matbårne bakterier fra Individual Filth Fluer

There is unanimous consensus that insects are important vectors of foodborne pathogens. However, linking insects as vectors of the pathogen causing a ...

Development of Sulfidogenic Sludge from Marine Sediments and Trichloroethylene Reduction in an Upflow Anaerobic Sludge Blanket Reactor

Utvikling av Sulfidogenic Slam fra marine sedimenter og Trichloroethylene Reduksjon i en oppstrøms Anaerob Sludge Blanket Reactor

The importance of microbial sulfate reduction relies on the various applications that it offers in environmental biotechnology. Engineered sulfate ...

Spotting Cheetahs: Identifying Individuals by Their Footprints

Spotting Dynamo Kiev: Identifisere enkeltpersoner med sine Footprints

The cheetah (Acinonyx jubatus) is Africa's most endangered large felid and listed as Vulnerable with a declining population trend by the IUCN1. It ranges ...

Experimental Column Setup for Studying Anaerobic Biogeochemical Interactions Between Iron (Oxy)Hydroxides, Trace Elements, and Bacteria

Experimental Column Setup for Studying Anaerobic Biogeochemical Interactions Between Iron OxyHydroxides, Trace Elements, and Bacteria

Eksperimentell kolonneinnstillinger for å studere anaerob Biogeochemical vekselsvirkningene mellom jern (Oxy) Hydroxides, sporstoffer og bakterier

Fate and speciation of trace elements (TEs), such as arsenic (As) and mercury (Hg), in aquifers are closely related to physio-chemical conditions, such as ...

Fluorescent Paper Strips for the Detection of Diesel Adulteration with Smartphone Read-out

Fluorescerende papir strimler for påvisning av Diesel Adulterasjon med Smartphone lese-out

Three fluorescent molecular rotors of 4-dimethylamino-4-nitrostilbene (4-DNS) were investigated for their potential use as viscosity probes to indicate ...

A Precise and Autonomous System for the Detection of Insect Emergence Patterns

En presis og autonomt System for deteksjon av insekt fremveksten mønstre

Existing systems to measure insect emergence patterns have limitations; they are only partially automated and are limited in the maximum number of ...

Detection of Tilapia Lake Virus Using Conventional RT-PCR and SYBR Green RT-qPCR

Påvisning av Tilapia Lake Virus bruker konvensjonelle RT PCR og SYBR grønne RT-qPCR

The aim of this method is to facilitate the fast, sensitive and specific detection of Tilapia Lake Virus (TiLV) in tilapia tissues. This protocol can be ...

An Induction System for Clustered Stomata by Sugar Solution Immersion Treatment in Arabidopsis thaliana Seedlings

An Induction System for Clustered Stomata by Sugar Solution Immersion Treatment in Arabidopsis thaliana Seedlings

En induksjon System for samlet Stomata av sukker løsning nedsenking behandling i Arabidopsis thaliana planter

Stomatal movement mediates plant gas exchange, which is essential for photosynthesis and transpiration. Stomatal opening and closing are accomplished by a ...

Cultivation of Green Microalgae in Bubble Column Photobioreactors and an Assay for Neutral Lipids

Dyrking av grønne mikroalger boble kolonnen Photobioreactors og analysen for nøytral lipider

There is significant interest in the study of microalgae for engineering applications such as the production of biofuels, high value products, and for the ...