Name: an anaerobic biosensor assay for the detection of mercury and cadmium
Uploaded: 2018-12-17T13:00:00
Duration: 9 min 33 s
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Gostaríamos de agradecer comentários de dois revisores anônimos como bem membros do laboratório Poulain para discussão perspicaz sobre o desenvolvimento do biosensor anaeróbico. Um prêmio de pesquisador precoce da província de Ontário e um subsídio de descoberta e um suplemento de accelerator de ciências naturais e engenharia Conselho de pesquisa do Canadá para A.J.P. financiado este estudo.

Os autores não têm nada para divulgar.

Biosensores microbianos são ferramentas úteis para identificar os mecanismos pelos quais os metais estão interagindo com micróbios. Aqui, descrevemos um método que por via anaeróbia pode quantificar HgII e CdII biodisponibilidade para uma célula hospedeira Gram-negativas (Escherichia coli) e dar um resultado quantificável dentro de algumas horas. Um dos principais pontos positivos deste protocolo é que permite controle extenso de especiação de metal no meio de exposição, evitando ligantes de forte ligação ou componentes que podem levar à precipitação de metais. Especiação de metal foi modelada e testada neste meio de exposição usando PHREEQC17, no entanto, outros softwares de especiação de metal podem ser implantado. No caso de não ligantes adicionados, Hg especiação é esperada para estar presente como 97% Hg(OH)2 e 3% Hg (NH3)22 +, enquanto Cd especiação será apresente como 59% Cd-β-glicerofosfato, 25% Cd2 +e 16% CdSO4. Usando um software de modelagem termodinâmica simples, o usuário pode projetar meios de exposição e testar a biodisponibilidade do metal de interesse. Além disso, a célula hospedeira biosensor (NEB5α deEscherichia coli ) é viável em uma ampla faixa de pH (5-8.5) e concentração de NaCl (0-0,55 M)17.
Metilação do HG é um processo anaeróbio, e o protocolo descrito neste estudo não tem uma exigência para o oxigênio, permitindo a descrição mais exata do metabolismo anaeróbico na biodisponibilidade de metal. Isto é importante porque a presença de oxigênio altera a expressão de gene perfis48,49 e, portanto, potencial transporte vias; Portanto, esse método apresenta uma vantagem sobre existente atualmente alternativas aeróbias. A construção de biosensing apresentada aqui pode, potencialmente, ser usada com outros hosts anaeróbicos que podem ser mais relevantes para a metilação de mercúrio (por exemplo, Geobacter, Desulfovibrio), mas talvez menos tratáveis do que e. coli. Uma limitação atual da abordagem apresentada aqui é que nosso limite de detecção ainda não atingiu níveis de pM, ao contrário do existentes sistemas aeróbio4,19,37. É contudo importante notar que para alcançar esses limites de deteção baixa várias etapas precisam ser tomadas44: eu) adição de ligante é necessária para assegurar que o Hg permanece em solução e não fixar na parede da célula microbiana (Hg será limite irreversível a célula superfície tióis, impedindo sua biodisponibilidade25,,27; Veja a resposta de limiar para Hg na Figura 3A), ii) modificações à densidade celular, ou iii) modificar a construção genética para incluir proteínas de transporte do mer-operon (ou seja, merT e merP), o crescente fluxo de Hg dentro da célula de50,51. Essas modificações seria benéfico na detecção de baixas concentrações de Hg, mas não necessariamente ideal ao avaliar situações ambientalmente relevantes. Considerando que anterior biosensores cádmio existem principalmente como uma "prova de princípio", elas foram projetadas em meios complexos que não permitem o investigador avaliar o papel da especiação na biodisponibilidade41,42, 43 , 44.
O biosensor é uma ferramenta extremamente útil na determinação de mecanismos em que espécie de metal é biodisponíveis. Porque o organismo hospedeiro não é um Hg-methylator, só pode ser usado para desenvolver um modelo para como Hg pode entrar bactérias Gram-negativas e não um fundamento definitivo para como Hg-methylators adquirem Hg. Existem outros métodos para determinar a biodisponibilidade de Hg, tais como metilação, como um resultado da captação ou a utilização de um balanço de massa abordagem10,15,20,,45,46. Sendo assim, o método apresentado aqui oferece a vantagem de quase em tempo real dados de biodisponibilidade em células viáveis. Não recomendamos que este método ser usado para quantificar os níveis totais de Hg ou Cd em uma matriz ambiental. Apesar do uso proposto de biossensores para determinar concentrações de metal no ambiente36, muitos mais prontamente disponíveis métodos padrão estão disponíveis como ICP-MS, faby (para análise de Cd) ou espectroscopia de absorção atômica de vapor frio (para Hg análise). O biosensor, no entanto, pode ser usado para determinar se uma dada matriz ambiental tem o potencial para melhorar ou prejudicar a biodisponibilidade; Isto é conseguido através da realização de adições padrão.
O pH da mídia exposição pode ser alterado para em qualquer lugar dentro do intervalo de 5 e 8,5, desde o ácido livre de MOPS (tampão) é trocado com um ácido livre alternativo de um buffer com a pKa apropriado (consulte a lista de buffers adequados (Ferreira et al (2015) 47) e ajustada com KOH ao pH adequado ao fazer a mídia de exposição. Além disso, o método não está limitado a Hg e Cd, mas poderia ser estendido a outros metais usando outros reguladores de transcrição.
O ensaio de exposição pode ser modificado para explorar a influência de outros aceitadores de electrões como O2 e fumarato na biodisponibilidade de Hg ou Cd. Pequenas modificações para o método a utilizar tanto O2 e fumarato como aceitadores de electrões estão disponíveis mediante pedido.
Em resumo, gostaríamos de salientar os seguintes pontos: eu) é imperativo que as concentrações de Cd ou Hg estoques são conhecidas na etapa 2, como estes serão usados para calibrar o biosensor. II) no dia da exposição, o crescimento das células deve ser interrompido a uma OD600 de 0.6 (± 0.1) e que é tomado quando resuspending as culturas de células, como o biosensor é calibrado para essa densidade celular. III) por último, é importante que o meio de exposição feito meticulosamente no dia da exposição. Para garantir o sucesso do protocolo, múltiplas culturas devem ser cultivadas simultaneamente (para contornar a possibilidade de falha de crescimento) e o meio de crescimento deve ser refeito semanalmente (para contornar a metaestabilidade da mídia e da possível contaminação). Também deve ser notado que réplicas biológicas (várias culturas de células) expressam a variabilidade quando se trata de produção de sinal. Embora as respostas fluorescentes podem variar de cultura para cultura, as tendências fluorescentes em resposta a uma determinada variável devem permanecer inalterado ao longo de numerosas réplicas biológicas.

Mercúrio (Hg) é um poluente global e sua biodisponibilidade para Hg misturar os micróbios é o primeiro passo para sua bioamplificação através de teias alimentares e seus possíveis efeitos neurotóxicos em humanos e animais selvagens1. Acredita-se atualmente que microbiana metilação do Hg é um processo intracelular que requer: i) a espécie de Hg a ser biodisponível2,3,4,5,6,7 e ii) para a célula fisiologicamente capaz de misturar Hg8,9,10. Bioaccumulates de cádmio (Cd) em organismos, mas é que não biomagnifies em foodwebs e é amplamente utilizado em processos industriais e comerciais que comumente causam a exposições agudas em pessoas e o meio ambiente11. Apesar de micróbios desempenham vários papéis-chave no destino do Hg no ambiente, a maioria dos estudos sobre Cd geoquímica e Ecotoxicologia focar eucariontes microbiana12. Consumo de culturas agrícolas (por exemplo, arroz) é a principal fonte de exposição direta ao cádmio; Neste caso, a biodisponibilidade de Cd para os micróbios da rizosfera influencia directamente a quantidade plantas podem acumular13.
Vias de transporte de HG são complexas e envolvem possivelmente um transporte ativo passo14. Quando se trata de um transportador, trabalho recente sugeriu que HgII usa um ZnII ou MnII transporte7,15,16,17. Considerando que o CdII é a hipótese de ser acidentalmente transportado para o citosol através de vias de transporte de metais divalentes (particularmente MnII ou ZnII), mecanismos de CdII transportam dentro das células permanecem via de transporte especulativo e não específicas do Cd tem sido identificados13,18. Independentemente da natureza dos transportadores envolvidos, três fatores mecanicistas, finalmente, determinam a capacidade dos metais de inserir uma célula: i) a metal especiação em solução2,6,15, 16 , 17 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23, ii) as propriedades de biophysiochemical do membrana celular17,24,25,26,,27,28,29 ,30,31e iii) a capacidade do metal acessar um site de transporte7,32. CD e Hg são improvável que existe como íons livres sob condições fisiologicamente relevantes microbianas, devido a sua alta afinidade para dissolvido orgânico matéria (DOM), quelantes de contaminantes (por exemplo, EDTA), ou reduzidos de enxofre metades33, 34,35 (CdII pode existir como uma enciclopédia íon ou formulário íon-pares na ausência destes ligantes). Há uma falta de métodos eficientes para determinar como estas espécies de metal são biodisponível em condições relevantes ao seu destino no ambiente. Por exemplo, Hg é misturado sob condições anaeróbicas14, e ambos cádmio e Hg são metais macios (ou cações de classe B), exigindo que a especiação ser investigadas condições de manter a integridade dos grupos reduzidos de enxofre.
Biosensores microbianos são células bacterianas que emitem um sinal quantificável em resposta às concentrações intracelulares de um metal, neste caso Hg ou Cd. Como tal, eles são ferramentas ideais para entender como metais inserir uma célula36, desde que as condições de exposição são cuidadosamente controladas para. Biosensores HG normalmente contêm fusões de gene entre os circuitos regulamentares do mer-operon (incluindo genes que codificam para o regulador de transcrição MerRas bem como o operador e o promotor regiões do operon) e relatórios de genes (por exemplo, Lux, gfp, ALC genes). Quando o mercúrio está presente no citoplasma, ele vinculará a MerR, resultando na transcrição dos genes relatórios e sinal subsequente produção19,37. Biosensores específicos do Cd normalmente são projetados usando o cadC, cadastro, zntA ou zntR codificado de reguladores de transcrição38, mas é interessante notar que MerR tem uma afinidade mais baixa, no entanto, quantificável para Cd5. Devido à restrição aeróbia da maioria comumente usado proteínas repórter luminescentes ou fluorescentes, até recentemente microbianas biosensores permaneceram incapazes de oferecer insights sobre a biotransformação de metais sob condições anóxica. Isto dificulta anaeróbica deteção da biodisponibilidade de metais sob uma variedade de condições relevantes para o seu destino ambiental, especificamente na presença de redox ligantes sensíveis (por exemplo, sulfeto e tióis)4, 5 , 39.
Para aliviar o obstáculo metodológico de viver da imagem latente na ausência de oxigênio, Drepper et al (2007) têm desenvolvido uma proteína fluorescente flavin-baseado (FbFp), baseado no domínio de tensão de oxigênio luz de SB2 proteína de p. putida. Esta família de proteína é capaz de fluorescência na ausência de oxigênio de40. Com base no trabalho de Drepper et al, nosso laboratório projetado um biosensor anaeróbica, permitindo o estudo da biodisponibilidade de Hg sob condições oxic e anóxica e sobre uma ampla gama de salinidade 17. O papel atual, descrevemos como preparar e usar o biosensor para testar a influência de variáveis ambientais na biodisponibilidade de Hg ou Cd. Embora nós desenvolvemos o biosensor para HgII, escolhemos a realizar experimentos com CdII como um meio de chamar a atenção do leitor para o fato de que os biosensores também podem responder a múltiplos estressores que provavelmente co-ocorrem em ambiental matrizes; Neste caso o CdII foi investigada porque é conhecido para ligar o regulador transcricional MerR5. Aqui, nós mostramos calibração representativa e funcional linear varia em relação a qualquer metal. Também damos um exemplo quando resultados do biosensor é conclusivos (MgII e MnII na biodisponibilidade de Hg) e inconclusivo (ZnII na biodisponibilidade de Hg).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>7 ml standard vial, rounded interior</td>
			<td>Delta Scientific</td>
			<td>200-007-20</td>
			<td>34 recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vial tray, 21 mm openings</td>
			<td>Delta Scientific</td>
			<td>730-2001</td>
			<td>4 for (4 x 8 grid)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 mm Closure</td>
			<td>Delta Scientific</td>
			<td>600-024-01</td>
			<td>32 recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LID CORNER NOTCH BLK STR CS/50</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Corning 3931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 96- well clear-bottom nonbinding surface microplate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Corning 3651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anaerobic Chamber (glovebox)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>The air in the anaerobic chamber should be (97 % N2 &#177; 2 % and 3 % H2 &#177; 2 %)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Palladium catalyst</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Converts O2 to H2O in the anaerobic chamber. Not required but recommended.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>450 (&#177;10) nM filter for the microplate reader</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 (&#177;10) nM filter for the microplate reader</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anaerobic culture vial (balch tubes) + rubber stoppers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Modified for anaerobic culture tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MA-3000 (mercury analyzer)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH probe</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any pH probe will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical sterile polypropylene centrifuge tubes.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m polyethersulfone syringe filter + syringe</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile/clean glass bottles</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For growth media and standards</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile/clean plastic or PTFE bottles</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For alkali solutions (NaOH/KOH)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents powders: Na2MoO4, Na2SeO4, H3BO3, NaOH, KOH, MnSO4, ZnSO4, CoCl2, NiCl2, ampicillin sodium salt, Difco M9 Minimal Salts, Glucose, MgSO4, Thiamine HCl, NaNO3, l-leucine, l-isoleucine valine, EDTA sodium salt, FeSO4, Sodium Beta-Gylcerophosphate, Mops free acid, (NH4)2SO4, Hg(NO3)2, CdCl2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Milli-Q water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Autoclaved or filter sterilized is fine.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysogeny Broth</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical grade H2SO4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an anaerobic biosensor assay for the detection of mercury and cadmium

Biodisponibilidade de mercúrio (Hg) para micróbios é um passo fundamental para tóxico bioamplificação Hg em teias alimentares. Transformações de cádmio (Cd) e biodisponibilidade para bactérias controlaram a quantidade que se acumulam em culturas de alimentos básicos. A biodisponibilidade destes metais é dependente de sua especiação em solução, mas mais particularmente sob condições anóxica onde Hg é misturado ao tóxico monomethylmercury (MeHg) e Cd persiste na rizosfera. Célula inteira microbianas biosensores dar um sinal quantificável quando um metal entra no citosol e, portanto, é ferramentas úteis para avaliar a biodisponibilidade de metal. Infelizmente, a maioria dos esforços de biosensing até agora tem sido restrita a ambientes oxic devido à capacidade limitada das proteínas existentes de repórter para função na ausência de oxigênio. Neste estudo, apresentamos o nosso esforço para desenvolver e otimizar um ensaio de células inteiras biosensor capaz de funcionar anaerobicamente que pode detectar metais sob condição anóxica em tempo quase real e dentro de horas. Descrevemos como o biosensor pode ajudar a avaliar como químicas variáveis relevantes para o ciclismo ambiental de metais afetam sua biodisponibilidade. O seguinte protocolo inclui métodos para (1) preparar Hg e Cd normas sob condições anóxica, (2) Preparem o biosensor na ausência de oxigênio, (3) o projeto e executar um experimento para determinar como uma série de variável afeta a biodisponibilidade de Hg ou Cd e (4) para quantificar e interpretar dados de biosensor. Podemos mostrar as escalas lineares das biosensores e fornecem exemplos mostrando a capacidade do método para distinguir entre metal biodisponibilidade e toxicidade, utilizando cepas de metal-inducible e constitutivas.

Uma vez que os picos de fluorescência estar quantificados conforme item 5.3, o resultado dos picos de fluorescência pode ser graficamente de acordo com a concentração variável ilustrando como essa variável afeta a biodisponibilidade relativa de Hg ou Cd. Por exemplo, a curva de calibração da fluorescência sobre [HgII] da Figura 2 irá produzir os inducible dados apresentados na Figura 3A. Para HgII calibração, a vontade de curva sempre conter 3 componentes para a tensão induzida em Hg; uma resposta de limiar de aproximadamente 1-2 nM HgII antes da produção do sinal de fluorescência é linearmente proporcional à [HgII], o intervalo linear onde 5 nM HgII será confiável sempre no centro do intervalo e um platô onde aumentar [HgII] já não aumentará o sinal de fluorescência. Nenhuma alteração na produção do sinal sobre a tensão constitutiva mostra que a toxicidade de [HgII] não afeta a produção de sinal. Para CdII na Figura 3B, sempre existem 2 componentes para a estirpe inducible; uma escala linear, onde 200-300 nM CdII será confiável sempre no centro da faixa linear e um platô. Uma diminuição no sinal de fluorescência com o aumento da [CdII] mostra que altas concentrações de Cd são tóxicas para as células e podem explicar uma diminuição da produção de fluorescência inducible após o planalto a 1000 nM CdII. Portanto, quando o teste de biodisponibilidade Hg ou Cd em relação a uma variável de ambiente, sugerimos usar 5 nM para HgII e 300 nM para CdII.
Em alguns casos, produção de sinal pode ser corretamente atribuída a biodisponibilidade de Hg ou Cd, mas em outros casos, produção de sinal pode ser afetada pela variação no estado fisiológico do hospedeiro biosensor célula (por exemplo, o metal de interesse ou condições ambientais testadas são tóxicas). Na Figura 4A, biodisponibilidade de Hg 5 nM foi testado ao longo de um gradiente de Zn (0-10 µM). Em Hg-inducible e tensões constitutivas, há uma diminuição semelhante no sinal com o aumento da concentração de Zn. Portanto, um não pode discriminar se o sinal resulta da baixa biodisponibilidade ou é um resultado de toxicidade de Zn. Na Figura 4B e 4C, biodisponibilidade de Hg 5nM foi testada ao longo de um gradiente de MgII (0-10 mM) e MnII (0-10 µM). Aumento MgII e MnII concentrações diminuíram o sinal de fluorescência da estirpe inducible. Por outro lado, a tensão constitutiva não mostrou uma diminuição na fluorescência com o aumento da MgII e MnII concentrações (MgII e MnII são benéficos para as células na produção da FbFp, como demonstrado pelo um aumento no sinal de fluorescência). Isto demonstra que as células são viáveis e a diminuição de fluorescência da estirpe Hg-inducible resulta de uma diminuição da biodisponibilidade de Hg. Esses dados enfatiza como é importante para todos os ensaios de biosensor para também fornecer medidas constitutivas da aptidão total do celular.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58324/58324fig3.jpg"> Figura 3: escalas lineares do biosensor com mercúrio e cádmio. Fluorescência máxima medida relativa fluorescência unidades (RFU) ± 1 desvio padrão emitido por Escherichia coli NEB5α abrigando o pUC57merR-Pp (Hg-Inducible) e pUC19Balch-Pp (Constitutive) com a adição de A) HgII (0-15 nM) e B) CdII (0-1.000 nM) em condições anaeróbias. Fluorescência foi que a média de 3 técnicos Replica em 37 ˚ c. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58324/58324fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58324/58324fig4.jpg"> Figura 4: exemplo de um resultado inconclusivo com zinco e um resultado conclusivo com magnésio e manganês. Fluorescência máxima medida relativa fluorescência unidades (RFU) ± 1 desvio padrão emitido por Escherichia coli NEB5α abrigando o pUC57merR-Pp (Hg-Inducible) e pUC19Balch-Pp (Constitutive) com a adição de A) ZnII (0-10 µM), B) MgII (0-10 mM), e C) MnII (0-10 µM) em condições anaeróbias. [HgII] foi definida como 5 nM para todos os tratamentos e fluorescência foi a média de 3 repetições de técnicas em 37 ˚ c. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58324/58324fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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An Anaerobic Biosensor Assay for the Detection of Mercury and Cadmium

Aqui, apresentamos um protocolo para usar um biosensor microbiana anaeróbia de células inteiras para avaliar como diferentes variáveis ambientais afetam a biodisponibilidade de Hg e Cd de bactérias em ambientes anóxica.

Um ensaio de anaeróbios Biosensor para a detecção de mercúrio e cádmio

Mercury (Hg) bioavailability to microbes is a key step to toxic Hg biomagnification in food webs. Cadmium (Cd) transformations and bioavailability to ...

Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave sobre o ciclismo biogeoquímico de cádmio e mercúrio, como como diferentes variáveis ambientais afetam sua biodisponibilidade às bactérias. A principal vantagem dessa técnica é que ela oferece dados de biodisponibilidade em tempo real e células viáveis, independentemente da presença de oxigênio. Geralmente, indivíduos novos neste método lutarão porque há muitas etapas sensíveis ao tempo que requerem uma atenção muito meticulosa aos detalhes.Demonstrando o procedimento será Ben, um estudante de pós-graduação do meu laboratório. Para se preparar para o ensaio, recupere o biosensível indutível de mercúrio e o biosensível expresso constitutivamente a partir de um estoque crio de menos 80 graus Celsius. Coloque as células nas placas de caldo de Lysogeny contendo 120 microgramas por mililitro de ampicilina.Cresça as culturas das placas em uma incubadora a 37 graus Celsius durante a noite. Entre 16:30 e 17:00.m. inocular uma cultura em dez mililitros de LB com ampicillina e crescer durante a noite a 37 graus Celsius com tremor a 220 rpm.Entre nove e dez a.m. na manhã seguinte trazem a cultura, bem como o meio de crescimento previamente preparado para a câmara anaeróbica. Em seguida, adicione oito mililitros de médio de crescimento fresco e 210 microgramas por mililitro de ampicillina em um tubo de balch estéril.Agora colete dois mililitros da cultura cultivada durante a noite e transfira para um tubo de micro centrífuga de dois mililitros. Depois de centrifugar a 10.000 RCF por 90 segundos, remova o supernasce e resuspend em dois mililitros de meio de crescimento fresco. Em seguida, adicione a cultura resuspended ao tubo de varanda contendo oito mililitros de médio de crescimento fresco e ampicillina.Usando técnica estéril, coloque cuidadosamente uma rolha de borracha no tubo de balch antes de removê-la da câmara anaeróbica. Em seguida, coloque o tubo em uma incubadora e cresça anaerobicamente a 37 graus Celsius com agitação a 220 rpm. Entre três e cinco p.m.trazer o tubo de balch com a cultura, um novo tubo de balch estéril, e o meio de crescimento para a câmara anaeróbica. Adicione 100 microliters da cultura a 10 mililitros de meio de crescimento fresco com ampicillina no tubo de balch estéril. Usando técnica estéril, coloque cuidadosamente uma rolha de borracha no tubo de balch.Remova o tubo da câmara anaeróbica antes de aurá-lo durante a noite a 37 graus Celsius com agitação a 220 rpm. Entre nove e dez a.m. no dia seguinte, transfira a cultura e o meio de crescimento de volta para a câmara anaeróbica.Adicione novamente oito mililitros de meio de crescimento e ampicillina em um tubo de balch estéril. Transfira dois mililitros da cultura cultivada durante a noite em um tubo de micro centrífugas de dois mililitros. Após a centrifugação como antes, remova o sobrenaspeente e resuspense as células em dois mililitros de meio de crescimento fresco.Em seguida, adicione a cultura resuspended ao tubo de balch contendo o meio de crescimento fresco e ampicillina. Usando técnica estéril, coloque cuidadosamente uma rolha de borracha no tubo de balch. Remova-o da câmara e cresça anaerobicamente a 37 graus Celsius com agitação a 220 rpm.Monitore o crescimento da cultura usando um espectrofotômetro vórtice ao vórtice da cultura e, em seguida, medindo a densidade óptica em 600 nanômetros ou OD600. Após três a quatro horas de crescimento esperado, a cultura deve atingir um OD600 de 6. Agora traga o tubo na câmara anaeróbica e transfira a cultura para dois tubos de micro centrífugas mililitros.Seguindo a centrifugação como antes remover o supernasce e resuspendar cada paladar celular em dois mililitros de meio de exposição fresco. Repita esta etapa de lavagem uma vez para remover qualquer traço do meio de crescimento. Agora combine ambos os tubos de micro centrífuga da cultura celular em um frasco padrão PTFE de sete mililitros para obter o estoque biosensor para uso no ensaio de exposição.Antes de iniciar o experimento verifique o monitor anaeróbico para garantir que não há oxigênio na câmara anaeróbica. Projete o layout da placa de acordo com um modelo de poço 96. Para executar experimentos em réplicas técnicas de três isso permitirá 32 tratamentos diferentes, que é melhor representado com uma grade de quatro por oito para configurar os frascos.Configure a grade quatro por oito de acordo com o layout da placa de ensaio. Em seguida, coloque sete frascos padrão PTFE mililitros na bandeja. Frascos só devem ser manuseados manipulando o exterior do frasco.Adicione o volume médio de exposição em cada frasco correspondente a cada tratamento. A cada frasco adicione o volume correspondente da variável química a ser testada de acordo com o layout da placa. Agora adicione nitrato a cada frasco para que a concentração seja de 200 micromolar.Exclua esta etapa para o tratamento biosensível constitutivo em branco. Para adicionar mercúrio aos frascos, primeiro pegue o estoque de quatro a oito micromolares e agite bem. Diluir o meio de solução e exposição em um frasco ptfe de sete mililitros para uma concentração de 100 a 250 nanomolar para fazer uma solução de mercúrio funcionando.A partir desta solução de trabalho, adicione mercúrio aos frascos necessários de acordo com o layout da placa. Depois de adicionar o mercúrio ou cádmio agitar manualmente a placa em um movimento orbital. O experimento pode ser pausado agora, dependendo do tempo necessário para mercúrio ou cádmio para especiar em solução.Quando o experimento é retomado, gentilmente pipeta biosensor estoque para trás e para frente para garantir a homogeneidade. Em seguida, adicione 100 microliters do estoque biosensor a cada frasco e agite manualmente a placa como antes. Aqueça o leitor de placas a 37 graus Celsius e configure uma corrida cinética por dez horas com leituras a cada dois pontos de cinco a cinco minutos.Um orbital tremendo entre as leituras. Configure a corrida para tomar medidas de fluorescência com uma excitação de fluorescência de 440 nanômetros e uma emissão de 500 nanômetros. Agora pipeta 200 microliters de cada frasco PTFE na grade quatro por oito para os poços correspondentes da placa de poço 96.Pipeta para frente e para trás cinco vezes antes de transferir cada 200 microliters. Em vez de descartar a ponta da pipeta, deixe a ponta da pipeta no frasco ptfe para acompanhar o progresso da tubulação. Coloque a placa 96 bem na bandeja do leitor de placas.Em seguida, coloque a tampa na placa 96 e comece o ensaio. Aqui estão os resultados representativos mostrando dados corrigidos de fluorescência em função do tempo. A fluorescência é mostrada com concentrações crescentes de mercúrio para o biosensor indutível.Todos os valores estão em branco para o controle de mercúrio. Os picos fluorescentes podem ser quantificados para mostrar o sinal fluorescente em função da concentração de mercúrio ou cádmio. Tanto para os biosensores indutíveis quanto para os biosensores constitutivos, deve-se utilizar a concentração de mercúrio ou cádmio no meio da faixa linear dos sensores indutíveis.Aqui estão exemplos de um resultado inconclusivo com zinco. E um resultado conclusivo com magnésio e manganês sobre biodisponibilidade de mercúrio para o biosensor. O resultado com zinco é inconclusivo porque a fluorescência constitutiva decai com fluorescência indutível indicando toxicidade.Ao tentar este procedimento é importante lembrar-se de entrar nas concentrações de cádmio ou mercúrio, pois estes serão usados para calibrar o biosensor. Após este procedimento, outros métodos como a modelagem termodinâmica de sistemas aquosos podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como como espécies químicas específicas de mercúrio ou cádmio afetam sua biodisponibilidade. Não se esqueça que trabalhar com cádmio e mercúrio e ácidos fortes, como ácido sulfúrico, pode ser extremamente perigoso e precauções como o uso de equipamentos de proteção individual devem ser sempre tomadas durante a realização deste procedimento.Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores da área de microbiologia ambiental explorarem mercúrio anaeróbico quase em tempo real ou biodisponibilidade de cádmio e micróbios geneticamente tratáveis.

Research

JoVE Journal

Environment

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The cheetah (Acinonyx jubatus) is Africa's most endangered large felid and listed as Vulnerable with a declining population trend by the IUCN1. It ranges ...

Experimental Column Setup for Studying Anaerobic Biogeochemical Interactions Between Iron (Oxy)Hydroxides, Trace Elements, and Bacteria

Experimental Column Setup for Studying Anaerobic Biogeochemical Interactions Between Iron OxyHydroxides, Trace Elements, and Bacteria

Instalação de coluna experimental para estudar anaeróbicas biogeoquímicas interações entre bactérias, oligoelementos e hidróxidos de ferro (oxi)

Fate and speciation of trace elements (TEs), such as arsenic (As) and mercury (Hg), in aquifers are closely related to physio-chemical conditions, such as ...

Fluorescent Paper Strips for the Detection of Diesel Adulteration with Smartphone Read-out

Tiras de papel fluorescente para a detecção da adulteração de Diesel com leitura de Smartphone

Three fluorescent molecular rotors of 4-dimethylamino-4-nitrostilbene (4-DNS) were investigated for their potential use as viscosity probes to indicate ...

A Precise and Autonomous System for the Detection of Insect Emergence Patterns

Um sistema autónomo e preciso para a detecção de padrões de emergência de insetos

Existing systems to measure insect emergence patterns have limitations; they are only partially automated and are limited in the maximum number of ...

Detection of Tilapia Lake Virus Using Conventional RT-PCR and SYBR Green RT-qPCR

Deteção de tilápia Lago vírus usando convencional RT-PCR e SYBR Green RT-qPCR

The aim of this method is to facilitate the fast, sensitive and specific detection of Tilapia Lake Virus (TiLV) in tilapia tissues. This protocol can be ...

An Induction System for Clustered Stomata by Sugar Solution Immersion Treatment in Arabidopsis thaliana Seedlings

An Induction System for Clustered Stomata by Sugar Solution Immersion Treatment in Arabidopsis thaliana Seedlings

Um sistema de indução de estomas agrupado por tratamento de imersão de solução de açúcar em plântulas de Arabidopsis thaliana

Stomatal movement mediates plant gas exchange, which is essential for photosynthesis and transpiration. Stomatal opening and closing are accomplished by a ...

Cultivation of Green Microalgae in Bubble Column Photobioreactors and an Assay for Neutral Lipids

Cultivo de microalgas verdes em fotobiorreatores coluna de bolha e um ensaio para lípidos neutros

There is significant interest in the study of microalgae for engineering applications such as the production of biofuels, high value products, and for the ...