Name: an anaerobic biosensor assay for the detection of mercury and cadmium
Uploaded: 2018-12-17T13:00:00
Duration: 9 min 33 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Anaerobic Biosensor Assay for the Detection of Mercury and Cadmium at JoVE.com

Мы хотели бы поблагодарить комментарии рецензентов два анонимных как хорошо членов Пулен лаборатории для глубокие обсуждения на развитие анаэробных биодатчик. Раннего исследователь награду от провинции Онтарио и обнаружения Грант и ускоритель дополнение от естественных наук и инженерных исследований Совет Канады к A.J.P. Финансирование этого исследования.

Авторы не имеют ничего сообщать.

Микробные биодатчики являются полезными инструментами для выявления механизмов, которыми металлы взаимодействуют с микробами. Здесь мы описываем метод, который может анаэробно количественно HgII и CdII биодоступность грамотрицательные клетки (E. coli) и дают поддающихся количественной оценке результатов в течение нескольких часов. Одна из основных сильных сторон этого протокола является, что она позволяет обширный контроль металла видообразования в средстве воздействия, избегая прочное связывание лигандов или компонентов, которые могут привести к металлической осадков. Металлический видообразования образцу и тестирование в этой среде воздействия, с помощью PHREEQC17, однако другие металлические видообразования программного обеспечения могут быть развернуты. В случае не добавлен лигандов, Hg, видообразования, как ожидается, будет присутствовать как 97% Hg(OH)2 и 3% Hg (NH3)22 +, хотя видообразования Cd будет представлять как 59% Cd-β-метронидазол, 25% Cd2 +и 16% CdSO4. С помощью простой термодинамического моделирования программного обеспечения, пользователь может дизайн экспозиции СМИ и тест на биодоступность металла интерес. Кроме того, клетки-хозяина биосенсора (E. coli NEB5α) является жизнеспособным в широком диапазоне рН (5-8,5) и концентрации NaCl (0-0,55 М)17.
Hg метилирования — анаэробный процесс, и протокола, изложенные в настоящем исследовании не имеют требование для кислорода, что позволяет более точное описание анаэробного метаболизма на металлических биодоступность. Это важно, потому что наличие кислорода изменяет ген выражение профили48,49 , и следовательно, потенциал транспортных путей; Поэтому этот метод предоставляет преимущество над настоящее время чертежей аэробных альтернатив. Biosensing конструкции, представленные здесь, потенциально могут быть использованы с другими анаэробных узлами, которые могут быть более актуальными для метилирования ртути (например, Geobacter, Desulfovibrio), но может быть меньше шансов справиться с возникающими чем E. coli. Текущее ограничение представленный здесь подход состоит, что наш предел обнаружения еще не достигли уровней ТЧ, вопреки существующим аэробные системы4,19,-37. Это, однако, важно отметить, что для достижения этих низкие пределы обнаружения несколько шагов необходимо принять44: я) лигандом дополнение необходима для обеспечения что Hg остается в растворе и не адсорбируются микробной клеточной стенки (Hg будет необратимым граница в ячейку поверхности тиолов, предотвращая его биодоступность25,27; Просмотреть ответ порог для Hg на рисунке 3A), ii) модификации плотность клеток, или iii) изменить генетическую конструкцию включить транспортные белки mer-Оперон (а именно, МЭРТ и merP), увеличение потока Hg внутри ячейки50,51. Эти изменения будет полезным в обнаружении низких концентрациях Hg, но не обязательно является идеальным при оценке экологически соответствующих ситуаций. В то время как предыдущие кадмия биодатчики прежде всего существуют как «доказательство принципа», они были разработаны в сложных средах, которые не позволяют следователю для оценки роли видообразование на биодоступность41,42, 43 , 44.
Биодатчик является невероятно полезным инструментом в определении механизмов, в которых металл видов являются биодоступными. Потому что организм хозяина не Hg-methylator, он может использоваться только для разработки модели как Hg могут ввести грамотрицательных бактерий и не окончательное обоснование как Hg-methylators приобрести Hg. Существуют другие методы для определения Hg биодоступность, например метилирования дна, как результат поглощения или использование45,20,10,15,46с баланса массы подход. Это, как говорится, представленные здесь метод предлагает преимущество данных биодоступность квази реального времени в жизнеспособных клеток. Не рекомендуется использовать этот метод для количественного определения всего Hg или Cd уровней в экологических матрица. Несмотря на предлагаемое применение биодатчиков для определения концентрации металлов в окружающей среде36многие более легко доступны стандартные методы доступны такие как ICP-MS, ФААС (для анализа Cd) или атомной абсорбционной спектроскопии холодного пара (для Hg анализ). Биосенсор, однако, может быть использован для определения, если дана экологических матрица имеет потенциал для повышения или препятствовать биодоступность; Это достигается путем выполнения стандартных дополнений.
PH воздействия средств массовой информации могут быть изменены в любом месте в диапазоне 5 и 8.5, условии MOPS свободной кислоты (буфер) осуществляется обмен с альтернативной свободной кислоты буфера с соответствующим pKa (см. список соответствующих буферов (Феррейра и др. (2015) 47) и скорректирована с Кох соответствующие pH при принятии воздействия средств массовой информации. Кроме того метод не ограничивается Hg и Cd, но может быть распространено на другие металлы, используя другие регуляторы транскрипции.
Анализа воздействия могут быть изменены для изучения влияния других акцепторами электронов как O2 и фумарата на биодоступность Hg или Cd. Незначительные изменения в метод использовать O2 и фумарата качестве акцепторов электронов предоставляются по запросу.
В заключение мы хотели бы подчеркнуть следующие моменты: я) важно, что концентрации Cd и Hg запасов известны на шаге 2, как они будут использоваться для калибровки биодатчик. II) на экспозиции день, рост клеток, должны быть прекращены на од600 0,6 (± 0,1) и что осторожность при resuspending клеточных культур, как биосенсор откалиброван для этого плотность клеток. III) и наконец, важно, что средство воздействия производится тщательно в экспозиции день. Для обеспечения успеха протокола, несколько культур следует выращивать одновременно (чтобы обойти возможность роста неудачи) и среднего роста должны быть переделана еженедельно (обойти metastability СМИ и возможного загрязнения). Следует также отметить, что биологические реплицирует (несколько клеточных культур) Экспресс изменчивости, когда дело доходит до сигнала производства. Хотя флуоресцентные ответы могут варьироваться от культуры к культуре, флуоресцентный тенденции в ответ на данную переменную должен оставаться одинаковым на всей многочисленные биологические реплицирует.

Ртуть (Hg) является глобальным загрязнителем и его биодоступность для Hg метилирующих микробы является первым шагом на пути к его биоусиления в пищевых цепях и его возможные нейротоксические эффекты в человека и дикой природы1. В настоящее время считается, что микробные метилирования Hg является внутриклеточным процесс, который требует: i видов РТ биодоступной2,3,4,5,6,7 и ii) для клетки способны физиологически метилирующих Hg8,9,10. Кадмий (Cd) биоаккумулируется в организмы, но не не биоусиления в foodwebs и широко используется в промышленных и коммерческих процессов, которые обычно вызывают острого облучения людей и окружающей среды11. Хотя микробы играют несколько ключевую роль в судьбе Hg в окружающей среде, большинство исследований на Cd геохимии и экотоксикологии сосредоточиться на микробные эукариот12. Потребление сельскохозяйственных культур (например, рис) является основным источником прямого воздействия кадмия; в этом случае, биодоступность Cd микробов ризосфере непосредственно влияет на объем растений могут накапливаться13.
Путей переноса Hg, являются сложными и возможно привлечь активного транспорта по шаг14. Когда перевозчик участвует, последние работы предложил, что HgII использует ZnII или MnII транспортер7,,1516,17. В то время как CdII предположил случайно транспортируется в цитозоль путями двухвалентной металла транспорта (особенно MnII или ZnII), механизмы CdII транспорт внутри клетки остаются спекулятивные и нет Cd специфические транспортные пути были определены13,18. Независимо от характера участвующих перевозчиков, три механистический факторы в конечном счете определяют способность металлов ввести ячейку: i металла видообразования в решение2,6,15, 16 , 17 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23, ii) biophysiochemical свойства клеточной мембраны17,24,25,26,27,28,29 ,30,31и iii) способность для металла для доступа к транспортного узла7,32. CD и Hg вряд ли существует как свободные ионы микробной физиологически соответствующих условиях из-за их высокое сродство для растворенного органического вещества (DOM), хелатирующие загрязнители (например, ЭДТА), или снижение серы постановление33, 34,35 (CdII может существовать как свободный Ион или формы Ион пар в отсутствие этих лигандами). Существует нехватка эффективных методов в определении, как эти виды металла являются биодоступными в условиях, имеющих отношение к их судьба в окружающей среде. Например Hg метилированию в анаэробных условиях14, и кадмия и Hg мягких металлов (или класса B катионы), требующих расследование их видообразования в условиях, обеспечивающих целостность уменьшение серы групп.
Микробные биодатчики являются бактериальные клетки, которые количественно сигнал в ответ на внутриклеточной концентрации металла, в данном случае Hg или компакт-диск. Как таковые они являются идеальными инструментами, чтобы понять, как металлов ввести ячейку36, при том условии, что условия воздействия тщательно контролируются. Hg биодатчики обычно содержат ген слияния между нормативной схемой mer-Оперон (включая гены, кодирующие для транскрипции регулятор MerRas также оператор и промоутер регионах Оперон) и отчетности генов (например, Люкс, gfp, лак генов). Когда ртуть присутствует в цитоплазме, он выполняет привязку к MerR, что приводит к транскрипции генов отчетности и последующих сигнал производства19,37. Конкретные Cd биодатчики обычно разработаны с использованием cadC, выходит, zntA или zntR в кодировке транскрипции регуляторы38, но стоит отметить, что MerR имеет меньше, но количественно сродство к Cd5. За счет аэробного ограничение наиболее часто используемые репортер люминесцентные и флуоресцентные белки, до тех пор, пока недавно микробной биодатчиков по-прежнему не в состоянии предложить взглянуть на биотрансформацию металлов в анаэробных условиях. Это затрудняет анаэробных обнаружения металлов биодоступность в диапазоне условий соответствующих экологических судьбы, специально в присутствии редокс чувствительных лигандами (например, сероводорода и тиолы)4, 5 , 39.
Чтобы облегчить методологических препятствие живут изображений в отсутствие кислорода, Drepper и др. (2007) разработали на основе Флавин флуоресцентный белок (FbFp), основанная на домене напряжения легких кислорода SB2 белка из P. putida. Этот белок семья способна флуоресцировать в отсутствие кислорода40. Опираясь на работу Drepper et al., нашей лаборатории разработан анаэробных биосенсор, позволяя для изучения Hg биодоступность при аэробных и анаэробных условиях и в широком диапазоне солености 17. В текущем документе мы опишем, как подготовить и использовать биосенсора для тестирования переменные среды влияние на биодоступность Hg или Cd. Хотя мы разработали биосенсора для HgII, мы решили проводить эксперименты с CdII как средство привлечь внимание читателя на тот факт, что биодатчики также могут реагировать на несколько раздражители, которые совместно встречаются в окружающей матрицы; в этом случае CdII было расследовано, потому что он известен для привязки к transcriptional регулятор MerR5. Здесь мы покажем, представитель калибровки и функциональных линейных диапазоны в отношении любой металл. Мы также дать пример, когда биосенсор результаты являются окончательными (мгII и MnII на биодоступность Hg) и безрезультатно (ZnII на биодоступность Hg).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>7 ml standard vial, rounded interior</td>
			<td>Delta Scientific</td>
			<td>200-007-20</td>
			<td>34 recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vial tray, 21 mm openings</td>
			<td>Delta Scientific</td>
			<td>730-2001</td>
			<td>4 for (4 x 8 grid)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 mm Closure</td>
			<td>Delta Scientific</td>
			<td>600-024-01</td>
			<td>32 recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LID CORNER NOTCH BLK STR CS/50</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Corning 3931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 96- well clear-bottom nonbinding surface microplate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Corning 3651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anaerobic Chamber (glovebox)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>The air in the anaerobic chamber should be (97 % N2 &#177; 2 % and 3 % H2 &#177; 2 %)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Palladium catalyst</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Converts O2 to H2O in the anaerobic chamber. Not required but recommended.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>450 (&#177;10) nM filter for the microplate reader</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 (&#177;10) nM filter for the microplate reader</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anaerobic culture vial (balch tubes) + rubber stoppers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Modified for anaerobic culture tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MA-3000 (mercury analyzer)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH probe</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any pH probe will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical sterile polypropylene centrifuge tubes.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m polyethersulfone syringe filter + syringe</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile/clean glass bottles</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For growth media and standards</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile/clean plastic or PTFE bottles</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For alkali solutions (NaOH/KOH)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents powders: Na2MoO4, Na2SeO4, H3BO3, NaOH, KOH, MnSO4, ZnSO4, CoCl2, NiCl2, ampicillin sodium salt, Difco M9 Minimal Salts, Glucose, MgSO4, Thiamine HCl, NaNO3, l-leucine, l-isoleucine valine, EDTA sodium salt, FeSO4, Sodium Beta-Gylcerophosphate, Mops free acid, (NH4)2SO4, Hg(NO3)2, CdCl2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Milli-Q water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Autoclaved or filter sterilized is fine.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysogeny Broth</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical grade H2SO4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an anaerobic biosensor assay for the detection of mercury and cadmium

Ртуть (Hg) биодоступность микробов является ключевым шагом для токсичных Hg биоусиления в пищевых цепях. Кадмия (Cd) преобразования и биодоступность бактерии контролировать суммы, которые будут накапливаться в основных продовольственных культур. Биодоступность этих металлов зависит от их видообразования в растворе, но более особенно в анаэробных условиях где Hg метилированию для токсичных monomethylmercury (MeHg) и Cd сохраняется в ризосфере. Поклеточного микробной биодатчики количественно сигналом, когда металл входит в цитозоле и поэтому являются полезными инструментами для оценки металла биодоступность. К сожалению до настоящего времени большинство biosensing усилия сдерживаются в аэробных условиях ввиду ограниченной способности существующих репортер белков функции в отсутствие кислорода. В этом исследовании мы представляем наши усилия разработать и оптимизировать поклеточного биосенсор пробирного способен функционировать анаэробно, который может обнаружить металлов в анаэробных условиях в близком к реальному времени и в течение часа. Мы описываем, как биосенсор может помочь оценить как химические переменные, имеющие отношение к экологической циркуляцией металлов влияет на их биодоступность. Следующий протокол включает методы для (1) Подготовьте Hg и Cd стандартов в анаэробных условиях, (2) подготовить биосенсор в отсутствие кислорода, (3) дизайн и выполнить эксперимент, чтобы определить, как серия переменная влияет на биодоступность Hg или Cd и (4) для количественной оценки и интерпретации данных биодатчик. Мы Показать линейной диапазоны биодатчики и приводятся примеры показаны метод способность различать между металла биодоступность и токсичности путем использования металла индуцибельной и учредительные штаммов.

После пика флуоресценции были количественно согласно шагу 5.3, результат вершины флуоресцирования можно графике согласно переменной концентрации, иллюстрирующие, как эта переменная влияет относительная биодоступность Hg или компакт-диск. К примеру Калибровочная кривая флуоресценции над [HgII] из рисунка 2 даст индуцибельной данные, представленные на рисунке 3A. Для HgII калибровки, кривая будет всегда содержат 3 компоненты для Hg индуцибельной деформации; порог ответ около 1-2 Нм HgII до производства флуоресценции сигнал пропорционален линейно [HgII], линейный Диапазон где 5 Нм HgII надежно всегда будет в центре этого диапазона и плато где увеличение [HgII] больше не ведет к увеличению флуоресценции сигнала. Никаких изменений в производстве сигнала на учредительном штамм показывает, что токсичность от [HgII] не влияет на сигнал производства. Для CdII в рисунке 3Bвсегда есть 2 компоненты для индуцибельной деформации; Линейный диапазон, где 200-300 Нм CdII надежно всегда будет в центре диапазона линейной и плато. Снижение флуоресценции сигнал с увеличением [CdII] показывает, что более высокие концентрации Cd токсичны для клеток и может объяснить снижением производства индуцибельной флуоресценции после плато на 1000 Нм CdII. Таким образом, при тестировании Hg или Cd биодоступность в отношении экологических переменных, мы предлагаем использовать 5 Нм для HgII и 300 Нм для CdII.
В некоторых случаях сигнал производства может надлежащим образом приписывается Hg или Cd биодоступность, но в других случаях сигнал производства могут быть затронуты изменением физиологического состояния биосенсор принимающей ячейки (например, металл интерес или экологические условия испытания являются токсичными). В рисунке 4A, 5 Нм Hg биодоступность был протестирован на градиент Zn (0-10 мкм). В Hg индуцибельной и учредительные штаммов есть аналогичные снижение сигнала с увеличением концентрации Zn. Таким образом один не дискриминирует ли результаты от пониженной биодоступность сигнал или является результатом Zn токсичности. В Рисунок 4B и 4 C, 5 Нм Hg биодоступность был протестирован на градиент мгII (0-10 мм) и MnII (0-10 мкм). Увеличение мгII и MnII концентрации снизилась флуоресценции сигнал индуцибельной штамма. С другой стороны, учредительный штамм не показывают снижение флуоресценции с увеличением мгII и MnII концентрации (мгII и MnII полезны для ячеек в производстве FbFp, как показано на увеличение сигнала флуоресценции). Это показывает, что клетки являются жизнеспособными и сокращение флуоресценции Hg индуцибельной штамма обусловлено снижением Hg биодоступность. Эти данные подчеркивает, насколько важно для всех анализов биосенсор также предоставить учредительные измерения общей пригодности клеток.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58324/58324fig3.jpg"> Рисунок 3: линейный Диапазон биосенсора с ртутью и кадмием. Максимальная флуоресценции измеряется как относительный флуоресценции единиц (РФС) ± 1 стандартное отклонение, испускаемых E. coli NEB5α укрывательство pUC57merR-Pp (Hg-индуцибельной) и pUC19Balch-Pp (учредительные) с добавлением A) HgII (0-15 Нм) и B) CdII (0-1000 Нм) в анаэробных условиях. Флуоресценции был в среднем 3 технических реплицирует в 37 градусов. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58324/58324fig3large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58324/58324fig4.jpg"> Рисунок 4: пример неубедительными результат с цинком и окончательного результата с магния и марганца. Максимальная флуоресценции измеряется как относительный флуоресценции единиц (РФС) ± 1 стандартное отклонение, испускаемых E. coli NEB5α укрывательство pUC57merR-Pp (Hg-индуцибельной) и pUC19Balch-Pp (учредительные) с добавлением A) ZnII (0-10 мкм), B) мгII (0-10 мм), и C) MnII (0-10 мкм) в анаэробных условиях. [HgII] было присвоено 5 Нм для всех процедур и флуоресценции был в среднем 3 технических реплицирует на 37 градусов. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58324/58324fig4large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>

Watch this Scientific Journal Video about An Anaerobic Biosensor Assay for the Detection of Mercury and Cadmium at JoVE.com

An Anaerobic Biosensor Assay for the Detection of Mercury and Cadmium

Здесь мы представляем протокол для использования анаэробных микробных биосенсор поклеточного оценить как различные переменные среды влияет на биодоступность Hg и Cd для бактерий в анаэробных условиях.

Assay анаэробных биосенсора для обнаружения ртути и кадмия

Mercury (Hg) bioavailability to microbes is a key step to toxic Hg biomagnification in food webs. Cadmium (Cd) transformations and bioavailability to ...

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы, касающиеся биогеохимического цикла кадмия и ртути, такие как, как различные экологические переменные влияют на их биодоступность бактерий. Основным преимуществом этого метода является то, что он предлагает квази в режиме реального времени биодоступности данных и жизнеспособных клеток, независимо от наличия кислорода. Как правило, люди, новые для этого метода будет бороться, потому что Есть много времени чувствительных шагов, которые требуют очень тщательного внимания к деталям.Демонстрацией процедуры будет Бен, аспирант из моей лаборатории. Чтобы подготовиться к анализу, получить ртуть неодобренных биосенсор и constitutively выраженный биосенсор от минус 80 градусов по Цельсию крио запасов. Плита клеток на листогенный бульон пластин, содержащих 120 микрограммов на миллилитр ампициллина.Выращиваем культуры пластин в инкубаторе при 37 градусах Цельсия за одну ночь. Между 4:30 и 5 p.m. привить культуру в десять миллилитров LB с ампициллином и расти на ночь при 37 градусов по Цельсию со тряской при 220 об/мин.В период между девятью и .m утра на следующее утро принести культуры, а также ранее подготовленных среднего роста в анаэробной камере. Затем добавьте восемь миллилитров свежей среды роста и 210 микрограммов на миллилитр ампициллина в стерильную трубку.Теперь соберите два миллилитров ночной выращенной культуры и перенесите в двухми миллилитровую микро центрифугу трубки. После центрифугирования на 10 000 RCF в течение 90 секунд, удалить супернатант и повторно в два миллилитров свежей среды роста. Затем добавьте заново нажатую культуру в трубку, содержащую восемь миллилитров свежей среды роста и ампициллина.Используя стерильную технику, аккуратно поместите резиновую пробку на трубку, прежде чем удалить ее из анаэробной камеры. Затем поместите трубку в инкубатор и расти анаэробически при 37 градусах по Цельсию с тряской при 220 об/мин. От трех до пяти .m.принести балч трубки с культурой, новая стерильная трубка для бальзама, и рост среды в анаэробной камере. Добавьте 100 микролитров культуры в 10 миллилитров свежей среды роста с ампициллином в стерильной бальх-трубке. Используя стерильную технику, аккуратно поместите резиновую пробку на бальную трубку.Удалите трубку из анаэробной камеры перед выращиванием его на ночь при 37 градусах по Цельсию при тряске при 220 об/мин. Между девятью и .m на следующий день, перенести культуру и среду роста обратно в анаэробную камеру.Снова добавьте восемь миллилитров среднего роста и ампициллина в стерильную трубку. Перенесите два миллилитров ночной выращенной культуры в двухми миллилитровую микро центрифугу. После центрифугации, как и прежде, удалить супернатант и повторного перерасхода клеток в двух миллилитров свежей среды роста.Затем добавьте заново спенированную культуру в трубку, содержащую свежий средний рост и ампициллин. Используя стерильную технику, аккуратно поместите резиновую пробку на бальную трубку. Удалить его из камеры и расти анаэробно при 37 градусов по Цельсию с встряхивания при 220 об/мин.Мониторинг роста культуры с помощью спектрофотометра путем вихревого культуры, а затем измерения оптической плотности на 600 нанометров или OD600. После трех-четырех часов ожидаемого роста, культура должна достичь OD600 из 6. Теперь возьмите трубку в анаэробную камеру и перенесите культуру в две миллилитровые микро центрифуги.После центрифугации, как и прежде, удалить супернатант и повторное течение каждой клетки неба в двух миллилитров свежей среды воздействия. Повторите этот шаг стирки один раз, чтобы удалить любой след среды роста. Теперь объединить обе микро центрифуги трубки клеточной культуры в семь миллилитров PTFE стандартный флакон для получения биосенсорного запаса для использования в анализе воздействия.Перед началом эксперимента проверьте анаэробный монитор, чтобы убедиться, что в анаэробной камере нет кислорода. Дизайн макета пластины в соответствии с шаблоном 96 хорошо. Для запуска экспериментов в технических репликаций из трех это позволит 32 различных процедур, которые лучше всего представлены с четырьмя на восемь сетки для настройки флаконов.Настройка сетки из четырех на восемь в соответствии с макетом анализной пластины. Затем поместите семь миллилитров стандартных флаконов PTFE в лоток. Флаконы должны обрабатываться только путем манипулирования внешней стороны флакона.Добавьте средний объем экспозиции в каждый флакон, соответствующий каждому лечению. К каждому флакону добавить соответствующий объем химической переменной для тестирования в соответствии с расположением пластины. Теперь добавьте нитрат в каждый флакон так, чтобы концентрация 200 микромолеров.Исключите этот шаг для составляющих биосенсорных заготовок для лечения. Чтобы добавить ртуть во флаконы, сначала возьмите от четырех до восьми микромоляных запасов и хорошо встряхните. Разбавить раствор и воздействия среды в семь миллилитров PTFE флакона в концентрации от 100 до 250 наномолярных сделать рабочий раствор ртути.Из этого рабочего решения добавьте ртуть в необходимые флаконы в соответствии с макетом пластины. После добавления ртути или кадмия вручную встряхните пластину в орбитальном движении. Эксперимент может быть приостановлен в настоящее время в зависимости от времени, необходимого для ртути или кадмия, чтобы специатить в растворе.Когда эксперимент возобновляется, осторожно пипетки биосенсора запас туда и обратно, чтобы обеспечить однородность. Затем добавьте 100 микролитров биосенсорного запаса к каждому флакону и вручную встряхните пластину, как раньше. Разогреть считыватель пластины до 37 градусов по Цельсию и создать кинетический запустить в течение десяти часов с читает каждые две точки пять-пять минут.Орбитальная тряска между показаниями. Настройка запуска принять флуоресценции измерений с флуоресценции возбуждение 440 нанометров и выброс 500 нанометров. Теперь пипетка 200 микролитров от каждого флакона PTFE в четыре на восемь сетки в соответствующие скважины 96 пластины скважины.Pipette туда и обратно пять раз перед передачей каждых 200 микролитров. Вместо того, чтобы отказаться от наконечника пипетки, оставьте наконечник пипетки в флаконе PTFE, чтобы отслеживать прогресс труб. Поместите 96 хорошо пластины в лоток пластины читателя.Затем поместите крышку на 96 хорошо пластины и начать анализ. Вот репрезентативные результаты, показывающие исправленные данные о флуоресценции в качестве функции времени. Флуоресценция показана с увеличением концентрации ртути в неодобренном биосенсоре.Все значения пусты для контроля ртути. Флуоресцентные пики можно количественно определить, чтобы показать флуоресцентный сигнал в качестве функции концентрации ртути или кадмия. Как для неискупленных, так и для составных биосенсоров для тестирования переменных следует использовать концентрацию ртути или кадмия в середине линейного диапазона неискушимых датчиков.Вот примеры безрезультатного результата с цинком. И убедительный результат с магнием и марганцем на биодоступность ртути к биосенсору. Результат с цинком является неубедительным, потому что составной флуоресценции распадается с неудобовательной флуоресценцией, указывающей токсичности.При попытке этой процедуры важно помнить, чтобы войти в концентрации кадмия или ртути, поскольку они будут использоваться для калибровки биосенсора. Следуя этой процедуре, другие методы, такие как термодинамическое моделирование акальных систем, могут быть выполнены, чтобы ответить на дополнительные вопросы, такие как, как конкретные химические виды ртути или кадмия влияют на их биодоступность. Не забывайте, что работа с кадмием и ртутью и сильными кислотами, такими как серная кислота, может быть чрезвычайно опасной, и при выполнении этой процедуры всегда следует принимать меры предосторожности, такие как ношение средства индивидуальной защиты.После его развития этот метод проложил путь для исследователей в области экологической микробиологии для изучения квази в режиме реального времени анаэробной ртути или кадмия биодоступности и генетически удобовательных микробов.

Research

JoVE Journal

Environment

Evaluation of Integrated Anaerobic Digestion and Hydrothermal Carbonization for Bioenergy Production

Оценка комплексного анаэробного сбраживания и гидротермальной карбонизации для биоэнергетики производства

Lignocellulosic biomass is one of the most abundant yet underutilized renewable energy resources. Both anaerobic digestion (AD) and hydrothermal ...

Detection of Foodborne Bacterial Pathogens from Individual Filth Flies

Обнаружение пищевых бактериальных патогенов из отдельных Filth мух

There is unanimous consensus that insects are important vectors of foodborne pathogens. However, linking insects as vectors of the pathogen causing a ...

Development of Sulfidogenic Sludge from Marine Sediments and Trichloroethylene Reduction in an Upflow Anaerobic Sludge Blanket Reactor

Разработка сульфидогенных шлам из морских отложений и уменьшению трихлорэтилена в одеяло реактора с восходящим потоком анаэробного ила

The importance of microbial sulfate reduction relies on the various applications that it offers in environmental biotechnology. Engineered sulfate ...

Spotting Cheetahs: Identifying Individuals by Their Footprints

Зрительные гепардов: определение физических лиц на их следы

The cheetah (Acinonyx jubatus) is Africa's most endangered large felid and listed as Vulnerable with a declining population trend by the IUCN1. It ranges ...

Experimental Column Setup for Studying Anaerobic Biogeochemical Interactions Between Iron (Oxy)Hydroxides, Trace Elements, and Bacteria

Experimental Column Setup for Studying Anaerobic Biogeochemical Interactions Between Iron OxyHydroxides, Trace Elements, and Bacteria

Установка экспериментальной столбца для изучения анаэробных биогеохимических взаимодействий между гидроксидов железа (Окси), микроэлементов и бактерий

Fate and speciation of trace elements (TEs), such as arsenic (As) and mercury (Hg), in aquifers are closely related to physio-chemical conditions, such as ...

Fluorescent Paper Strips for the Detection of Diesel Adulteration with Smartphone Read-out

Флуоресцентный бумажные полоски для выявления фальсификации дизель с Smartphone считывания

Three fluorescent molecular rotors of 4-dimethylamino-4-nitrostilbene (4-DNS) were investigated for their potential use as viscosity probes to indicate ...

A Precise and Autonomous System for the Detection of Insect Emergence Patterns

Точные и автономной системы для обнаружения насекомых появление моделей

Existing systems to measure insect emergence patterns have limitations; they are only partially automated and are limited in the maximum number of ...

Detection of Tilapia Lake Virus Using Conventional RT-PCR and SYBR Green RT-qPCR

Обнаружение тилапии озеро вирус с помощью обычных RT-PCR и SYBR зеленый RT-ПЦР

The aim of this method is to facilitate the fast, sensitive and specific detection of Tilapia Lake Virus (TiLV) in tilapia tissues. This protocol can be ...

An Induction System for Clustered Stomata by Sugar Solution Immersion Treatment in Arabidopsis thaliana Seedlings

An Induction System for Clustered Stomata by Sugar Solution Immersion Treatment in Arabidopsis thaliana Seedlings

Индукционной системы для кластерных устьиц на лечение погружения раствора сахара в проростках Arabidopsis thaliana

Stomatal movement mediates plant gas exchange, which is essential for photosynthesis and transpiration. Stomatal opening and closing are accomplished by a ...

Cultivation of Green Microalgae in Bubble Column Photobioreactors and an Assay for Neutral Lipids

Выращивание зеленых микроводорослей в фотобиореакторах колонки пузыря и Assay для нейтральные липиды

There is significant interest in the study of microalgae for engineering applications such as the production of biofuels, high value products, and for the ...