Name: an anaerobic biosensor assay for the detection of mercury and cadmium
Uploaded: 2018-12-17T13:00:00
Duration: 9 min 33 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Anaerobic Biosensor Assay for the Detection of Mercury and Cadmium at JoVE.com

Vi vill tacka kommentarer från två anonyma granskare som väl medlemmar Poulain labbet för insiktsfull diskussion om utvecklingen av den anaeroba biosensor. En tidig forskare utmärkelse från provinsen Ontario och Discovery bidrag och en accelerator tillägg från de naturliga vetenskaperna och Engineering Research Council of Canada till A.J.P. finansierade denna studie.

Författarna har något att avslöja.

Mikrobiell biosensorer är användbara verktyg för att identifiera mekanismer genom vilka metaller interagerar med mikrober. Här, vi beskriver en metod som anaerobt kan kvantifiera HgII och CdII biotillgängligheten till en gramnegativa värdcellen (E. coli) och ge ett kvantifierbara resultat inom några timmar. En av de stora styrkorna i detta protokoll är att det tillåter omfattande kontroll av metall artbildning exponering medium genom att undvika starka bindning ligander eller komponenter som kan leda till metall nederbörd. Metall artbildning har modelleras och testats i detta exponering medium använder PHREEQC17, men andra metall artbildning programvara får användas. När det gäller inga extra ligander, Hg artbildning förväntas vara närvarande som 97% Hg(OH)2 och 3% Hg (NH3)22 +, medan Cd artbildning kommer att presentera som 59% Cd-β-glycerofosfat, 25% Cd2 +och 16% CdSO4. Använder en enkel termodynamisk modellering programvara, kan användaren utforma exponering media och testa för biotillgängligheten av metall av intresse. Biosensor värdcellen (E. coli NEB5α) är dessutom livskraftig över ett brett spektrum av pH (5-8,5) och NaCl koncentration (0-0,55 M)17.
Hg-metylering är en anaerob process, och det protokoll som beskrivs i denna studie har inte ett krav för syre, vilket möjliggör mer exakt beskrivning av anaerob metabolism på metall biotillgänglighet. Detta är viktigt eftersom närvaro av syre förändrar gen uttryck profiler48,49 och därmed potential transportera utbildningsvägar. metoden utgör därför en fördel över för närvarande befintliga aerob alternativ. Den biosensing bygga presenteras här kan potentiellt användas med andra anaeroba värdar som kan vara mer relevant för kvicksilver metylering (t.ex. Geobacter, Desulfovibrio), men kanske mindre eftertraktansvärda än E. coli. En nuvarande begränsning av den strategi som presenteras här är att våra detektionsgräns inte har ännu nått pM nivåer, strider mot befintliga aeroba system4,19,37. Det är emellertid viktigt att notera att för att uppnå dessa låga detektionsgränser flera steg behöver tas44: jag) ligand tillägg krävs för att säkerställa att Hg förblir i lösning och inte adsorberas på mikrobiell cell väggen (Hg blir oåterkallelig gräns till cell surface tioler förhindra dess biotillgänglighet25,27. Se tröskel svaret för Hg i figur 3A), ii) ändringar av cell densiteten, eller iii) ändra den genetiska konstruktionen att omfatta transportproteiner av den mer-operon (nämligen merT och merP), ökande Hg flux inuti cellen50,51. Dessa ändringar skulle vara fördelaktigt att upptäcka låga koncentrationer av Hg, men inte nödvändigtvis perfekt vid bedömningen av miljömässigt relevanta situationer. Medan tidigare kadmium biosensorer finns primärt som en ”proof of principen”, utformats de i komplexa media som inte tillåter utredaren att bedöma rollen av artbildning på biotillgängligheten41,42, 43 , 44.
Biosensor är ett otroligt användbart verktyg för att fastställa mekanismer som metall arter är biotillgängliga. Eftersom värd organismen inte är en Hg-denatureringsmedel för alkohol, får det endast användas för att utveckla en modell för hur Hg kan ange gramnegativa bakterier och inte en slutgiltig motivering för hur Hg-methylators förvärvar Hg. Det finns andra metoder för att fastställa Hg biotillgänglighet, såsom metylering, som ett resultat av upptag eller användning av en massbalans metod10,15,20,45,46. Som sagt, erbjuder metoden presenteras här fördelen av quasi realtid biotillgänglighet data i viabla celler. Vi rekommenderar inte att denna metod används för att kvantifiera totalt Hg eller Cd nivåer i en miljö matris. Trots den föreslagna användningen av biosensorer att fastställa metall koncentrationer i den miljö36, finns många mer lättillgängliga standard metoder såsom ICP-MS, Falk (för CD-analys) eller kall ånga atomabsorption spektroskopi (för Hg analys). Biosensor kan dock vara används för att bestämma om en viss miljö matris har potential att förbättra eller hämma biotillgänglighet. Detta uppnås genom att utföra standardtillsats.
PH-värdet i exponering media kan ändras till någonstans inom spänna av 5 och 8,5, förutsatt moppar fri syra (buffert) är utbytt med en alternativ fri syra av en buffert med den lämpliga pKa (se lista över lämpliga buffertar (Ferreira o.a. (2015) 47) och justeras med KOH till lämpligt pH när du gör exponering media. Dessutom, metoden är inte begränsad till Hg och Cd, men skulle kunna utvidgas till andra metaller som använder andra transkription regulatorer.
Exponering analysen kan ändras för att utforska påverkan av andra Elektronacceptorer t.ex O2 och tenofovirdisoproxilfumarat på Hg eller Cd biotillgänglighet. Mindre ändringar till metoden att utnyttja både O2 och fumarat som Elektronacceptorer finns tillgängliga på begäran.
Sammanfattningsvis vill vi betona följande punkter: jag) är det absolut nödvändigt att koncentrationerna av Cd eller Hg bestånd är känd i steg 2, eftersom dessa används för att kalibrera biosensor. II) exponering dag, tillväxten av celler måste stoppas på en OD600 0,6 (± 0,1) och att man är försiktig när omblandning cellkulturer, som biosensor är kalibrerad till denna cell densiteten. III) slutligen är det viktigt att exponering mediet är minutiöst exponering dag. För att säkerställa framgången för protokollet, bör flera kulturer odlas samtidigt (till att kringgå möjligheten till tillväxt misslyckande) och odlingsmedium bör göras om varje vecka (för att kringgå metastability av media och eventuell förorening). Det bör också noteras att biologiska replikat (flera cellkulturer) uttrycka variationen när det gäller att signalera produktion. Även fluorescerande Svaren kan variera från kultur till kultur, ska fluorescerande trenderna som svar på en viss variabel vara densamma i hela många biologiska replikat.

Kvicksilver (Hg) är en global förorening och dess biotillgänglighet att Hg methylating mikrober är det första steget mot dess biomagnifiering via näringsvävar och dess möjliga neurotoxiska effekter i människa och djur1. Det är för närvarande tänkt att mikrobiell Hg-metylering är en intracellulär process som kräver: i) arterna av Hg vara biotillgängliga2,3,4,5,6,7 och ii) för cellen att kunna fysiologiskt methylating Hg8,9,10. Kadmium (Cd) bioackumuleras i organismer, men gör inte biomagnifies i foodwebs och används ofta i industriella och kommersiella processer som ofta kan orsaka akuta exponeringar i människor och miljö11. Även om mikrober spelar flera viktiga roller i Hg öde i miljön, fokusera de flesta studier på Cd geokemi och ekotoxikologi på mikrobiell eukaryotes12. Konsumtionen av grödor (t.ex. ris) är den huvudsakliga källan till direkt exponering för kadmium; i det här fallet påverkar biotillgängligheten av Cd till mikrober av odlingsbädden direkt beloppet växter kan ackumulera13.
Hg transport vägar är komplexa och eventuellt innebära en aktiv transport steg14. När en transportör är inblandade, senaste arbete föreslog att HgII använder en ZnII eller MnII transportör7,15,16,17. Medan CdII är hypotesen för att transporteras av misstag in i cytosolen genom tvåvärda metall transport vägar (särskilt MnII eller ZnII), mekanismer för CdII transport inuti cellerna förblir spekulativa och inte Cd-specifika transport väg har varit identifierade13,18. Oavsett karaktären av transportörerna inblandade, tre mekanistiska faktorer i slutändan bestämma metaller förmåga att gå in i en cell: i) den metall artbildning i lösning2,6,15, 16 , 17 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23, ii) biophysiochemical egenskaper cellmembranet17,24,25,26,27,28,29 ,30,31, och iii) möjligheten för metallen som åt en transport webbplats7,32. CD och Hg är osannolikt att existerar som fria joner mikrobiell fysiologiskt relevanta villkor på grund av deras hög affinitet för upplöst organiskt materia (DOM), kelaterande föroreningar (t.ex. EDTA), eller reducerade svavel beståndsdelarna33, 34,35 (CdII kan existera som en fri ion eller formuläret ion-par i avsaknad av dessa ligander). Det finns en brist på effektiva metoder för att fastställa hur dessa metall arter är biotillgängligt under förhållanden som är relevanta för deras öde i miljön. Exempelvis Hg är metylerad under anaeroba förhållanden14, och både kadmium och Hg är mjuka metaller (eller klass B katjoner), som kräver att deras artbildning utredas under förhållanden som upprätthåller integriteten för reducerade svavel grupper.
Mikrobiell biosensorer är bakterieceller som avger en mätbar signal som svar på de intracellulära koncentrationerna av en metall, i detta fall Hg eller Cd. Som sådan, är de perfekt verktyg för att förstå hur metaller in en cell36, förutsatt att exponeringsförhållanden kontrolleras noga för. Hg biosensorer innehåller vanligtvis genfusioner mellan reglerande kretsen av den mer-operon (inklusive gener som kodar för transkription regulatorn MerRas samt operatören och arrangören regioner av operon) och rapportering gener (t.ex. Lux, gfp, lac gener). När kvicksilver finns i cytoplasman, kommer det att binda till MerR, vilket resulterar i transkription av rapportering gener och efterföljande signal produktion19,37. Särskilda CD-biosensorer är oftast utformade med de cadC, cadAC, zntA eller zntR kodade transkription regulatorer38, men det är värt att notera att MerR har lägre, men mätbar affinitet till Cd5. På grund av aerob begränsning av mest vanligaste självlysande eller fluorescerande reporter proteiner, tills nyligen mikrobiell biosensorer återstod inte erbjuda insikter i metabolismen av metaller under syrefria förhållanden. Detta gör anaerob detektion av metaller biotillgänglighet mycket svårt över en rad förhållanden relevanta för deras vidare öde i miljön, särskilt i närvaro av redox känsliga ligander (t.ex. svavelväte och tioler)4, 5 , 39.
För att lindra det metodologiska hindret av live imaging i frånvaro av syre, Drepper et al. (2007) har utvecklat en flavin-baserade fluorescerande protein (FbFp), baserat på ljus syre spänning domän SB2 protein från P. putida. Detta protein familj är kunna fluorescerar i avsaknad av syre40. Vårt labb bygger på arbete av Drepper et al., och utformat en anaerob biosensor som möjliggör studier av Hg biotillgänglighet under genotoxisk och anoxiska förhållanden och över ett brett spektrum av salthalt 17. I den nuvarande papperet beskriver vi hur du bereder och använder biosensor för att testa miljövariabler inflytande på Hg eller Cd biotillgänglighet. Även om vi utvecklat biosensor för HgII, valde vi att utföra experiment med CdII som ett sätt att dra läsarens uppmärksamhet till det faktum att biosensorer kan också reagera på flera stressfaktorer som sannolikt kan Co-uppstå i miljö matriser; i detta fall CdII undersöktes eftersom det är känt att binda till transkriptionell regulatorn MerR5. Här visar vi representativa kalibrering och funktionella linjära spänner med avseende på antingen metall. Vi ger ett exempel när den biosensor resultaten är avgörande (MgII och MnII på Hg biotillgänglighet) och ofullständiga (ZnII på Hg biotillgänglighet).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>7 ml standard vial, rounded interior</td>
			<td>Delta Scientific</td>
			<td>200-007-20</td>
			<td>34 recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vial tray, 21 mm openings</td>
			<td>Delta Scientific</td>
			<td>730-2001</td>
			<td>4 for (4 x 8 grid)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 mm Closure</td>
			<td>Delta Scientific</td>
			<td>600-024-01</td>
			<td>32 recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LID CORNER NOTCH BLK STR CS/50</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Corning 3931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 96- well clear-bottom nonbinding surface microplate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Corning 3651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anaerobic Chamber (glovebox)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>The air in the anaerobic chamber should be (97 % N2 &#177; 2 % and 3 % H2 &#177; 2 %)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Palladium catalyst</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Converts O2 to H2O in the anaerobic chamber. Not required but recommended.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>450 (&#177;10) nM filter for the microplate reader</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 (&#177;10) nM filter for the microplate reader</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anaerobic culture vial (balch tubes) + rubber stoppers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Modified for anaerobic culture tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MA-3000 (mercury analyzer)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH probe</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any pH probe will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical sterile polypropylene centrifuge tubes.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m polyethersulfone syringe filter + syringe</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile/clean glass bottles</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For growth media and standards</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile/clean plastic or PTFE bottles</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For alkali solutions (NaOH/KOH)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents powders: Na2MoO4, Na2SeO4, H3BO3, NaOH, KOH, MnSO4, ZnSO4, CoCl2, NiCl2, ampicillin sodium salt, Difco M9 Minimal Salts, Glucose, MgSO4, Thiamine HCl, NaNO3, l-leucine, l-isoleucine valine, EDTA sodium salt, FeSO4, Sodium Beta-Gylcerophosphate, Mops free acid, (NH4)2SO4, Hg(NO3)2, CdCl2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Milli-Q water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Autoclaved or filter sterilized is fine.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysogeny Broth</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical grade H2SO4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an anaerobic biosensor assay for the detection of mercury and cadmium

Kvicksilver (Hg) biotillgängligheten för mikrober är ett viktigt steg att giftiga Hg biomagnifiering i näringsvävar. Kadmium (Cd) transformationer och biotillgänglighet för bakterier styra hur mycket som kommer att ansamlas i basföda grödor. Biotillgängligheten av dessa metaller är beroende av deras artbildning i lösning, men särskilt under syrefria förhållanden där Hg är metylerad till giftiga monomethylmercury (MeHg) och Cd kvarstår i rhizosfären. Hela-cell mikrobiell biosensorer ge en mätbar signal när en metall in cytosolen och därför är användbara verktyg för att bedöma metall biotillgänglighet. Tyvärr, de flesta biosensing insatser har hittills varit begränsad till oxic miljöer på grund av den begränsade förmågan av befintliga reporter proteiner att fungera i frånvaro av syre. I denna studie presenterar vi vår strävan att utveckla och optimera en hela-cell biosensor assay kunna fungera anaerobt som kan upptäcka metaller under syrefria förhållanden i kvasi realtid och inom timmar. Vi beskriver hur biosensor kan hjälpa till att bedöma hur kemiska variabler som är relevanta till den miljömässiga cykling metaller påverkar deras biotillgänglighet. Följande protokoll innehåller metoder för att (1) förbereda Hg och CD-standarder under syrefria förhållanden, (2) förbereda biosensor i frånvaro av syre, (3) design och utföra ett experiment för att avgöra hur en rad variabel påverkar Hg eller Cd biotillgänglighet, och (4) att kvantifiera och tolka biosensor data. Vi visar de linjära spänner av biosensorer och ge exempel som visar metodens förmåga att skilja mellan metall biotillgänglighet och toxicitet genom att utnyttja både metall-inducerbara och konstituerande stammar.

När fluorescens topparna har beräknats enligt steg 5.3, resultatet av fluorescens topparna kan visas i diagram enligt variabel koncentrationen som illustrerar hur variabeln påverkar den relativa biotillgängligheten av antingen Hg eller Cd. Till exempel kommer att kalibreringskurvan av fluorescens över [HgII] från figur 2 ge den inducerbara uppgifter som presenteras i figur 3A. För HgII kalibrering, kurvan kommer alltid innehålla 3 komponenter för Hg-inducerbara stammen; ett tröskelvärde svar på cirka 1-2 nM HgII innan fluorescens signal produktionen är linjärt proportionell till [HgII], det linjära området där 5 nM HgII tillförlitligt alltid kommer i mitten av intervallet och en platå där ökar [HgII] ökar inte längre fluorescensen signal. Ingen förändring i signal produktion på den konstituerande stammen visar att toxicitet från [HgII] inte påverkar signalen produktion. För CdII i figur 3Bfinns det alltid 2 komponenter för den inducerbara stammen; ett linjärt intervall där 200-300 nM CdII tillförlitligt alltid kommer i mitten av det linjära området och en platå. En minskning av fluorescens signal med ökande [CdII] visar att högre Cd koncentrationer är giftiga för cellerna och kan förklara en inducerbara fluorescens produktionsminskningen efter platån vid 1000 nM CdII. Därför, när du testar Hg eller Cd biotillgänglighet med avseende på en miljö variabel, vi föreslår att du använder 5 nM för HgII och 300 nM för CdII.
I vissa fall signalen produktion ordentligt kan hänföras till Hg eller Cd biotillgänglighet, men i andra fall signalen produktion kan påverkas av variationer i det fysiologiska tillståndet av biosensor cell värden (t.ex. metall av intresse eller miljöförhållanden som testats är giftiga). I figur 4A, 5 nM Hg biotillgänglighet testades under en gradient av Zn (0-10 µM). I både Hg-inducerbara och konstituerande stammar finns det en liknande minskning signal med ökande Zn koncentrationer. Därför kan inte en diskriminera oavsett om signalen resultat från sänkt biotillgänglighet eller är ett resultat av Zn toxicitet. I figur 4B och 4 C, 5nM Hg biotillgänglighet testades under en gradient av MgII (0-10 mM) och MnII (0-10 µM). Ökande MgII och MnII koncentrationer minskade fluorescens signalen inducerbara stam. Däremot, den konstituerande stammen inte visade en minskning av fluorescens med ökande MgII och MnII koncentrationer (MgII och MnII är fördelaktigt för cellerna i produktionen av FbFp, vilket framgår av en ökning i fluorescens-signalen). Detta visar att cellerna är livskraftig och fluorescens minskningen av Hg-inducerbara stammen resultat från en minskning av Hg biotillgänglighet. Data betonar hur viktigt det är för alla biosensor analyser att också ge konstituerande mätningar av cell kondition.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58324/58324fig3.jpg"> Figur 3: linjära spänner av biosensor med kvicksilver och kadmium. Maximala fluorescens mätt som relativa fluorescens enheter (RFU) ± 1 standardavvikelse som avges av E. coli NEB5α hysande pUC57merR-Pp (Hg-inducerbara) och pUC19Balch-Pp (DISTINCT) med tillägg av (A) HgII (0-15 nM) och B) CdII (0-1000 nM) under anaeroba förhållanden. Fluorescens var medelvärdet av 3 tekniska replikerar vid 37 ˚C. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58324/58324fig3large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58324/58324fig4.jpg"> Figur 4: exempel på ett osäkert resultat med zink och ett avgörande resultat med Magnesium och mangan. Maximala fluorescens mätt som relativa fluorescens enheter (RFU) ± 1 standardavvikelse som avges av E. coli NEB5α hysande pUC57merR-Pp (Hg-inducerbara) och pUC19Balch-Pp (DISTINCT) med tillägg av (A) ZnII (0-10 µM), B) MgII (0-10 mM), och C) MnII (0-10 µM) under anaeroba förhållanden. [HgII] fastställdes till 5 nM för alla behandlingar och fluorescens var medelvärdet av 3 tekniska replikat vid 37 ˚C. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58324/58324fig4large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>

Watch this Scientific Journal Video about An Anaerobic Biosensor Assay for the Detection of Mercury and Cadmium at JoVE.com

An Anaerobic Biosensor Assay for the Detection of Mercury and Cadmium

Här presenterar vi ett protokoll för att använda en anaerob mikrobiell biosensor hela-cell för att utvärdera hur olika miljövariabler påverka biotillgängligheten av Hg och Cd för bakterier i syrefria miljöer.

Anaerob Biosensor test för påvisande av kvicksilver och kadmium

Mercury (Hg) bioavailability to microbes is a key step to toxic Hg biomagnification in food webs. Cadmium (Cd) transformations and bioavailability to ...

Denna metod kan hjälpa till att besvara viktiga frågor angående den biogeokemiska cyklingen av kadmium och kvicksilver såsom hur olika miljövariabler påverkar deras biotillgänglighet för bakterier. Den största fördelen med denna teknik är att den erbjuder quasi realtid biotillgänglighet data och livskraftiga celler oberoende av förekomsten av syre. Generellt individer nya till denna metod kommer att kämpa eftersom det finns många tid känsliga steg som kräver mycket noggrann uppmärksamhet på detaljer.Demonstrerar proceduren blir Ben, en grad-elev från mitt labb. För att förbereda för analysen, hämta kvicksilver inducerbara biosensor och den kontitivt uttryckta biosensorn från en minus 80 grader Celsius cryo lager. Platta cellerna på Lysogeny buljong plattor som innehåller 120 mikrogram per milliliter ampicillin.Odla tallrikskulturerna i en inkubator vid 37 grader Celsius över natten. Mellan 4:30 och 5 p.m. inokulera en kultur i tio milliliter lb med ampicillin och växa över natten vid 37 grader Celsius med skakningar på 220 rpm.Vid mellan nio och tio a.m nästa morgon föra kulturen samt den tidigare beredda tillväxtmedium i anaerobkammaren. Tillsätt sedan åtta milliliter av färskt tillväxtmedium och 210 mikrogram per milliliter ampicillin i ett sterilt balchrör.Samla nu två milliliter av den över natten odlade kulturen och överföra till en två milliliter mikro centrifug röret. Efter centrifugering vid 10, 000 RCF i 90 sekunder, ta bort supernatanten och resuspend i två milliliter färskt tillväxtmedium. Tillsätt sedan den återanvändbara kulturen till balchröret som innehåller åtta milliliter av färskt tillväxtmedium och ampicillin.Med steril teknik placerar du försiktigt en gummipropp på balchröret innan du tar ut det ur den anaeroba kammaren. Placera sedan röret i en inkubator och växa anaerobt vid 37 grader Celsius med skakningar på 220 rpm. Mellan tre och fem .m.föra balch röret med kulturen, en ny steril balch röret, och tillväxtmediet i anaerob kammare. Tillsätt 100 mikroliter av kulturen till 10 milliliter av färskt tillväxtmedium med ampicillin i det sterila balchröret. Med hjälp av steril teknik, placera försiktigt en gummipropp på balchröret.Ta bort röret från den anaeroba kammaren innan du odlar det över natten vid 37 grader Celsius med skakningar vid 220 rpm. Mellan nio och tio a.m nästa dag, överföra kulturen och tillväxtmediet tillbaka till den anaeroba kammaren.Återigen lägga åtta milliliter tillväxt medium och ampicillin i en steril balch rör. Överför två milliliter av den över natten fullvuxna kulturen in i ett två milliliter mikrocentrifugrör. Efter centrifugeringen som tidigare, ta bort supernatanten och resuspend cellerna i två milliliter av färskt tillväxtmedium.Tillsätt sedan den återanvändbara kulturen till balchröret som innehåller det färska tillväxtmediet och ampicillin. Med hjälp av steril teknik, placera försiktigt en gummipropp på balchröret. Ta bort den från kammaren och växa anaerobt vid 37 grader Celsius med skakningar på 220 rpm.Övervaka kulturens tillväxt med hjälp av en spektrofotometer genom att virvelsa kulturen och sedan mäta den optiska densiteten vid 600 nanometer eller OD600. Efter tre till fyra timmars förväntad tillväxt, bör kulturen nå en OD600 av 6. Nu tar röret i anaerob kammaren och överföra kulturen i två två milliliter mikro centrifugrör.Efter centrifugeringen som tidigare avlägsna supernatanten och resuspend varje cell gom i två milliliter av färskt exponeringsmedium. Upprepa detta tvättsteg en gång för att ta bort eventuella spår av tillväxtmediet. Nu kombinera både mikro centrifugrör av cellodling i en sju milliliter PTFE standard injektionsflaska för att erhålla biosensor beståndet för användning i exponeringsanalysen.Innan du startar experimentet kontrollera anaerob monitorn för att säkerställa att det inte finns syre i den anaeroba kammaren. Designa plattans layout enligt en 96 brunnsmall. För att köra experiment i tekniska kopior av tre detta kommer att möjliggöra 32 olika behandlingar, som bäst representeras med en fyra av åtta rutnät för att ställa in injektionsflaska.Ställ in de fyra med åtta rutnät enligt assay plate layout. Placera sedan sju milliliter PTFE standard injektionsflaska i facket. Injektionsflaskan ska endast hanteras genom att manipulera utsidan av injektionsflaskan.Tillsätt den exponeringsmedie volymen i varje injektionsflaska som motsvarar varje behandling. Till varje injektionsflaska tillsätt motsvarande volym av den kemiska variabeln som ska testas enligt plattans layout. Tillsätt nu nitrat till varje injektionsflaska så att koncentrationen blir 200 mikromolar.Uteslut detta steg för kontitutiva biosensorbehandlingsstom. För att lägga till kvicksilver i injektionsflaskan, ta först de fyra till åtta mikromolar lager och skaka väl. Späd lösningen och exponeringsmediet i en injektionsflaska med sju milliliter PTFE till en koncentration på 100 till 250 nanomolar för att göra en fungerande kvicksilverlösning.Från denna arbetslösning, tillsätt kvicksilver till de nödvändiga injektionsflaskan enligt plattan layout. Efter att ha lagt till kvicksilver eller kadmium manuellt skaka plattan i en orbital rörelse. Experimentet kan pausas nu beroende på den tid som krävs för kvicksilver eller kadmium att speciatera i lösning.När experimentet återupptas, försiktigt pipet biosensor lager fram och tillbaka för att säkerställa homogenitet. Tillsätt sedan 100 mikroliter av biosensorbeståndet till varje injektionsflaska och skaka plattan manuellt som tidigare. Värm upp tallriksläsaren till 37 grader Celsius och sätt upp en kinetisk körning i tio timmar med läsningar varannan punkt fem till fem minuter.En omloppsbana skakar mellan avläsningar. Ställ in körningen för att ta fluorescensmätningar med en fluorescensutexcitation av 440 nanometer och ett utsläpp av 500 nanometer. Nu pipettera 200 mikroliter från varje PTFE-injektionsflaska i de fyra av åtta ruten i motsvarande brunnar i 96 brunnsplattan.Pipett fram och tillbaka fem gånger innan du överför varje 200 mikroliter. Istället för att kassera pipettspetsen, låt pipetten i PTFE-injektionsflaskan hålla reda på pipetteringsförlopp. Placera 96 brunnsplattan i tallriksbrickan på tallriksläsaren.Placera sedan locket på 96 brunnsplattan och börja analysen. Här är representativa resultat som visar korrigerade fluorescensdata som en funktion av tiden. Fluorescens visas med ökande koncentrationer av kvicksilver till den inducerbara biosensorn.Alla värden är tomma till den ingen kvicksilver kontroll. De fluorescerande topparna kan kvantifieras för att visa den fluorescerande signalen som en funktion av kvicksilver eller kadmiumkoncentration. För både de inducerbara och de kontitutiva biosensorerna bör kvicksilver- eller kadmiumkoncentrationen i mitten av det inducerbara sensorernas linjära område användas för testning av variabler.Här är exempel på ett resultat som inte är övertygande med zink. Och ett avgörande resultat med magnesium och mangan på kvicksilver biotillgänglighet till biosensorn. Resultatet med zink är resultatvärt eftersom den utgörs av fluorescens sönderfaller med inducerbara fluorescens som indikerar toxicitet.Samtidigt försöker detta förfarande är det viktigt att komma ihåg att komma in i koncentrationerna av antingen kadmium eller kvicksilver eftersom dessa kommer att användas för att kalibrera biosensor. Efter detta förfarande, andra metoder som termodynamisk modellering av vattenhaltiga system kan utföras för att svara på ytterligare frågor som hur gör specifika kemiska arter av kvicksilver eller kadmium påverka deras biotillgänglighet. Glöm inte att arbeta med kadmium och kvicksilver och starka syror såsom svavelsyra kan vara extremt farligt och försiktighetsåtgärder såsom bärande av personlig skyddsutrustning bör alltid vidtas när du utför detta förfarande.Efter dess utveckling denna teknik banade väg för forskare inom området miljömikrobiologi att utforska kvasi realtid anaerob kvicksilver eller kadmium biotillgänglighet och genetiskt tractable mikrober.

Research

JoVE Journal

Environment

Evaluation of Integrated Anaerobic Digestion and Hydrothermal Carbonization for Bioenergy Production

Utvärdering av den integrerade rötning och hydro Förkolning för bioenergi

Lignocellulosic biomass is one of the most abundant yet underutilized renewable energy resources. Both anaerobic digestion (AD) and hydrothermal ...

Detection of Foodborne Bacterial Pathogens from Individual Filth Flies

Upptäckt av Foodborne Bakteriell Pathogens från Individuell Filth Flugor

There is unanimous consensus that insects are important vectors of foodborne pathogens. However, linking insects as vectors of the pathogen causing a ...

Development of Sulfidogenic Sludge from Marine Sediments and Trichloroethylene Reduction in an Upflow Anaerobic Sludge Blanket Reactor

Utveckling av Sulfidogenic Slam från marina sediment och Trikloretylen Minskning av en Upflow Anaerobic Sludge Blanket Reactor

The importance of microbial sulfate reduction relies on the various applications that it offers in environmental biotechnology. Engineered sulfate ...

Spotting Cheetahs: Identifying Individuals by Their Footprints

Spotting Cheetahs: identifiera individer av deras fotspår

The cheetah (Acinonyx jubatus) is Africa's most endangered large felid and listed as Vulnerable with a declining population trend by the IUCN1. It ranges ...

Experimental Column Setup for Studying Anaerobic Biogeochemical Interactions Between Iron (Oxy)Hydroxides, Trace Elements, and Bacteria

Experimental Column Setup for Studying Anaerobic Biogeochemical Interactions Between Iron OxyHydroxides, Trace Elements, and Bacteria

Experimentell kolumn Setup för att studera anaerob biogeokemiska interaktioner mellan järnhydroxider (Oxy), spårämnen och bakterier

Fate and speciation of trace elements (TEs), such as arsenic (As) and mercury (Hg), in aquifers are closely related to physio-chemical conditions, such as ...

Fluorescent Paper Strips for the Detection of Diesel Adulteration with Smartphone Read-out

Fluorescerande pappersremsor för detektion av Diesel uppblandning med Smartphone avläsningssystem

Three fluorescent molecular rotors of 4-dimethylamino-4-nitrostilbene (4-DNS) were investigated for their potential use as viscosity probes to indicate ...

A Precise and Autonomous System for the Detection of Insect Emergence Patterns

Ett exakt och autonoma System för detektion av insekt uppkomsten mönster

Existing systems to measure insect emergence patterns have limitations; they are only partially automated and are limited in the maximum number of ...

Detection of Tilapia Lake Virus Using Conventional RT-PCR and SYBR Green RT-qPCR

Upptäckt av Tilapia sjön Virus använder konventionella RT-PCR och SYBR Green RT-qPCR

The aim of this method is to facilitate the fast, sensitive and specific detection of Tilapia Lake Virus (TiLV) in tilapia tissues. This protocol can be ...

An Induction System for Clustered Stomata by Sugar Solution Immersion Treatment in Arabidopsis thaliana Seedlings

An Induction System for Clustered Stomata by Sugar Solution Immersion Treatment in Arabidopsis thaliana Seedlings

En induktion System för klustrade Stomata av socker upplösningsbehandlingen nedsänkning i Arabidopsis thaliana plantor

Stomatal movement mediates plant gas exchange, which is essential for photosynthesis and transpiration. Stomatal opening and closing are accomplished by a ...

Cultivation of Green Microalgae in Bubble Column Photobioreactors and an Assay for Neutral Lipids

Odling av grön mikroalg i bubbla kolumn Photobioreactors och ett test för neutrala lipider

There is significant interest in the study of microalgae for engineering applications such as the production of biofuels, high value products, and for the ...