Name: an anaerobic biosensor assay for the detection of mercury and cadmium
Uploaded: 2018-12-17T13:00:00
Duration: 9 min 33 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Anaerobic Biosensor Assay for the Detection of Mercury and Cadmium at JoVE.com

Anaerobik biyoalgılayıcı gelişimi üzerinde iyi anlayışlı tartışma Poulain laboratuvar üyeleri olarak iki adsız yorumcular yorumlarına teşekkür etmek istiyorum. Ontario eyaleti ve keşif Grant gelen erken bir araştırmacı Ödülü ve A.J.P. için bir Hızlandırıcı ek-Doğa Bilimleri ve Mühendislik Araştırma Konseyi Kanada bu çalışmada finanse.

Yazarlar ifşa gerek yok.

Mikrobiyal biyosensörler hangi metaller mikroplar ile etkileşim vardır mekanizmaları tanımlamak için faydalı araçlardır. Burada, anaerobik Hg ölçmek bir yöntem tarifII ve CdII bioavailability bir Ayagin Gram-negatif konak hücre (E. coli) ve birkaç saat içinde ölçülebilir bir sonuç vermek için. Bu iletişim kuralı en büyük güçlerinden biri bu geniş metal türleşme kontrolünü pozlama ortamda güçlü bağlama ligandlar veya metal yağış için neden olabilir bileşenleri kaçınarak olanak sağlamasıdır. Metal türleşme modellenmiş ve diğer metal türleşme yazılım dağıtılabilir ancak bu poz orta PHREEQC17, kullanarak test edilmiştir. CD türleşme olacak iken hiçbir ekledi ligandlar, Hg türleşme %97 Hg(OH)2 ve % 3 Hg (NH3)22 +, mevcut olması bekleniyor durumunda %59 Cd-β-gliserofosfat, % 25 Cd2 +ve % 16 CdSO4sunar. Basit bir termodinamik modelleme yazılımı kullanılarak, Kullanıcı pozlama medya tasarımı ve faiz metal bioavailability için test edebilirsiniz. Buna ek olarak, biyoalgılayıcı konak hücre (E. coli NEB5α) pH (5-8,5) ve NaCl konsantrasyon geniş bir dizi üzerinde uygulanabilir (0-0.55 M)17.
HG metilasyonu anaerobik bir süreçtir ve bu çalışmada özetlenen Protokolü oksijen, metal bioavailability üzerinde anaerobik metabolizma daha ayrıntılı açıklaması için izin için bir gereklilik yoktur. Çünkü oksijen varlığı gen ifade profilleri48,49 değiştirir ve bu nedenle, potansiyel taşıma yolları önemlidir; Bu nedenle bu yöntem şu anda oluşturulamıyor aerobik alternatifler üzerinde bir avantaj sunuyor. Burada sunulan biosensing inşa etmek için cıva metilasyonu (örn, Geobacter, Desulfovibrio), ama belki daha alakalı olabilir anaerobik diğer ana bilgisayarlarla kullanılabilir daha az E. colidaha uysal. Bir geçerli burada sunulan yaklaşım limitimizi algılama henüz aksine varolan aerobik sistemleri4,19,37pM düzeyleri ulaşmadı kısıtlamasıdır. Ancak bu düşük algılama sınırları elde etmek için dikkat edilmesi gereken önemli birkaç adım44atılması gereken şey: Ben) ligand ektir Hg çözüm içinde kalır ve mikrobiyal hücre (Hg-ecek var olmak geri dönüşü olmayan bağlı duvara absorbe değil emin olmak için gerekli hücre yüzey thiols bioavailability25,27önlenmesi için; bakınız Şekil 3A' Hg için eşik yanıt), II) hücre yoğunluğu veya III) taşıma proteinleri meriçerecek şekilde genetik yapı değiştirmek-operon (yani merT ve merP), artan Hg akı içinde hücre50,51. Bu değişiklikler çevre ilgili durumlar değerlendirirken Hg düşük konsantrasyonlarda algılama yararlı ama mutlaka ideal olacaktır. Önceki kadmiyum biyosensörler öncelikle bir "kanıt, prensip" var ise, onlar türleşme tarihinde bioavailability41,42, rolünü değerlendirmek için Dedektif izin vermez karmaşık medya tasarlanmıştır 43 , 44.
Biyoalgılayıcı metal türler biyoyararlanım olan mekanizmaları belirlemede inanılmaz faydalı bir araçtır. Ana bilgisayar organizma Hg methylator olmadığı için sadece Ayagin Gram-negatif bakteri ve kesin bir gerekçe Hg girebilirsiniz nasıl nasıl Hg-methylators Hg elde etmek için için bir model geliştirmek için kullanılabilir. Diğer yöntemler Hg bioavailability, metilasyon gibi bir sonuç alım veya makarna bir kütle denge yaklaşımı10,15,20,45,46kullanımı belirlemek için mevcut. Bu söyleniyor, yarı gerçek zamanlı bioavailability hücrelerin verilerde avantajı burada sunulan yöntem sunar. Bu yöntem bir çevre matris toplam Hg veya Cd düzey ölçmek için kullanılması önerilmez. Biyosensörler çevre36metal konsantrasyonlarda belirlemek için önerilen kullanılmasına rağmen pek çok daha kolayca kullanılabilir standart yöntem ICP-MS, FAAS (için Cd Analizi) veya soğuk buharı Atomik Absorpsiyon spektroskopisi (için Hg gibi kullanılabilir Analizi). Biyoalgılayıcı ancak olabilir verilen çevre matris potansiyeli geliştirmek veya bioavailability; engel olup olmadığını belirlemek için kullanılan Bu standart eklemeler yaparak elde edilir.
SÜPÜRGEYİ ücretsiz asit (arabellek) bir arabellek uygun pKa ile alternatif bir ücretsiz asit ile değiş tokuş sağlanan pozlama ortam pH için her yerde 5 ve 8.5, aralığı içinde değişmiş olabilir (lütfen uygun arabellek (Ferreira ve ark. listesini görmek (2015) 47) ve KOH ile pozlama medya yaparken uygun pH ayarlanır. Ayrıca, yöntem Hg ve Cd için sınırlı değildir, ancak diğer transkripsiyon regülatör kullanarak diğer metaller için uzun olabilir.
Pozlama tahlil O2 ve fumarat gibi diğer elektron alıcısı etkisi Hg veya Cd bioavailability üzerinde keşfetmek için değiştirilebilir. O2 ve fumarat elektron alıcısı kullanmak için yöntem küçük değişiklikler talep üzerine temin edilmektedir.
Özetle aşağıdaki noktaları vurgulamak istiyoruz: ben) bunlar biyoalgılayıcı ayarlamak için kullanılacak gibi Cd veya Hg stokları konsantrasyonları adım 2, bilinen zorunludur. II) maruz kalma gün hücrelerinin büyümesini bir OD600 0.6 (± 0,1), durdurulmalı ve hücre kültürleri, biyoalgılayıcı resuspending için bu hücre yoğunluğu kalibre edilmiş bu bakım alınır. III) son olarak, pozlama orta titizlikle pozlama gününde yapılır önemlidir. Protokolü'nün başarılı olmasını sağlamak için birden çok kültürü aynı anda (büyüme başarısızlık olasılığını engelleyecek) Yetişkin olmak ve büyüme orta haftalık (metastability medya ve olası bulaşma kaçınmak için) tekrar tekrar düzenlendi. Ayrıca üretim sinyal geldiğinde biyolojik çoğaltır (birden çok hücre kültürü) değişkenlik hızlı dikkat edilmelidir. Floresan yanıt kültür kültür değişebilir rağmen yanıt olarak belirtilen değişkeni floresan eğilimleri çok sayıda biyolojik çoğaltır boyunca aynı kalmalıdır.

Civa (Hg) küresel bir kirletici ve onun bioavailability mikroplar methylating Hg için gıda ağları ve olası nörotoksik etkileri insan ve vahşi yaşam1onun biomagnification yolunda ilk adım. Şu anda o mikrobiyal Hg metilasyonu gerektiren bir süreçtir hücre içi düşünülmektedir: i) biyoyararlanım2,3,4,5,6,7 olmak Hg türler ve II) Hg8,9,10methylating fizyolojik olarak yeteneğine sahip olması hücre için. Kadmiyum (Cd) bioaccumulates organizmalarda, ama değil biomagnifies foodwebs içinde yapar ve genellikle akut Etkilenmeler neden insanlar ve çevre11endüstriyel ve Ticari işlemlerde yaygın olarak kullanılır. Mikroplar Hg kaderi ortamında birkaç anahtar rolü oynar rağmen Cd Jeokimya ve ecotoxicology çoğu çalışmalar mikrobiyal Ökaryotlar12üzerinde odaklanın. Tarımsal ürün (Örneğin, pirinç) tüketimi kadmiyum doğrudan maruz ana kaynağıdır; Bu durumda, Cd bioavailability rizosferde mikroplar için doğrudan tutarı etkiler bitkiler13birikir.
HG taşıma yolları karmaşık ve muhtemelen bir aktif taşıma adım14içerir. Bir taşıyıcı, söz konusu ise son iş HgII bir Zn kullanan önerilenII veya MnII ışınlama7,15,16,17. CDII yanlışlıkla taşınacak olan ise sitozol divalent metal taşıma yolları (özellikle MnII ya da ZnII) aracılığıyla mekanizmaları CDII hücreleri kalır iç taşıma spekülatif ve Hayır Cd özel taşıma yolu tespit13,18oldu. Taşıyıcıları dahil ne olursa olsun, üç mekanik faktörler sonuçta bir hücreye girmek için yetenek metallerin sebebini: i) metal türleşme çözüm2,6,15, 16 , 17 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23, II) hücre zarı17,24,25,26,27,28,29 biophysiochemical özellikleri ,30,31ve III) metal taşıma sitesi7,32erişmek için yeteneği. CD ve Hg kirletici maddeler (Örneğin, EDTA) şelat veya kükürt moieties33azalmış bulunmaktadır ücretsiz iyonları nedeniyle onların yüksek benzeşimi için çözünmüş organik madde (DOM), mikrobiyal fizyolojik ilgili koşullar altında olarak olası değildir, 34,35 (CdII var olabilir bir ücretsiz iyon veya form iyon-çiftler halinde bu ligandlar yokluğu olarak). Bu metal türler biyoyararlanım kaderlerini çevre ile ilgili koşullar altında nasılsın belirlemede etkili yöntemler olmaması. Örneğin, Hg anaerobik14altında metillenmiş ve kadmiyum ve Hg yumuşak metaller (veya sınıf B katyonlar), onların türleşme düşük kükürt grupları bütünlüğünü koşullar altında araştırılması gerektiren.
Mikrobiyal biyosensörler yanıt olarak bu durumda Hg veya Cd bir metal hücre içi konsantrasyonları ölçülebilir bir sinyal yayarlar bakteriyel hücreler vardır. Bu nedenle, onlar nasıl bir hücre36, metaller girmek koşuluyla maruz kalma koşulları dikkatle için kontrol edilir anlamak için ideal araçlardır. HG biyosensörler genellikle içeren gen füzyon merdüzenleyici devre arasında-operon (dahil genlerin transkripsiyon regülatör MerRas operon bölgelerinde de operatör ve organizatörü kodlama) ve genler raporlama (Örneğin, Lux, gfp, lac genler). Merkür sitoplazma içinde olmadığı durumlarda, Merr'e, sonraki sinyal üretim19,37ve raporlama genlerin transkripsiyon kaynaklanan bağlayacaksınız. Yinelenen belirli Cd biyosensörler, cadC, kullanarak tasarlanmış cadAC, zntA veya zntR kodlanmış transkripsiyon regülatör38ama Merr'e Cd5alt henüz ölçülebilir bir yakınlık olduğunu fazlalaştı. Son zamanlarda mikrobiyal biyosensörler metaller anoksik şartlarda Biyotransformasyon anlayışlar sunmaz kaldı kadar çoğu aerobik kısıtlaması nedeniyle Işıksaçan veya floresan muhabir proteinler, yaygın olarak kullanılan. Bu metaller bioavailability anaerobik tespiti çok zor koşulları bir dizi üzerinde ilgili redoks hassas ligandlar (Örneğin, sülfat ve thiols)4, varlığında özellikle çevre kaderlerini yapar 5 , 39.
Hafifletmek için metodolojik engel canlı görüntüleme yokluğunda oksijen, Drepper vd. (2007) bir flavin tabanlı floresan protein (FbFp) geliştirilen, P. putidaSB2 protein ışık oksijen gerilim etki alanını temel alan. Bu protein ailesi oksijen40yokluğunda bulabilsem yapabiliyor. Drepper ve ark.çalışmaları bina, bizim laboratuvar Hg bioavailability oxic ve anoksik koşullar altında ve üzerinde tuzluluk 17geniş bir çalışma için izin veren bir anaerobik biyoalgılayıcı tasarlanmış. Geçerli kağıt hazırlamak ve biyoalgılayıcı Hg veya Cd bioavailability etkisi ortam değişkenleri sınamak için nasıl kullanılacağını açıklar. Her ne kadar biyoalgılayıcı HgIIiçin geliştirdiğimiz, biyosensörler Ayrıca işbirliği içinde çevre oluşma olasılığı birden çok stres yanıt aslında okuyucunun dikkatini çekmek için bir araç olarak CdII ile deneyler yerine getirmeyi seçtiniz matrisler; Transkripsiyon regülatör Merr'e5bağlamak için bilindiğinden bu durumda CdII araştırılmıştır. İşte, temsilcisi kalibrasyon ve fonksiyonel doğrusal aralıkları ile ilgili her iki metal göstermektedir. Biyoalgılayıcı'nın sonuçları kesin (MgII ve Mn Hg bioavailabilityII ) olduğunda biz de bir örnek vermek ve sonuçsuz (Zn Hg bioavailabilityII ).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>7 ml standard vial, rounded interior</td>
			<td>Delta Scientific</td>
			<td>200-007-20</td>
			<td>34 recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vial tray, 21 mm openings</td>
			<td>Delta Scientific</td>
			<td>730-2001</td>
			<td>4 for (4 x 8 grid)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 mm Closure</td>
			<td>Delta Scientific</td>
			<td>600-024-01</td>
			<td>32 recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LID CORNER NOTCH BLK STR CS/50</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Corning 3931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 96- well clear-bottom nonbinding surface microplate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Corning 3651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anaerobic Chamber (glovebox)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>The air in the anaerobic chamber should be (97 % N2 &#177; 2 % and 3 % H2 &#177; 2 %)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Palladium catalyst</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Converts O2 to H2O in the anaerobic chamber. Not required but recommended.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>450 (&#177;10) nM filter for the microplate reader</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 (&#177;10) nM filter for the microplate reader</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anaerobic culture vial (balch tubes) + rubber stoppers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Modified for anaerobic culture tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MA-3000 (mercury analyzer)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH probe</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any pH probe will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical sterile polypropylene centrifuge tubes.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m polyethersulfone syringe filter + syringe</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile/clean glass bottles</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For growth media and standards</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile/clean plastic or PTFE bottles</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For alkali solutions (NaOH/KOH)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents powders: Na2MoO4, Na2SeO4, H3BO3, NaOH, KOH, MnSO4, ZnSO4, CoCl2, NiCl2, ampicillin sodium salt, Difco M9 Minimal Salts, Glucose, MgSO4, Thiamine HCl, NaNO3, l-leucine, l-isoleucine valine, EDTA sodium salt, FeSO4, Sodium Beta-Gylcerophosphate, Mops free acid, (NH4)2SO4, Hg(NO3)2, CdCl2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Milli-Q water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Autoclaved or filter sterilized is fine.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysogeny Broth</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical grade H2SO4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an anaerobic biosensor assay for the detection of mercury and cadmium

Civa (Hg) bioavailability mikroplar için toksik Hg biomagnification gıda ağları içinde önemli bir adımdır. Kadmiyum (Cd) dönüşümleri ve bioavailability bakteri için başlıca bir gıda bitkileri birikir tutarı kontrol eder. Bu metallerin bioavailability onların türleşme çözüm, ama nerede Hg toksik monomethylmercury (MeHg) metillenmiş ve Cd içinde rizosferde devam ederse daha özellikle anoksik koşullar altında bağlıdır. Ne zaman bir metal sitozol girer ve bu nedenle metal bioavailability değerlendirmek için yararlı araçlar bütün hücreli mikrobiyal biyosensörler ölçülebilir bir sinyal ver. Ne yazık ki, çoğu biosensing çabaları-defa var kısıtlı-oksijen yokluğu işlevine varolan muhabir proteinlerin sınırlı yeteneği nedeniyle oxic ortamlara. Bu çalışmada, anaerobik metaller anoksik koşul altında yarı gerçek zamanlı olarak hem de saat içinde tespit edebilen geliştirmek ve işleyişi yetenekli bir bütün-hücre biyoalgılayıcı tahlil optimize bizim çaba tanıtacağız. Biz nasıl biyoalgılayıcı nasıl kimyasal değişkenleri çevre metaller etkiler onların bioavailability Bisiklete binme için ilgili değerlendirmek yardımcı olabilir açıklar. Yöntemleri (1) Hg hazırlamak için aşağıdaki iletişim kuralı içerir ve Cd standartlar anoksik şartlarda, (2) oksijen, (3) tasarım yokluğunda biyoalgılayıcı hazırlamak ve değişken bir dizi Hg veya Cd bioavailability ve (4) nasıl etkilediğini belirlemek için bir deneme yürütmek ölçmek ve biyoalgılayıcı verileri yorumlamak için. Biyosensörler doğrusal aralıklarını göstermek ve yöntemin metal bioavailability ve toksisite metal-indüklenebilir ve kurucu suşları kullanarak ayırt yeteneği gösteren örnekler sağlar.

Floresans doruklarına adım 5.3 göre sayısal sonra floresans zirvesinin sonuç bu değişken Hg veya Cd göreli bioavailability etkilemesi gösteren değişken konsantrasyon göre Grafiği çizilecek. Örneğin, Şekil 2 [HgII] üzerinde floresans kalibrasyon eğrisi Şekil 3Aiçinde sunulan indüklenebilir veri verecektir. HgII için kalibrasyon, eğri her zaman içeren 3 bileşenleri için Hg-indüklenebilir zorlanma; bir eşik yanıt yaklaşık 1-2 nM HgII floresans sinyal üretim önce [Hg içinII], doğrusal olarak orantılıdır doğrusal Aralık nerede 5 nM HgII güvenilir her zaman aralığını ve bir plato ortasında olacak nerede [HgII] artan artık floresans sinyali artacaktır. Herhangi bir değişiklik sinyali üretimine bünye zorlanma toksisite [HgII] üzerinden sinyal üretim etkilemez gösterir. Şekil 3BII CD için her zaman 2 bileşenleri indüklenebilir zorlanma için vardır; bir doğrusal Aralık nerede 200-300 nM CdII güvenilir her zaman doğrusal Aralık ve bir plato Merkezi'nde olacak. [CdII] artan ile floresan sinyal bir düşüş daha yüksek Cd konsantrasyonları hücrelere zehirlidir ve indüklenebilir floresans üretim azalma 1000 nM CdIIPlato sonra açıklayabilir gösterir. Bu nedenle, Hg veya Cd bioavailability ile ilgili bir çevre değişkeni sınarken, biz kullanmanızı öneririz 5 nM Hg içinII ve 300 nM Cd içinII.
Bazı durumlarda, sinyal üretim düzgün Hg veya Cd bioavailability bağlanabilir, ancak diğer durumlarda, sinyal üretim varyasyon biyoalgılayıcı hücre ana fizyolojik devlet etkilenebilir (Örneğin, faiz metalden veya çevre koşulları test zehirlidir). Şekil 4A, 5 nM Hg bioavailability Zn bir degrade üzerinde test edildi (0-10 µM). Hem Hg-indüklenebilir ve kurucu suşları, Zn konsantrasyonları artan sinyal benzer bir azalma vardır. Sinyal indirdi bioavailability sonuçları veya Zn toksisite bir sonucudur bu nedenle, bir ayrım olamaz. Şekil 4B ve 4 C, 5nM Hg bioavailability Mg bir degrade üzerinde test edildiII (0-10 mM) ve MnII (0-10 µM). Mg artanII ve MnII konsantrasyonları indüklenebilir zorlanma floresans sinyalinin azalmıştır. Öte yandan, bünye zorlanma floresans Mg artan bir düşüş görünmedi (MgII ve MnII FbFp üretiminde hücreler için yararlı tarafından gösterildiğiII ve MnII konsantrasyonları bir artış floresans sinyal). Bu hücrelerin uygun olmasına ve Hg-indüklenebilir zorlanma floresans azalma Hg bioavailability bir düşüş kaynaklanır gösterir. Da bünye ölçümleri genel hücre sağlık sağlamak tüm biyoalgılayıcı deneyleri için ne kadar önemli olduğunu bu verileri vurgular.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58324/58324fig3.jpg"> Şekil 3: doğrusal aralıkları ile civa ve kadmiyum biyoalgılayıcı. Maksimum floresans ölçülen göreli floresans birimleri (RFU) ± 1 standart sapma E. coli NEB5α tarafından yayılan pUC57merR-s (Hg-indüklenebilir) ve pUC19Balch-s (Constitutive) ilavesi ile yataklık A) HgII (0-15 nM) ve B) CdII (0-1000 nM) anaerobik koşullarda. Floresan 3 Teknik ortalamasını 37 ˚C çoğaltır yapıldı. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58324/58324fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58324/58324fig4.jpg"> Şekil 4: örnek sonuçsuz bir sonuç ile çinko ve magnezyum ve mangan ile kesin sonuç. Maksimum floresans ölçülen göreli floresans birimleri (RFU) ± 1 standart sapma E. coli NEB5α tarafından yayılan pUC57merR-s (Hg-indüklenebilir) ve pUC19Balch-s (Constitutive) ilavesi ile yataklık A) ZnII (0-10 µM) B) MgII (0-10 mM), ve C) MnII (0-10 µM) anaerobik koşullarda. [HgII] 5'e ayarlandığı tüm tedaviler ve floresan nM 3 Teknik çoğaltır, 37 ˚C ortalamasını yapıldı. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58324/58324fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about An Anaerobic Biosensor Assay for the Detection of Mercury and Cadmium at JoVE.com

An Anaerobic Biosensor Assay for the Detection of Mercury and Cadmium

Burada, bir anaerobik bütün hücreli mikrobiyal biyoalgılayıcı ne kadar farklı çevresel değişkenler değerlendirmek için kullanılacak iletişim kuralı mevcut Hg ve Cd bioavailability bakteri anoksik ortamlarda için etkiler.

Bir anaerobik biyoalgılayıcı tahlil civa ve kadmiyum tespiti için

Mercury (Hg) bioavailability to microbes is a key step to toxic Hg biomagnification in food webs. Cadmium (Cd) transformations and bioavailability to ...

Bu yöntem, farklı çevresel değişkenlerin bakterilere karşı biyoyararlanımlarını nasıl etkilediği gibi kadmiyum ve cıvanın biyojeokimyasal döngüsü ile ilgili anahtar soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, oksijen varlığıne bakılmaksızın yarı gerçek zamanlı biyoyararlanım verileri ve canlı hücreler sunabilmesidir. Genellikle bu yönteme yeni yeni bireyler detay çok titiz dikkat gerektiren birçok zaman hassas adımlar vardır çünkü mücadele edecek.Prosedürü gösteren Ben, benim laboratuvardan bir yüksek lisans öğrencisi olacaktır. Teşp için hazırlamak için, cıva indüklenir biyosensör ve eksi 80 derece santigrat kriyo stok tan constitutively ifade biyosensör almak. Hücreleri mililitre de 120 mikrogram ampisilin içeren Lysogeny suyu tabaklarına yerleştirin.Bir gecede 37 santigrat derece bir kuvözde plaka kültürleri büyümek. 4:30 ve 5 p.m. ampicillin ile LB on mililitre bir kültür aşılamak ve 220 rpm sallayarak 37 derece santigrat gecede büyümek.Sabah saat 09:00 ile .m arasında kültürü ve daha önceden hazırlanmış büyüme ortamını anaerobik odaya getirir. Sonra steril bir balch tüp içine ampisilin mililitre başına taze büyüme orta ve 210 mikrogram sekiz mililitre ekleyin.Şimdi bir gecede yetiştirilen kültür iki mililitre toplamak ve iki mililitre mikro santrifüj tüp içine transfer. 90 saniye boyunca 10,000 RCF'de santrifüj yaptıktan sonra, süpernatant'ı çıkarın ve iki mililitre taze büyüme ortamında yeniden askıya alın. Sonra taze büyüme orta ve ampisilin sekiz mililitre içeren balch tüp resuspended kültürü ekleyin.Steril tekniği kullanarak, anaerobik odadan çıkarmadan önce balch tüpüne kauçuk bir durdurucu yerleştirin. Sonra bir kuvöz içine tüp yerleştirin ve 220 rpm sallayarak 37 santigrat derece de anaerobically büyümek. Üç ile beş p.m arasında.kültür, yeni bir steril balch tüp ve anaerobik odaya büyüme orta ile balch tüp getirmek. Steril balch tüpünde ampisilin ile taze büyüme ortamı 10 mililitre kültür 100 mikrolitre ekleyin. Steril tekniği kullanarak, balch tüpüne dikkatlice kauçuk bir durdurucu yerleştirin.220 rpm sallayarak 37 santigrat derece gecede büyümeden önce anaerobik odasından tüp çıkarın. Ertesi gün saat 9ile .m arasında, kültürü ve büyüme ortamını anaerobik odaya geri aktarın.Yine steril bir balch tüp içine büyüme orta ve ampisilin sekiz mililitre ekleyin. Bir gecede yetiştirilen kültürün iki mililitresini iki mililitrelik mikro santrifüj tüpüne aktarın. Daha önce olduğu gibi santrifüj sonrasında, supernatant kaldırmak ve taze büyüme orta iki mililitre hücreleri yeniden askıya.Sonra taze büyüme orta ve ampisilin içeren balch tüp resuspended kültür ekleyin. Steril tekniği kullanarak, balch tüpüne dikkatlice kauçuk bir durdurucu yerleştirin. Odadan çıkarın ve 220 rpm sallayarak 37 santigrat derecede anaerobically büyümek.Kültürü girdap layarak ve ardından 600 nanometre veya OD600 optik yoğunluğunu ölçerek kültürün büyümesini bir spektrofotometre kullanarak izleyin. Beklenen büyüme üç ila dört saat sonra, kültür 6 OD600 ulaşmalıdır. Şimdi anaerobik odasında tüp getirmek ve iki mililitre mikro santrifüj tüpler içine kültür aktarın.Önce olduğu gibi santrifüjü takiben supernatant çıkarın ve taze pozlama orta iki mililitre her hücre damak resuspend. Büyüme ortamının herhangi bir izini kaldırmak için bu yıkama adımını bir kez tekrarlayın. Şimdi yedi mililitrePTFE standart şişe içine hücre kültürünün her iki mikro santrifüj tüpleri birleştirmek maruz kalma analizi nde kullanılmak üzere biyosensör stok elde etmek.Deneye başlamadan önce anaerobik odada oksijen olmadığından emin olmak için anaerobik monitörü kontrol edin. Plaka düzenini 96 kuyu şablonuna göre tasarlayın. Üç teknik kopyaları deneyler çalıştırmak için bu en iyi şişeleri kurmak için dört tarafından sekiz ızgara ile temsil edilir 32 farklı tedaviler için izin verecektir.Dört ünü, tsay plakası düzenine göre sekizer ızgaraya göre ayarlayın. Sonra tepsiye yedi mililitre PTFE standart şişeyerleştirin. Şişeler sadece şişenin dışını manipüle ederek ele alınmalıdır.Her bir tedaviye karşılık gelen her şişeye pozlama orta hacmiekleyin. Her şişe için plaka düzenine göre test edilecek kimyasal değişkenin karşılık gelen hacmi ekleyin. Şimdi her şişeye nitrat ekleyin, böylece konsantrasyon 200 mikromolar.Kurucu biyosensör tedavisi boşlukları için bu adımı hariç tinler. Şişelere cıva eklemek için, önce dört ila sekiz mikromolar stok almak ve iyi sallamak. Çözeltiyi ve pozlama ortamını yedi mililitrelik PTFE şişesinde 100 ila 250 nanomolar konsantrasyonuna seyreltin ve çalışan bir cıva çözeltisi yapın.Bu çalışma çözeltisinden, plaka düzenine göre gerekli şişelere cıva ekleyin. Cıva veya kadmiyum ekledikten sonra elle yörüngesel bir hareketle plaka sallamak. Deney, civa veya kadmiyumun çözeltide spekülasyon yapmak için gereken süreye bağlı olarak artık duraklatılmış olabilir.Deney devam ettiğinde, homojenliği sağlamak için yavaşça pipet biyosensör stoku ileri geri. Daha sonra her şişeye 100 mikrolitre biyosensör stoğu ekleyin ve plakayı daha önce olduğu gibi elle sallayın. Plaka okuyucuyu 37 dereceye ısıtın ve her iki nokta 5-5 dakikada bir okuyarak on saat boyunca kinetik bir koşu ayarlayın.Okumalar arasında bir orbital sallayarak. 440 nanometre lik floresan uyarma ve 500 nanometre lik bir emisyon ile floresan ölçümleri almak için koşuyu ayarlayın. Şimdi pipet her PTFE şişeden 200 mikrolitre dört tarafından sekiz ızgara 96 kuyu plaka karşılık gelen kuyular içine.Pipet her 200 mikrolitre aktarmadan önce beş kez ileri geri. Pipet ucunu atmak yerine pipet ucunu PTFE şişesinde bırakarak pipet leme ilerlemesini takip edin. 96 kuyu plakasını plaka okuyucusunun tepsisine yerleştirin.Sonra 96 kuyu plaka kapağı yerleştirin ve tgörünüşe başlayın. Burada zaman bir fonksiyonu olarak düzeltilmiş floresan verileri gösteren temsili sonuçlar vardır. Floresan indüklenir biyosensör cıva artan konsantrasyonları ile gösterilir.Tüm değerler cıva kontrolü için boştur. Floresan zirveleri cıva veya kadmiyum konsantrasyonunun bir fonksiyonu olarak floresan sinyali göstermek için ölçülebilir. Hem indüklenebilir hem de kurucu biyosensörler için, indüklenebilir sensörlerin ortasındaki cıva veya kadmiyum konsantrasyonu değişkenleri test etmek için kullanılmalıdır.Burada çinko ile sonuçsuz bir sonuç örnekleridir. Ve biyosensör için cıva biyoyararlanımı üzerinde magnezyum ve manganez ile kesin bir sonuç. Çinko ile sonuç, çünkü kurucu floresan toksisite gösteren indükilebilir floresan ile çürür.Bu prosedürü çalışırken bu biyosensör kalibre etmek için kullanılacak gibi ya kadmiyum veya cıva konsantrasyonları girmek için hatırlamak önemlidir. Bu prosedürü takiben, belirli cıva veya kadmiyum türlerinin biyoyararlanımlarını nasıl etkilediği gibi ek soruları yanıtlamak için sulu sistemlerin termodinamik modellemesi gibi diğer yöntemler de uygulanabilmektedir. Kadmiyum, cıva ve sülfürik asit gibi güçlü asitlerle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu işlemi gerçekleştirirken kişisel koruyucu ekipman ın takılması gibi önlemlerin her zaman alınması gerektiğini unutmayın.Bu teknik, geliştirilmesinden sonra çevresel mikrobiyoloji alanında araştırmacıların yarı zamanlı anaerobik cıva veya kadmiyum biyoyararlanımı ve genetik olarak çekilebilir mikropları keşfetmelerinin önünü açmıştır.

Research

JoVE Journal

Environment

Evaluation of Integrated Anaerobic Digestion and Hydrothermal Carbonization for Bioenergy Production

Biyoenerji Üretimi Entegre Anaerobik Sindirim ve Hidrotermal karbonizasyon Değerlendirilmesi

Lignocellulosic biomass is one of the most abundant yet underutilized renewable energy resources. Both anaerobic digestion (AD) and hydrothermal ...

Detection of Foodborne Bacterial Pathogens from Individual Filth Flies

Bireysel Filth Sinekler gelen Gıda Kaynaklı Bakteriyel Patojenler Algılama

There is unanimous consensus that insects are important vectors of foodborne pathogens. However, linking insects as vectors of the pathogen causing a ...

Development of Sulfidogenic Sludge from Marine Sediments and Trichloroethylene Reduction in an Upflow Anaerobic Sludge Blanket Reactor

Bir Yukarı Akış Anaerobik Çamur Battaniyesi Reaktörde Deniz tortulları ve Trikloretilen Azaltma gelen Sulfidogenic Çamur Gelişimi

The importance of microbial sulfate reduction relies on the various applications that it offers in environmental biotechnology. Engineered sulfate ...

Spotting Cheetahs: Identifying Individuals by Their Footprints

Onların Footprints&#39;e tarafından belirlenmesi Bireyler: Çitalar Spotting

The cheetah (Acinonyx jubatus) is Africa's most endangered large felid and listed as Vulnerable with a declining population trend by the IUCN1. It ranges ...

Experimental Column Setup for Studying Anaerobic Biogeochemical Interactions Between Iron (Oxy)Hydroxides, Trace Elements, and Bacteria

Experimental Column Setup for Studying Anaerobic Biogeochemical Interactions Between Iron OxyHydroxides, Trace Elements, and Bacteria

Demir (oksi) hidroksit, eser elementler ve bakteri anaerobik biyojeokimyasal Hofstede çalışmak için deneysel sütun Kur

Fate and speciation of trace elements (TEs), such as arsenic (As) and mercury (Hg), in aquifers are closely related to physio-chemical conditions, such as ...

Fluorescent Paper Strips for the Detection of Diesel Adulteration with Smartphone Read-out

Floresan kağıt şeritler dizel katıştırma Smartphone okuma ile tespiti için

Three fluorescent molecular rotors of 4-dimethylamino-4-nitrostilbene (4-DNS) were investigated for their potential use as viscosity probes to indicate ...

A Precise and Autonomous System for the Detection of Insect Emergence Patterns

Böcek ortaya çıkışı desenler tespiti için hassas ve özerk bir sistem

Existing systems to measure insect emergence patterns have limitations; they are only partially automated and are limited in the maximum number of ...

Detection of Tilapia Lake Virus Using Conventional RT-PCR and SYBR Green RT-qPCR

Tilapia Gölü virüs kullanarak geleneksel RT-PCR ve SYBR yeşil RT-qPCR

The aim of this method is to facilitate the fast, sensitive and specific detection of Tilapia Lake Virus (TiLV) in tilapia tissues. This protocol can be ...

An Induction System for Clustered Stomata by Sugar Solution Immersion Treatment in Arabidopsis thaliana Seedlings

An Induction System for Clustered Stomata by Sugar Solution Immersion Treatment in Arabidopsis thaliana Seedlings

Kümelenmiş stoma bantlı şeker çözüm daldırma tedavisinde Arabidopsis thaliana fidan tarafından için bir indüksiyon sistemi

Stomatal movement mediates plant gas exchange, which is essential for photosynthesis and transpiration. Stomatal opening and closing are accomplished by a ...

Cultivation of Green Microalgae in Bubble Column Photobioreactors and an Assay for Neutral Lipids

Kabarcık sütun Photobioreactors ve bir tahlil yeşil mikroalg ekimi için nötr lipitler

There is significant interest in the study of microalgae for engineering applications such as the production of biofuels, high value products, and for the ...