Name: laser-assisted lentiviral gene delivery to mouse fertilized eggs
Uploaded: 2018-11-01T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Laser-assisted Lentiviral Gene Delivery to Mouse Fertilized Eggs at JoVE.com

Denne forskning blev støttet af den murene Research Program af National Institute of Health (NIH), nationale Institute of Environmental Health Sciences (NIEHS). Vi er taknemmelige for Dr. Robert Petrovich og Dr. Jason Williams kritisk læsning af manuskript og nyttige råd. Vi vil også gerne anerkende og takke Dr. Bernd Gloss, Knockout core, Flow flowcytometri facilitet, Fluorescens mikroskopi og Imaging Center og sammenlignende medicin filial faciliteter af NIEHS for deres tekniske bidrag. Vi vil gerne takke Mr. David Goulding fra grenen sammenlignende medicin og Ms. Lois Wyrick af Imaging Center på NIEHS for at forsyne os med billeder og illustrationer.

Alle dyr procedurer og behandlinger anvendes i denne protokol var i overensstemmelse med retningslinjerne NIH/NIEHS dyrs pleje og blev godkendt af dyrs pleje og brug udvalg (ACUC) på NIH/NIEHS, Animal protokol 2010-0004.
1. præparater
<ol><li>Forberede/Køb rekombinant ikke formerings lentiviruses transporterer din gen af interesse. I denne undersøgelse, lentivirus SBI511 udtrykker copepod grøn fluorescerende proteiner (copGFP; forkortet til normal god landbrugspraksis) fra en brudforlæ...

<ol>
	<li>Sakuma, T., Barry, M. A., Ikeda, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentiviral+vectors:+basic+to+translational.">Lentiviral vectors: basic to translational.</a> Biochemical Journal. 443 (3), 603-618 (2012).</li><li>Salmon, P., Trono, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+and+titration+of+lentiviral+vectors.">Production and titration of lentiviral vectors.</a> Current Protocols in Human Genetics. , (2007).</li><li>Lois, C., Hong, E. J., Pease, S., Brown, E. J., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germline+transmission+and+tissue-specific+expression+of+transgenes+delivered+by+lentiviral+vectors.">Germline transmission and tissue-specific expression of transgenes delivered by lentiviral vectors.</a> Science. 295 (5556), 868-872 (2002).</li><li>Filipiak, W. E., Saunders, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+transgenic+rat+production.">Advances in transgenic rat production.</a> Transgenic Research. 15 (6), 673-686 (2006).</li><li>McGrew, M. J., Sherman, A., Lillico, S. G., Taylor, L., Sang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+conservation+between+rodents+and+chicken+of+regulatory+sequences+driving+skeletal+muscle+gene+expression+in+transgenic+chickens.">Functional conservation between rodents and chicken of regulatory sequences driving skeletal muscle gene expression in transgenic chickens.</a> BMC Developmental Biology. 10, 26 (2010).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+transgenic+pigs+mediated+by+pseudotyped+lentivirus+and+sperm.">Production of transgenic pigs mediated by pseudotyped lentivirus and sperm.</a> PLoS One. 7 (4), e35335 (2012).</li><li>Zhang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+quail+production+by+microinjection+of+lentiviral+vector+into+the+early+embryo+blood+vessels.">Transgenic quail production by microinjection of lentiviral vector into the early embryo blood vessels.</a> PLoS One. 7 (12), e50817 (2012).</li><li>Wassarman, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zona+pellucida+glycoproteins.">Zona pellucida glycoproteins.</a> Annul Review of Biochemistry. 57, 415-442 (1988).</li><li>Clift, D., Schuh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Restarting+life:+fertilization+and+the+transition+from+meiosis+to+mitosis.">Restarting life: fertilization and the transition from meiosis to mitosis.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (9), 549-562 (2013).</li><li>Fong, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blastocyst+transfer+after+enzymatic+treatment+of+the+zona+pellucida:+improving+in-vitro+fertilization+and+understanding+implantation.">Blastocyst transfer after enzymatic treatment of the zona pellucida: improving in-vitro fertilization and understanding implantation.</a> Human Reproduction. 13 (10), 2926-2932 (1998).</li><li>Nijs, M., Van Steirteghem, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+different+isolation+procedures+for+blastomeres+from+two-cell+mouse+embryos.">Assessment of different isolation procedures for blastomeres from two-cell mouse embryos.</a> Human Reproduction. 2 (5), 421-424 (1987).</li><li>Ribas, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+zona+pellucida+removal+on+DNA+methylation+in+early+mouse+embryos.">Effect of zona pellucida removal on DNA methylation in early mouse embryos.</a> Biology of Reproduction. 74 (2), 307-313 (2006).</li><li>Gordon, J. W., Scangos, G. A., Plotkin, D. J., Barbosa, J. A., Ruddle, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+transformation+of+mouse+embryos+by+microinjection+of+purified+DNA.">Genetic transformation of mouse embryos by microinjection of purified DNA.</a> Proceedings of National Academy of Science U S A. 77 (12), 7380-7384 (1980).</li><li>Kaneko, T., Sakuma, T., Yamamoto, T., Mashimo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+knockout+by+electroporation+of+engineered+endonucleases+into+intact+rat+embryos.">Simple knockout by electroporation of engineered endonucleases into intact rat embryos.</a> Scientific Reports. 4, 6382 (2014).</li><li>Hosokawa, Y., Ochi, H., Iino, T., Hiraoka, A., Tanaka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoporation+of+biomolecules+into+single+cells+in+living+vertebrate+embryos+induced+by+a+femtosecond+laser+amplifier.">Photoporation of biomolecules into single cells in living vertebrate embryos induced by a femtosecond laser amplifier.</a> PLoS One. 6 (11), e27677 (2011).</li><li>Horii, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+microinjection+methods+for+generating+knockout+mice+by+CRISPR/Cas-mediated+genome+engineering.">Validation of microinjection methods for generating knockout mice by CRISPR/Cas-mediated genome engineering.</a> Scientific Reports. 4, 4513 (2014).</li><li>Hamra, F. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+transgenic+rats+by+lentiviral+transduction+of+male+germ-line+stem+cells.">Production of transgenic rats by lentiviral transduction of male germ-line stem cells.</a> Proceedings of National Academy of Science U S A. 99 (23), 14931-14936 (2002).</li><li>Kanatsu-Shinohara, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+transgenic+rats+via+lentiviral+transduction+and+xenogeneic+transplantation+of+spermatogonial+stem+cells.">Production of transgenic rats via lentiviral transduction and xenogeneic transplantation of spermatogonial stem cells.</a> Biology of Reproduction. 79 (6), 1121-1128 (2008).</li><li>Dann, C. T., Garbers, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+knockdown+rats+by+lentiviral+transduction+of+embryos+with+short+hairpin+RNA+transgenes.">Production of knockdown rats by lentiviral transduction of embryos with short hairpin RNA transgenes.</a> Methods in Molecular Biology. 450, 193-209 (2008).</li><li>Chandrashekran, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+generation+of+transgenic+mice+by+lentivirus-mediated+modification+of+spermatozoa.">Efficient generation of transgenic mice by lentivirus-mediated modification of spermatozoa.</a> FASEB Journal. 28 (2), 569-576 (2014).</li><li>Woods, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser-assisted+in+vitro+fertilization+facilitates+fertilization+of+vitrified-warmed+C57BL/6+mouse+oocytes+with+fresh+and+frozen-thawed+spermatozoa,+producing+live+pups.">Laser-assisted in vitro fertilization facilitates fertilization of vitrified-warmed C57BL/6 mouse oocytes with fresh and frozen-thawed spermatozoa, producing live pups.</a> PLoS One. 9 (3), e91892 (2014).</li><li>Tanaka, N., Takeuchi, T., Neri, Q. V., Sills, E. S., Palermo, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser-assisted+blastocyst+dissection+and+subsequent+cultivation+of+embryonic+stem+cells+in+a+serum/cell+free+culture+system:+applications+and+preliminary+results+in+a+murine+model.">Laser-assisted blastocyst dissection and subsequent cultivation of embryonic stem cells in a serum/cell free culture system: applications and preliminary results in a murine model.</a> Journal of Translational Medicine. 4, 20 (2006).</li><li>Martin, N. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=En+masse+lentiviral+gene+delivery+to+mouse+fertilized+eggs+via+laser+perforation+of+zona+pellucida.">En masse lentiviral gene delivery to mouse fertilized eggs via laser perforation of zona pellucida.</a> Transgenic Research. 27 (1), 39-49 (2018).</li><li>Lawitts, J. A., Biggers, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+of+preimplantation+embryos.">Culture of preimplantation embryos.</a> Methods in Enzymology. 225, 153-164 (1993).</li><li>Stein, P., Schindler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+oocyte+microinjection,+maturation+and+ploidy+assessment.">Mouse oocyte microinjection, maturation and ploidy assessment.</a> Journal of Visualized Experiments. (53), (2011).</li><li>Nagy, A., Gertsenstein, M., Vintersten, K., Behringer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caesarean+section+and+fostering.">Caesarean section and fostering.</a> CSH Protocols. 2006 (2), (2006).</li><li>Chum, P. Y., Haimes, J. D., Andre, C. P., Kuusisto, P. K., Kelley, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genotyping+of+plant+and+animal+samples+without+prior+DNA+purification.">Genotyping of plant and animal samples without prior DNA purification.</a> Journal of Visualized Experiments. (67), (2012).</li><li>Bin Ali, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+pregnancy+and+birth+rates+with+routine+application+of+nonsurgical+embryo+transfer.">Improved pregnancy and birth rates with routine application of nonsurgical embryo transfer.</a> Transgenic Research. 23 (4), 691-695 (2014).</li><li>Liu, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrase-deficient+lentivirus:+opportunities+and+challenges+for+human+gene+therapy.">Integrase-deficient lentivirus: opportunities and challenges for human gene therapy.</a> Current Gene Therapy. 14 (5), 352-364 (2014).</li><li>Sauvain, M. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genotypic+features+of+lentivirus+transgenic+mice.">Genotypic features of lentivirus transgenic mice.</a> Journal of Virology. 82 (14), 7111-7119 (2008).</li></ol>

Lentiviruses evne til at integrere i deres vært genom gør dem en ideel vektor for stabil gen levering. Lentiviral vektorer kan bære op til 8,5 kilobase par (kbp) af genetisk materiale, der kan rumme celle-specifikke eller inducerbar initiativtagerne, markeringen markører eller fluorescerende fraspaltning. Indbygget genomisk materiale kan replikere som en del af deres vært genom og reguleres for at udtrykke eller deaktivere på ønskede tidspunkter. Disse vektorer mulighed for spatiotemporelle kontrol over genekspres...

Denne metode giver detaljerede instruktioner for permeabilizing zona pellucida mus befrugtede æg at gøre embryonale celler tilgængelige til gen levering af lentiviruses. Lentiviruses er designet af naturen for effektiv gen levering til pattedyrsceller. De inficerer delende og ikke-dividere celler og integrere den lentiviral genom i deres vært kromosomer1. Lentiviral vært celleområdet er let udvidet med pseudotyping den rekombinante lentivirus med vesikulær stomatitis-virus glycoprotein (VSV-G), på grund af den brede tropisme VSV-G protein2. Efter transduktion, lentiviral gener er stabilt integreret og udtrykt som en del af deres vært kromosomer skaber et ideelt værktøj til generering af transgene dyr. Hvis leveret til tidlige fase embryonale celler, er det lentiviral genom replikeret og udtrykt i hele organismen. Lentiviral transduktion har ført til produktion af mus, rotter, kylling, vagtel og gris3,4,5,6,7 blandt andre arter af transgenics. Den typiske lentiviral gen levering, dog kræver dygtige teknikere og specialudstyr til at overvinde den zona pellucida barriere, der indkapsler de tidlige fase embryoner. Det overordnede mål med denne metode er at beskrive hvordan man permeabilize zona bruger en laser til at lette lentiviral gen levering.
Pattedyr æg er omgivet af zona pellucida, der hærder efter befrugtning at beskytte de befrugtede æg mod polyspermy og begrænse miljøvekselvirkninger8,9. Zona danner en barriere, der holder lentiviruses væk fra embryonale celler, indtil embryonerne er udklækket som en blastocyst. Kulturperler mus befrugtede æg klækkes efter 4 dage og skal implanteres i pseudopregnant mus før klækning til normale udvikling i hvalpe. Derfor, for transduktion, lentiviruses er microinjected før klækning fra zona i perivitelline hulrum, afstanden mellem zona og embryonale celler.
Zona pellucida er ofte fjernet for in vitro- befrugtning af menneskelige æg til at øge befrugtning af10. Men kemisk fjernelse af musen zona pellucida negativt påvirker mus embryo udvikling og er skadeligt for embryonale celler11,12. Andre metoder til gen levering til musen befrugtede æg overvinde zona pellucida barriere ved direkte mikroinjektion af DNA i cellen kernen13. Pronuclear mikroinjektion er et effektivt middel til at levere gener til embryoner. Da hver embryo er holdt på plads individuelt for mikroinjektion, kan praksis kan være besværlige og tidskrævende for en novice-bruger.
Andre metoder såsom elektroporation og photoporation er nyttige for flygtig og kortvarig gen levering til musen befrugtede æg14,15,16. Disse metoder er flittigt brugt til at levere CRISPR-Cas9 komponenter og recombinases. Dog anvendes ikke elektroporation og photoporation levering af gener effektivt til at oprette transgenics. Sædcellerne, der er indsamlet fra punkteret mus epididymis kan også transduced af lentiviruses og anvendes til in vitro- befrugtning til at producere transgene dyr17,18,19, 20.
I denne protokol lettes lentiviral gen levering til musen embryoner ved permeabilizing zona ved hjælp af en laser. XYClone laser blev udviklet som en hjælp til in vitro- befrugtning21 og dyrkning af embryonale stamceller22. Det er et lille apparat, der er nem at setup og nem at bruge. Når først installeret på et mikroskop, det optager plads i et mål linse og den medfølgende software giver mulighed for sigter laser mens du kigger gennem mikroskop okularer (Se protokollen: afsnit 3). Når zona er perforeret af XYClone laser, kan lentiviruses indføres i Kulturmedier til gen levering23. Flere lentiviruses kan bruges samtidigt levere flere gener for kromosomale indarbejdelse.
Denne protokol vil beskrive hvordan man isolere og kultur mus befrugtede æg, illustrerer brugen af laser for perforering af zona pellucida og demonstrerer transduktion af musen embryonale celler ved lentiviruses.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>CD510B-1 plasmid</td>
			<td>System Biosciences</td>
			<td>CD510B-1</td>
			<td>used to package the lentivirus expressing EF1a-copGFP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethylpolysiloxane</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>DMPS5X</td>
			<td>culturing embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hyaluronidase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3506</td>
			<td>used to remove cumulus cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XYClone Laser</td>
			<td>Hamilton Thorne Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>perforating mouse fertilized eggs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-Surgical Embryo Transfer (NSET) Device</td>
			<td>ParaTechs</td>
			<td>60010</td>
			<td>NSET of embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KSOM medium</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MR-020P-5F</td>
			<td>culturing embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Composition of KSOM:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>mg/100mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>555</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>18.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>4.75</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4 7H2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>4.95</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2 2H2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>210</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>3.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na-Pyruvate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>2.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Lactic Acid, sodium salt</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.174mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10mM EDTA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>100&#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomycin</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>6.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5% phenol red</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.1mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>14.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Essential Amino Acids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-essential AA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.5mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M2 medium</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MR-015-D</td>
			<td>culturing embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Composition of M2:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>mg/100mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>25.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate (anhydrous)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>16.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>35.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate, Monobasic</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>16.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>35</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>553.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin, Bovine Fraction</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na-HEPES</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>54.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol Red</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvic Acid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>3.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Lactic Acid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>295</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

laser-assisted lentiviral gene delivery to mouse fertilized eggs

Lentiviruses er effektive vektorer genet leveres til pattedyrsceller. Efter transduktion, den lentiviral genom er stabilt indarbejdet i host-kromosom og videregives til afkom. De er derfor ideelle vektorer for oprettelsen af stabile cellelinjer, i vivo levering af indikatorer og transduktion af enkelt celle befrugtede æg til at skabe transgene dyr. Men musen befrugtet æg og tidlige fase embryoner er beskyttet af zona pellucida, et glykoprotein matrix, der danner en barriere mod lentiviral gen levering. Lentiviruses er for stort til at trænge ind i zona og leveres typisk ved mikroinjektion af virale partikler i perivitelline hulrum, afstanden mellem zona og embryonale celler. Kravet om, at højt kvalificerede teknikere og specialiseret udstyr har minimeret brugen af lentiviruses til gen levering til musen embryoner. I denne artikel beskrives en protokol for permeabilizing mus befrugtede æg ved perforering af zona med en laser. Laser-perforering medfører ikke nogen skade til embryoner og tillader lentiviruses at få adgang til embryonale celler til gen levering. Transduced embryoner kan udvikle sig til blastocyst in vitro og hvis implanteret i pseudopregnant mus, udvikle sig til transgene unger. Laser bruges i denne protokol er effektiv og nem at bruge. Gener leveret af lentiviruses stabilt indarbejde mus embryonale celler og er kønscelleoverførsel smitsomme. Dette er en alternativ metode til oprettelse af Transgene mus, der kræver ingen micromanipulation og mikroinjektion af befrugtede æg.

Udvikling af isoleret/transduced mus befrugtede æg kan kontrolleres under mikroskop dagligt (figur 1). Sund embryoner udvikler sig til blastocyst inden for 3-4 dage. I denne protokol udvikler 60 – 70% af ubehandlet embryoner sig til blastocyst23. Ud af 114 laser-perforerede transduced embryoner, 54 udviklet i blastocyst (på 47%) og 46 blastocyster udtryk for normal god landbrugspraksis (46/54 = 85%)23.
<...

Watch this Scientific Journal Video about Laser-assisted Lentiviral Gene Delivery to Mouse Fertilized Eggs at JoVE.com

Laser-assisted Lentiviral Gene Delivery to Mouse Fertilized Eggs

Mus befrugtede æg og tidlige fase embryoner er beskyttet af zona pellucida, et glykoprotein matrix, der danner en barriere mod gen levering. I denne artikel beskrives en protokol for perforering af zona med en laser transduce embryonale celler med lentiviral vektorer og skabe Transgene mus.

Laser-assisteret Lentiviral gen levering til musen befrugtede æg

Lentiviruses are efficient vectors for gene delivery to mammalian cells. Following transduction, the lentiviral genome is stably incorporated into the ...

Dette er en alternativ og nem at bruge metode til at levere gener af interesse for befrugtede museæg via laser perforering af zona pellucida og lentiviral genlevering. Laserassisteret perforering af musedonorproceduren kan også finde anvendelse på befrugtede æg af andre arter for at lette indtræden af andre typer vira eller transinfektionsreagenser. Den største fordel ved denne teknik er, at det ikke kræver specialiserede færdigheder til mikromanipulation og mikro injektion af de befrugtede museæg.Demonstration befrugtede mus æg isolation procedure vil være Page Myers, en forsker fra Comparative Medicine filial på NIEHS. 16 til 24 timer efter parring, isolere æggestokke og æggange fra hunmus med vaginal stik, i henhold til standard protokoller. Når alle væv er blevet indsamlet, rive ampulla af hver æggestær fra hinanden, og frigive de befrugtede æg, omgivet af cumulous celler, og overføre æg i cumulous celler til en 35 millimeter fad, der indeholder en x hyaluronidase i frisk M2 medium, for en tre til fem minutters inkubation ved stuetemperatur.Pipette æggene et par gange for at frigive de cumulous celler, og overføre æggene til en ny 35 millimeter skål indeholdende M2 medium, med pipettering til at vaske enzymet. Dernæst overføre de vaskede æg i en 35 millimeter skål, der indeholder kalium simpleks optimeret medium, eller KSOM, og pipette til at vaske de resterende M2 medium og hyaluronidase. Derefter overføre æggene til 35 millimeter væv-kultur behandlede plader seedet med 50 mikroliter af KSOM og to milliliter dimethylpolysiloxan for en to timers jævnslyndring ved 37 grader Celsius, 5% kuldioxid og ilt, og 90% kvælstof.Mens æggene er i inkubatoren, oprette og kalibrere XYClone laser, i henhold til producentens anbefalinger. Når æggene er klar, skal du placere den første dråbeplade på lasermikroskopet fase, og manuelt fokusere zona pellucida. Efter bekræftelse af, at laser LED-lys er synlig gennem målet, skal du flytte mikroskop fase til at målrette zona med LED laser, og bruge computersoftware til at indstille XYClone laser til 250 mikrosekunder.Juster LED-lysstørrelsen til de relevante dimensioner, og perforeret zona pellucida af hvert æg tre gange med laseren til at producere tre 10-mikrometer huller. Det er afgørende at udføre perforering hurtigt, men omhyggeligt, da de befrugtede æg ikke kan holde uden for rugemaskinen i længere end 15 minutter. Derefter returneres de perforerede æg til rugemaskinen i yderligere to timer.Ved afslutningen af den anden inkubation behandles 50 mikroliterKSOM-dråben med to mikroliter koncentreret lentivirus uden blanding. Og returnere æggene til kuvøsen i fire dage. Når æggene har udviklet sig til blastocyster, skal du bruge en ikke-kirurgisk embryooverførselsenhed til at deponere ca. 10-15 embryoner i omkring to mikroliter af KSOM.17 dage efter overførslen af fosteret skal den gravide mus føde naturligt eller indsamle nyfødte ved kejsersnit efter behov. Derefter indsamle væv fra hvalpene til genotyping, at bestemme hastigheden af transgenese. Isoleret og transduced mus-befrugtet æg udvikling kan kontrolleres under mikroskopet dagligt.60 til 70% af sunde, ubehandlede embryoner udvikle sig til blastocyster inden for tre til fire dage. Mens omkring 47% af laser-perforeret, transduced embryoner udvikle sig til blastocyster, 85%, som udtrykker den tranduced gen af interesse. Sigter laseren til at tynde zona, i stedet for at skabe et hul, gør det muligt for udviklingslandene embryoner til at drage fordel af en intakt, indkapslet zona pellucida mens de resterende eftergivende til lentiviral transduktion.Transduktion med en rekombinant lentivirus, der udtrykker vandlob GFP fra en forlængelsesfaktor 1A promotor inducerer flere lentivirale integrationer, og et højt udtryk for GFP under en blå LED-lampe. Mens du forsøger denne procedure, er det vigtigt at huske, at mens evne lentivirus til at integrere i værten genom gør dem til et kraftfuldt værktøj til stabil genlevering, men tilfældig integration kan også indføre indsættelsesmutationer. Denne teknik kan gøre det muligt for forskere inden for genetik hurtigt at udvikle transgene dyremodeller til undersøgelse af sygdom til in vivo-proteinproduktion eller til funktionelle genundersøgelser.Efter denne procedure kan andre metoder som immunohistochemistry udføres på isolerede vævsprøver fra transucucerede unger for at besvare yderligere spørgsmål om placeringen og omfanget af genekspression i forskellige væv af interesse. Glem ikke, at arbejde med lentivirus kan være yderst farligt. Følg derfor dine institutionelle retningslinjer for arbejde med lentivirus.Bær personligt beskyttelsestøj, og dekontaminere alt affald før bortskaffelse.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Genetics

Viruses

SCIENTISTS IN ACTION

Windowing Chicken Eggs for Developmental Studies

The study of development has been greatly aided by the use of the chick embryo as an experimental model.  The ease of accessibility of the embryo has ...

Obtaining Eggs from Xenopus laevis Females

The eggs of Xenopus laevis intact, lysed, and/or fractionated are useful for a wide variety of experiments. This protocol shows how to induce egg laying, ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models.  This paper describes the development of an orthotopic mouse model ...

Isolation and Culture of Cells from the Nephrogenic Zone of the Embryonic Mouse Kidney

Embryonic development of the kidney has been extensively studied both as a model for epithelial-mesenchymal interaction in organogenesis and  to gain ...

Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides

Brug SecM Arrest Sequence som et redskab til at isolere ribo bundne polypeptider

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway ...

Intraductal Injection for Localized Drug Delivery to the Mouse Mammary Gland

Intraductal Injection til Lokaliseret Drug Delivery til Mouse mælkekirtlerne

Herein we describe a protocol to deliver various reagents to the mouse mammary gland via intraductal injections. Localized drug delivery and knock-down of ...

Transient Expression of Proteins by Hydrodynamic Gene Delivery in Mice

Forbigående ekspression af proteiner ved Hydrodynamisk Gene Delivery i mus

Efficient expression of transgenes in vivo is of critical importance in studying gene function and developing treatments for diseases. Over the past ...

Phage-mediated Delivery of Targeted sRNA Constructs to Knock Down Gene Expression in E. coli

Phage-mediated Delivery of Targeted sRNA Constructs to Knock Down Gene Expression in E. coli

Fag-medieret Levering af målrettet Srna Konstruerer til Knock Down genekspression i<em&gt; E. coli</em

RNA-mediated knockdowns are widely used to control gene expression. This versatile family of techniques makes use of short RNA (sRNA) that can be ...

Laser-assisted Microdissection (LAM) as a Tool for Transcriptional Profiling of Individual Cell Types

Laser-assisted Microdissection LAM as a Tool for Transcriptional Profiling of Individual Cell Types

Laser-assisteret mikrodissektion (LAM) som værktøj for transskriptionsprofilering af enkelte celle Typer

The understanding of developmental processes at the molecular level requires insights into transcriptional regulation, and thus the transcriptome, at the ...