Name: laser-assisted lentiviral gene delivery to mouse fertilized eggs
Uploaded: 2018-11-01T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Laser-assisted Lentiviral Gene Delivery to Mouse Fertilized Eggs at JoVE.com

Dit onderzoek werd gesteund door de intramurale programma van het onderzoek van het National Institute of Health (NIH), National Institute of Environmental Health Sciences (NIEHS). Wij zijn dankbaar aan Dr Robert Petrovich en Dr. Jason Williams voor de kritische lezing van het manuscript en nuttig advies. Wij wil ook erkennen en Dr. Bernd Gloss, de Knockout kern, de Stroom Cytometry faciliteit, de fluorescentie microscopie en Imaging Center, en de faciliteiten van de vergelijkende tak van de geneeskunde van de NIEHS voor hun technische bijdrage bedanken. We zouden graag bedank Mr. David Goulding van de vergelijkende tak van de geneeskunde en Ms. Lois Wyrick van het Imaging Center op de NIEHS voor ons te voorzien van foto's en illustraties.

Alle dierlijke procedures en behandelingen in dit protocol gebruikt werden in overeenstemming met de richtsnoeren van de dierenverzorgers NIH/NIEHS en werden goedgekeurd door de zorg van het dier en gebruik Comité (ACUC) op de NIH/NIEHS, dier Protocol 2010-0004.
1. voorbereiding
<ol><li>Bereiden/aankoop van recombinante niet-teeltmateriaal lentivirussen uitvoering van uw gen van belang. In deze studie, lentivirus SBI511 uiten eenoogkreeftjes groen fluorescent proteïne (copGFP; afgekort tot...

<ol>
	<li>Sakuma, T., Barry, M. A., Ikeda, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentiviral+vectors:+basic+to+translational.">Lentiviral vectors: basic to translational.</a> Biochemical Journal. 443 (3), 603-618 (2012).</li><li>Salmon, P., Trono, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+and+titration+of+lentiviral+vectors.">Production and titration of lentiviral vectors.</a> Current Protocols in Human Genetics. , (2007).</li><li>Lois, C., Hong, E. J., Pease, S., Brown, E. J., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germline+transmission+and+tissue-specific+expression+of+transgenes+delivered+by+lentiviral+vectors.">Germline transmission and tissue-specific expression of transgenes delivered by lentiviral vectors.</a> Science. 295 (5556), 868-872 (2002).</li><li>Filipiak, W. E., Saunders, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+transgenic+rat+production.">Advances in transgenic rat production.</a> Transgenic Research. 15 (6), 673-686 (2006).</li><li>McGrew, M. J., Sherman, A., Lillico, S. G., Taylor, L., Sang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+conservation+between+rodents+and+chicken+of+regulatory+sequences+driving+skeletal+muscle+gene+expression+in+transgenic+chickens.">Functional conservation between rodents and chicken of regulatory sequences driving skeletal muscle gene expression in transgenic chickens.</a> BMC Developmental Biology. 10, 26 (2010).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+transgenic+pigs+mediated+by+pseudotyped+lentivirus+and+sperm.">Production of transgenic pigs mediated by pseudotyped lentivirus and sperm.</a> PLoS One. 7 (4), e35335 (2012).</li><li>Zhang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+quail+production+by+microinjection+of+lentiviral+vector+into+the+early+embryo+blood+vessels.">Transgenic quail production by microinjection of lentiviral vector into the early embryo blood vessels.</a> PLoS One. 7 (12), e50817 (2012).</li><li>Wassarman, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zona+pellucida+glycoproteins.">Zona pellucida glycoproteins.</a> Annul Review of Biochemistry. 57, 415-442 (1988).</li><li>Clift, D., Schuh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Restarting+life:+fertilization+and+the+transition+from+meiosis+to+mitosis.">Restarting life: fertilization and the transition from meiosis to mitosis.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (9), 549-562 (2013).</li><li>Fong, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blastocyst+transfer+after+enzymatic+treatment+of+the+zona+pellucida:+improving+in-vitro+fertilization+and+understanding+implantation.">Blastocyst transfer after enzymatic treatment of the zona pellucida: improving in-vitro fertilization and understanding implantation.</a> Human Reproduction. 13 (10), 2926-2932 (1998).</li><li>Nijs, M., Van Steirteghem, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+different+isolation+procedures+for+blastomeres+from+two-cell+mouse+embryos.">Assessment of different isolation procedures for blastomeres from two-cell mouse embryos.</a> Human Reproduction. 2 (5), 421-424 (1987).</li><li>Ribas, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+zona+pellucida+removal+on+DNA+methylation+in+early+mouse+embryos.">Effect of zona pellucida removal on DNA methylation in early mouse embryos.</a> Biology of Reproduction. 74 (2), 307-313 (2006).</li><li>Gordon, J. W., Scangos, G. A., Plotkin, D. J., Barbosa, J. A., Ruddle, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+transformation+of+mouse+embryos+by+microinjection+of+purified+DNA.">Genetic transformation of mouse embryos by microinjection of purified DNA.</a> Proceedings of National Academy of Science U S A. 77 (12), 7380-7384 (1980).</li><li>Kaneko, T., Sakuma, T., Yamamoto, T., Mashimo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+knockout+by+electroporation+of+engineered+endonucleases+into+intact+rat+embryos.">Simple knockout by electroporation of engineered endonucleases into intact rat embryos.</a> Scientific Reports. 4, 6382 (2014).</li><li>Hosokawa, Y., Ochi, H., Iino, T., Hiraoka, A., Tanaka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoporation+of+biomolecules+into+single+cells+in+living+vertebrate+embryos+induced+by+a+femtosecond+laser+amplifier.">Photoporation of biomolecules into single cells in living vertebrate embryos induced by a femtosecond laser amplifier.</a> PLoS One. 6 (11), e27677 (2011).</li><li>Horii, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+microinjection+methods+for+generating+knockout+mice+by+CRISPR/Cas-mediated+genome+engineering.">Validation of microinjection methods for generating knockout mice by CRISPR/Cas-mediated genome engineering.</a> Scientific Reports. 4, 4513 (2014).</li><li>Hamra, F. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+transgenic+rats+by+lentiviral+transduction+of+male+germ-line+stem+cells.">Production of transgenic rats by lentiviral transduction of male germ-line stem cells.</a> Proceedings of National Academy of Science U S A. 99 (23), 14931-14936 (2002).</li><li>Kanatsu-Shinohara, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+transgenic+rats+via+lentiviral+transduction+and+xenogeneic+transplantation+of+spermatogonial+stem+cells.">Production of transgenic rats via lentiviral transduction and xenogeneic transplantation of spermatogonial stem cells.</a> Biology of Reproduction. 79 (6), 1121-1128 (2008).</li><li>Dann, C. T., Garbers, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+knockdown+rats+by+lentiviral+transduction+of+embryos+with+short+hairpin+RNA+transgenes.">Production of knockdown rats by lentiviral transduction of embryos with short hairpin RNA transgenes.</a> Methods in Molecular Biology. 450, 193-209 (2008).</li><li>Chandrashekran, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+generation+of+transgenic+mice+by+lentivirus-mediated+modification+of+spermatozoa.">Efficient generation of transgenic mice by lentivirus-mediated modification of spermatozoa.</a> FASEB Journal. 28 (2), 569-576 (2014).</li><li>Woods, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser-assisted+in+vitro+fertilization+facilitates+fertilization+of+vitrified-warmed+C57BL/6+mouse+oocytes+with+fresh+and+frozen-thawed+spermatozoa,+producing+live+pups.">Laser-assisted in vitro fertilization facilitates fertilization of vitrified-warmed C57BL/6 mouse oocytes with fresh and frozen-thawed spermatozoa, producing live pups.</a> PLoS One. 9 (3), e91892 (2014).</li><li>Tanaka, N., Takeuchi, T., Neri, Q. V., Sills, E. S., Palermo, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser-assisted+blastocyst+dissection+and+subsequent+cultivation+of+embryonic+stem+cells+in+a+serum/cell+free+culture+system:+applications+and+preliminary+results+in+a+murine+model.">Laser-assisted blastocyst dissection and subsequent cultivation of embryonic stem cells in a serum/cell free culture system: applications and preliminary results in a murine model.</a> Journal of Translational Medicine. 4, 20 (2006).</li><li>Martin, N. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=En+masse+lentiviral+gene+delivery+to+mouse+fertilized+eggs+via+laser+perforation+of+zona+pellucida.">En masse lentiviral gene delivery to mouse fertilized eggs via laser perforation of zona pellucida.</a> Transgenic Research. 27 (1), 39-49 (2018).</li><li>Lawitts, J. A., Biggers, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+of+preimplantation+embryos.">Culture of preimplantation embryos.</a> Methods in Enzymology. 225, 153-164 (1993).</li><li>Stein, P., Schindler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+oocyte+microinjection,+maturation+and+ploidy+assessment.">Mouse oocyte microinjection, maturation and ploidy assessment.</a> Journal of Visualized Experiments. (53), (2011).</li><li>Nagy, A., Gertsenstein, M., Vintersten, K., Behringer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caesarean+section+and+fostering.">Caesarean section and fostering.</a> CSH Protocols. 2006 (2), (2006).</li><li>Chum, P. Y., Haimes, J. D., Andre, C. P., Kuusisto, P. K., Kelley, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genotyping+of+plant+and+animal+samples+without+prior+DNA+purification.">Genotyping of plant and animal samples without prior DNA purification.</a> Journal of Visualized Experiments. (67), (2012).</li><li>Bin Ali, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+pregnancy+and+birth+rates+with+routine+application+of+nonsurgical+embryo+transfer.">Improved pregnancy and birth rates with routine application of nonsurgical embryo transfer.</a> Transgenic Research. 23 (4), 691-695 (2014).</li><li>Liu, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrase-deficient+lentivirus:+opportunities+and+challenges+for+human+gene+therapy.">Integrase-deficient lentivirus: opportunities and challenges for human gene therapy.</a> Current Gene Therapy. 14 (5), 352-364 (2014).</li><li>Sauvain, M. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genotypic+features+of+lentivirus+transgenic+mice.">Genotypic features of lentivirus transgenic mice.</a> Journal of Virology. 82 (14), 7111-7119 (2008).</li></ol>

Het vermogen van de lentivirussen te integreren in hun genoom host maakt hen een ideale vector voor stabiele gene levering. Lentivirale vectoren kunnen maximaal 8,5 kilobase paar (kbp) van genetisch materiaal die geschikt is voor cel-specifieke of afleidbare initiatiefnemers, selectie markeringen of fluorescerende wordt. Opgenomen genomische materiaal kan repliceren als onderdeel van hun gastheer genoom en express te deactiveren op gewenste tijdstippen worden geregeld. Deze vectoren kunnen Spatio controle over genexpress...

Deze methode biedt gedetailleerde instructies voor het permeabilizing van de zona zitten van muis bevruchte eieren embryonale cellen om toegankelijk te maken voor levering van het gen van lentivirussen. Lentivirussen zijn ontworpen door de natuur voor efficiënte gene levering aan zoogdiercellen. Ze verdelen en niet-delende cellen infecteren en het lentivirale genoom te integreren in hun host chromosomen1. Het cellenbereik lentivirale host is gemakkelijk uitgebreid door pseudotyping de recombinante lentivirus met de vesiculaire stomatitis virus glycoproteïne (VSV-G), vanwege de brede tropisme van de VSV-G eiwit2. Na signaaltransductie, lentivirale genen zijn stabiel geïntegreerd en uitgedrukt als onderdeel van hun gastheer chromosomen maken een ideaal hulpmiddel voor het genereren van transgene dieren. Geleverd aan de vroege fase embryonale stamcellen, is het lentivirale genoom gerepliceerd als uitgedrukt in het hele organisme. Lentivirale transductie heeft geleid tot de productie van kwartel, muizen, ratten, kip en varken3,4,5,6,7 onder andere soorten van transgenics. De typische methode van levering van de lentivirale gen, vereist echter geschoolde technici en gespecialiseerde apparatuur te overwinnen van de zona zitten barrière die de vroege fase embryo's kapselt. Het algemene doel van deze methode is om te beschrijven hoe permeabilize de zona met behulp van een laser om lentivirale gene steunverlening te vergemakkelijken.
Zoogdieren eieren zijn omringd door de zona zitten die verhardt na bevruchting de bevruchte eieren tegen polyspermy te beschermen en beperken van de milieu-interacties8,9. De zona vormt een barrière die houdt van lentivirussen weg van de embryonale cellen, totdat de embryo's zijn uitgekomen als een blastocyst. Gekweekte muis bevruchte eieren hatch na 4 dagen en pseudopregnant muizen vóór broedeieren voor normale ontwikkeling in pups moet worden ingeplant. Daarom, voor signaaltransductie, lentivirussen zijn microinjected voor broedeieren van de zona in de holte van de perivitelline, de ruimte tussen de zona en de embryonale cellen.
De zona zitten vaak voor in vitro bevruchting van menselijke eicellen te verhogen van de bevruchting tarief10verwijderd. Echter, chemische verwijdering van muis zona zitten nadelig beïnvloedt muis embryo-ontwikkeling en is schadelijk voor de embryonale cellen11,12. Andere methoden voor gene levering aan muis bevruchte eieren overwonnen de barrière van de zona zitten door directe microinjection van DNA in de cel nucleus13. Pronuclear microinjection is een efficiënt middel van het leveren van genen aan embryo's. Aangezien elk embryo wordt gehouden in de plaats individueel voor microinjection, kan de praktijk echter moeizaam en tijdrovend voor een beginnende gebruiker.
Andere methoden zoals electroporation en photoporation zijn nuttig voor van voorbijgaande aard en op korte termijn gene levering aan muis bevruchte eieren14,15,16. Deze methoden worden uitvoerig gebruikt voor het leveren van CRISPR-Cas9 componenten en recombinases. Nochtans, niet electroporation en photoporation levering van genen efficiënt worden gebruikt voor het maken van transgenics. Spermacellen die worden bijeengezocht uit geperforeerde muis bijbal kunnen ook worden getransduceerde door lentivirussen en gebruikt voor in vitro bevruchting voor de productie van transgene dieren17,18,19, 20.
In dit protocol, wordt de levering van de lentivirale gen aan muis embryo's vergemakkelijkt door de zona met behulp van een laser permeabilizing. De laser XYClone werd ontwikkeld als hulpmiddel voor in vitro bevruchting21 en teelt van embryonale stamcellen22. Het is een klein apparaat dat is eenvoudig te installeren en eenvoudig te gebruiken. Eenmaal geïnstalleerd op een Microscoop, maar de ruimte van een objectief neemt en de bijgeleverde software zorgt voor de laser gericht terwijl u door de Microscoop oculairs (Zie Protocol: hoofdstuk 3). Wanneer de zona wordt geperforeerd door de XYClone laser, kunnen lentivirussen worden toegevoegd aan de voedingsbodems voor gene levering23. Meerdere lentivirussen kunnen worden gebruikt om gelijktijdig meerdere genen voor chromosomale inbouw leveren.
Dit protocol beschrijft hoe te isoleren en cultuur muis eieren bevrucht, illustreert het gebruik van laser voor perforatie van de zona zitten en demonstreert de transductie van muis embryonale cellen door lentivirussen.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>CD510B-1 plasmid</td>
			<td>System Biosciences</td>
			<td>CD510B-1</td>
			<td>used to package the lentivirus expressing EF1a-copGFP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethylpolysiloxane</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>DMPS5X</td>
			<td>culturing embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hyaluronidase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3506</td>
			<td>used to remove cumulus cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XYClone Laser</td>
			<td>Hamilton Thorne Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>perforating mouse fertilized eggs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-Surgical Embryo Transfer (NSET) Device</td>
			<td>ParaTechs</td>
			<td>60010</td>
			<td>NSET of embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KSOM medium</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MR-020P-5F</td>
			<td>culturing embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Composition of KSOM:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>mg/100mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>555</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>18.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>4.75</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4 7H2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>4.95</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2 2H2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>210</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>3.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na-Pyruvate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>2.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Lactic Acid, sodium salt</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.174mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10mM EDTA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>100&#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomycin</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>6.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5% phenol red</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.1mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>14.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Essential Amino Acids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-essential AA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.5mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M2 medium</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MR-015-D</td>
			<td>culturing embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Composition of M2:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>mg/100mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>25.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate (anhydrous)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>16.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>35.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate, Monobasic</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>16.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>35</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>553.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin, Bovine Fraction</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na-HEPES</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>54.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol Red</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvic Acid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>3.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Lactic Acid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>295</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

laser-assisted lentiviral gene delivery to mouse fertilized eggs

Lentivirussen zijn efficiënte vectoren voor gene levering aan zoogdiercellen. Na signaaltransductie, het lentivirale genoom stabiel is geïntegreerd in het host-chromosoom en wordt doorgegeven aan het nageslacht. Ze zijn dus ideale vectoren voor schepping van stabiele cellijnen, in vivo levering van indicatoren, en transductie van eencellige bevruchte eieren maken van transgene dieren. Echter muis bevruchte eieren en vroege fase embryo's worden beschermd door de zona zitten, een glycoproteïne-matrix die een barrière tegen lentivirale gene levering vormt. Lentivirussen zijn te groot om door te dringen de zona en worden meestal geleverd door microinjection van virale deeltjes in de holte van de perivitelline, de ruimte tussen de zona en de embryonale cellen. De behoefte aan hoogopgeleide technologen en gespecialiseerde apparatuur heeft het gebruik van lentivirussen voor gene levering aan muis embryo's tot een minimum beperkt. Dit artikel beschrijft een protocol voor het permeabilizing van de muis bevruchte eieren door de zona perforeren met een laser. Laser-perforatie resulteert niet in enige schade aan embryo's en maakt van lentivirussen toegang te krijgen tot embryonale cellen voor gene levering. Getransduceerde embryo's kunnen uitgroeien tot een blastocyst in vitro en als geïmplanteerd in pseudopregnant muizen, uitgroeien tot transgene pups. De laser gebruikt in dit protocol is effectief en makkelijk te gebruiken. Genen geleverd door lentivirussen stabiel integreren van muis embryonale cellen en zijn germline overdraagbare. Dit is een alternatieve methode voor het maken van transgene muizen die geen micromanipulation vereist en microinjection van bevruchte eieren.

Ontwikkeling van geïsoleerd/getransduceerde muis bevruchte eieren kan worden gecontroleerd onder de Microscoop dagelijks (Figuur 1). Gezonde embryo's uitgroeien tot het blastocyst binnen 3-4 dagen. In dit protocol uitgroeien 60-70% van de onbehandelde embryo's tot blastocyst23. Uit 114 laser-geperforeerd getransduceerde embryo's 54 uitgegroeid tot blastocyst (snelheid van 47%) en 46 blastocysten uitgedrukt GFP (46/54 = 85%)<sup class=...

Watch this Scientific Journal Video about Laser-assisted Lentiviral Gene Delivery to Mouse Fertilized Eggs at JoVE.com

Laser-assisted Lentiviral Gene Delivery to Mouse Fertilized Eggs

Muis bevruchte eieren en vroege fase embryo's worden beschermd door de zona zitten, een glycoproteïne-matrix die een barrière tegen levering van het gen vormt. Dit artikel beschrijft een protocol voor de zona perforeren met een laser transduce van embryonale cellen met lentivirale vectoren en maken van transgene muizen.

Laser-assisted lentivirale Gene levering aan muis bevruchte eieren

Lentiviruses are efficient vectors for gene delivery to mammalian cells. Following transduction, the lentiviral genome is stably incorporated into the ...

Dit is een alternatieve en gemakkelijk te gebruiken methode voor het leveren van genen van belang aan bevruchte muizeneieren via laserperforatie van de zona pellucida en lentivirale genlevering. Laser-ondersteunde perforatie van de muisdonorprocedure kan ook van toepassing zijn op de bevruchte eieren van andere soorten om de binnenkomst van andere soorten virussen of transfectiereagentia te vergemakkelijken. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het geen gespecialiseerde vaardigheden vereist voor de micromanipulatie en micro-injectie van de bevruchte muizeneieren.Het aantonen van bevruchte muis ei isolatie procedure zal Worden Page Myers, een onderzoeker van de Comparative Medicine tak aan de NIEHS. 16 tot 24 uur na de paring, isoleren van de eierstokken en eicellen van vrouwelijke muizen met vaginale pluggen, volgens de standaard protocollen. Wanneer alle weefsels zijn verzameld, scheur de ampulla van elke eierstok uit elkaar, en laat de bevruchte eieren, omgeven door cumulatieve cellen, en breng de eieren in cumuleuze cellen naar een 35 millimeter schotel met een x hyaluronidase in verse M2 medium, voor een drie tot vijf minuten incubatie bij kamertemperatuur.Pipette de eieren een paar keer om de cumuleuze cellen vrij te geven, en breng de eieren naar een nieuwe 35 millimeter schotel met M2 medium, met pipet af te wassen van het enzym. Breng vervolgens de gewassen eieren over in een 35 millimeter schotel met kalium simplex geoptimaliseerd medium, of KSOM, en pipet om het resterende M2 medium en hyaluronidase af te wassen. Breng de eieren vervolgens over op 35 millimeter met weefselkweek behandelde platen die zijn gezaaid met 50 microliter KSOM en twee milliliter dimethylpolysiloxaan voor een evenwicht van twee uur bij 37 graden Celsius, 5% kooldioxide en zuurstof en 90% stikstof.Terwijl de eieren in de couveuse, opzetten en kalibreren van de XYClone laser, volgens de aanbevelingen van de fabrikant. Wanneer de eieren klaar zijn, plaats de eerste druppelplaat op de lasermicroscoop stadium, en handmatig richten de zona pellucida. Nadat u hebt bevestigd dat het laser-LED-licht zichtbaar is door het doel, verplaatst u de microscoopfase om de zona met de LED-laser te targeten en de computersoftware te gebruiken om de XYClone-laser in te stellen op 250 microseconden.Pas de LED-lichtmaat aan de juiste afmetingen aan en perforeer de zona pellucida van elk ei drie keer met de laser om drie gaten van 10 micrometer te produceren. Het is van cruciaal belang om de perforatie snel uit te voeren, maar voorzichtig, omdat de bevruchte eieren niet langer dan 15 minuten buiten de couveuse kunnen blijven. Breng de geperforeerde eieren vervolgens nog twee uur terug naar de couveuse.Behandel aan het einde van de tweede incubatie de 50 microliter KSOM-druppel met twee microliter geconcentreerd lentivirus zonder te mengen. En breng de eieren vier dagen terug naar de couveuse. Wanneer de eieren zich hebben ontwikkeld tot blastocysten, gebruik dan een niet-chirurgisch embryo-overdrachtsapparaat, om ongeveer 10-15 embryo's te deponeren in een ongeveer twee microliters van KSOM.17 dagen na de embryo-overdracht, laat de zwangere muis op natuurlijke wijze bevallen of verzamel de pasgeborenen door keizersnede indien nodig. Verzamel vervolgens weefsel van de pups voor genotyperen, om de snelheid van transgenese te bepalen. Geïsoleerde en getransduceerde muisbevruchte ei-ontwikkeling kan dagelijks onder de microscoop worden gecontroleerd.60 tot 70% van de gezonde, onbehandelde embryo's ontwikkelen zich binnen drie tot vier dagen tot blastocysten. Terwijl ongeveer 47% van de laser-geperforeerde, getransduceerde embryo's ontwikkelen tot blastocysten, waarvan 85% uitdrukken van de getranen gen van belang. Met het streven naar de laser om de zona dun, in plaats van het creëren van een gat, kan de zich ontwikkelende embryo's te profiteren van een intacte, inkapseling zona pellucida, terwijl de resterende tolerant voor lentivirale transductie.Transductie met een recombinant lentivirus, uitdrukken copepod GFP van een rekfactor 1A promotor induceert meerdere lentivirale integraties, en een hoge expressie van GFP onder een blauwe LED-lamp. Tijdens het proberen van deze procedure, is het belangrijk om te onthouden dat, terwijl het vermogen van lentivirussen te integreren in de gastheer genoom maakt ze een krachtig instrument voor stabiele genlevering, maar willekeurige integratie kan ook introduceren insertional mutaties. Deze techniek zou onderzoekers op het gebied van genetica in staat kunnen stellen om snel transgene diermodellen te ontwikkelen voor de studie van ziekten voor in vivo eiwitproductie, of voor functionele genstudies.Na deze procedure kunnen andere methoden zoals immunohistochemie worden uitgevoerd op geïsoleerde weefselmonsters van getransduceerde pups om aanvullende vragen te beantwoorden over de locatie en de omvang van genexpressie in verschillende weefsels van belang. Vergeet niet dat het werken met lentivirussen zeer gevaarlijk kan zijn. Volg daarom uw institutionele richtlijnen voor het werken met lentivirussen.Draag persoonlijke beschermende kleding en ontsmet al het afval voorafgaand aan verwijdering.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Genetics

Viruses

SCIENTISTS IN ACTION

Windowing Chicken Eggs for Developmental Studies

Windowing Kip Eieren voor Ontwikkelingsbiologie Studies

The study of development has been greatly aided by the use of the chick embryo as an experimental model.  The ease of accessibility of the embryo has ...

Obtaining Eggs from Xenopus laevis Females

Het verkrijgen van Eieren van Xenopus laevis Teven

The eggs of Xenopus laevis intact, lysed, and/or fractionated are useful for a wide variety of experiments. This protocol shows how to induce egg laying, ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

Met behulp van de Gene Puiser MXcell Elektroporatie systeem om primaire cellen transfecteren met een hoog rendement

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

In vivo beeldvorming en therapeutische behandelingen in een orthotope Muis Model van eierstokkanker

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models.  This paper describes the development of an orthotopic mouse model ...

Isolation and Culture of Cells from the Nephrogenic Zone of the Embryonic Mouse Kidney

Isolatie en Cultuur van Cellen van de nefrogene Zone van de embryonale Mouse Kidney

Embryonic development of the kidney has been extensively studied both as a model for epithelial-mesenchymal interaction in organogenesis and  to gain ...

Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides

Met behulp van SecM Arrestatie sequentie als een Tool om Ribosoom Bound Polypeptiden Isoleer

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway ...

Intraductal Injection for Localized Drug Delivery to the Mouse Mammary Gland

Intraductale Injectie voor Gelokaliseerde Drug Delivery naar de muis borstklier

Herein we describe a protocol to deliver various reagents to the mouse mammary gland via intraductal injections. Localized drug delivery and knock-down of ...

Transient Expression of Proteins by Hydrodynamic Gene Delivery in Mice

Voorbijgaande expressie van eiwitten door Hydrodynamic Gene Levering in Muizen

Efficient expression of transgenes in vivo is of critical importance in studying gene function and developing treatments for diseases. Over the past ...

Phage-mediated Delivery of Targeted sRNA Constructs to Knock Down Gene Expression in E. coli

Phage-mediated Delivery of Targeted sRNA Constructs to Knock Down Gene Expression in E. coli

-Faag gemedieerde Levering van gerichte sRNA Constructen voor het neerslaan van Gene Expression<em&gt; E. coli</em

RNA-mediated knockdowns are widely used to control gene expression. This versatile family of techniques makes use of short RNA (sRNA) that can be ...

Laser-assisted Microdissection (LAM) as a Tool for Transcriptional Profiling of Individual Cell Types

Laser-assisted Microdissection LAM as a Tool for Transcriptional Profiling of Individual Cell Types

Laser-assisted Microdissection (LAM) als een tool voor Transcriptionele Profiling van individuele cel Types

The understanding of developmental processes at the molecular level requires insights into transcriptional regulation, and thus the transcriptome, at the ...