Name: laser-assisted lentiviral gene delivery to mouse fertilized eggs
Uploaded: 2018-11-01T14:30:00
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Cette recherche a été financée par le programme de recherche intra-muros du National Institute of Health (NIH), National Institute of Environmental Health Sciences (NIEHS). Nous sommes reconnaissants à m. Robert Petrovich et le Dr Jason Williams pour une lecture critique du manuscrit et conseils utiles. Nous tenons aussi à remercier Dr. Bernd Gloss, le noyau Knockout, le Flow Cytometry Facility, la microscopie de Fluorescence et centre d’imagerie et les installations de la direction générale de la médecine Comparative du NIEHS pour leurs contributions techniques. Nous tenons à remercier M. David Goulding de la branche de médecine Comparative et Mme Lois Wyrick le centre d’imagerie du NIEHS pour nous avoir fourni les photos et illustrations.

Toutes les procédures animales et les traitements utilisés dans le présent protocole ont été en conformité avec les directives de protection des animaux de NIH/NIEHS et ont été approuvées par la protection des animaux et utilisation Comité (ACUC) au NIH/NIEHS, Animal protocole 2010-0004.
1. les préparatifs
<ol><li>Préparer/achat recombinants non multiplication lentivirus portant votre gène d’intérêt. Dans cette étude, lentivirus SBI511 exprimant la protéine fluorescente ve...

<ol>
	<li>Sakuma, T., Barry, M. A., Ikeda, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentiviral+vectors:+basic+to+translational.">Lentiviral vectors: basic to translational.</a> Biochemical Journal. 443 (3), 603-618 (2012).</li><li>Salmon, P., Trono, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+and+titration+of+lentiviral+vectors.">Production and titration of lentiviral vectors.</a> Current Protocols in Human Genetics. , (2007).</li><li>Lois, C., Hong, E. J., Pease, S., Brown, E. 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Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blastocyst+transfer+after+enzymatic+treatment+of+the+zona+pellucida:+improving+in-vitro+fertilization+and+understanding+implantation.">Blastocyst transfer after enzymatic treatment of the zona pellucida: improving in-vitro fertilization and understanding implantation.</a> Human Reproduction. 13 (10), 2926-2932 (1998).</li><li>Nijs, M., Van Steirteghem, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+different+isolation+procedures+for+blastomeres+from+two-cell+mouse+embryos.">Assessment of different isolation procedures for blastomeres from two-cell mouse embryos.</a> Human Reproduction. 2 (5), 421-424 (1987).</li><li>Ribas, R. 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K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+transgenic+rats+by+lentiviral+transduction+of+male+germ-line+stem+cells.">Production of transgenic rats by lentiviral transduction of male germ-line stem cells.</a> Proceedings of National Academy of Science U S A. 99 (23), 14931-14936 (2002).</li><li>Kanatsu-Shinohara, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+transgenic+rats+via+lentiviral+transduction+and+xenogeneic+transplantation+of+spermatogonial+stem+cells.">Production of transgenic rats via lentiviral transduction and xenogeneic transplantation of spermatogonial stem cells.</a> Biology of Reproduction. 79 (6), 1121-1128 (2008).</li><li>Dann, C. T., Garbers, D. 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E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser-assisted+in+vitro+fertilization+facilitates+fertilization+of+vitrified-warmed+C57BL/6+mouse+oocytes+with+fresh+and+frozen-thawed+spermatozoa,+producing+live+pups.">Laser-assisted in vitro fertilization facilitates fertilization of vitrified-warmed C57BL/6 mouse oocytes with fresh and frozen-thawed spermatozoa, producing live pups.</a> PLoS One. 9 (3), e91892 (2014).</li><li>Tanaka, N., Takeuchi, T., Neri, Q. V., Sills, E. S., Palermo, G. 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A., Biggers, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+of+preimplantation+embryos.">Culture of preimplantation embryos.</a> Methods in Enzymology. 225, 153-164 (1993).</li><li>Stein, P., Schindler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+oocyte+microinjection,+maturation+and+ploidy+assessment.">Mouse oocyte microinjection, maturation and ploidy assessment.</a> Journal of Visualized Experiments. (53), (2011).</li><li>Nagy, A., Gertsenstein, M., Vintersten, K., Behringer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caesarean+section+and+fostering.">Caesarean section and fostering.</a> CSH Protocols. 2006 (2), (2006).</li><li>Chum, P. Y., Haimes, J. D., Andre, C. P., Kuusisto, P. K., Kelley, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genotyping+of+plant+and+animal+samples+without+prior+DNA+purification.">Genotyping of plant and animal samples without prior DNA purification.</a> Journal of Visualized Experiments. (67), (2012).</li><li>Bin Ali, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+pregnancy+and+birth+rates+with+routine+application+of+nonsurgical+embryo+transfer.">Improved pregnancy and birth rates with routine application of nonsurgical embryo transfer.</a> Transgenic Research. 23 (4), 691-695 (2014).</li><li>Liu, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrase-deficient+lentivirus:+opportunities+and+challenges+for+human+gene+therapy.">Integrase-deficient lentivirus: opportunities and challenges for human gene therapy.</a> Current Gene Therapy. 14 (5), 352-364 (2014).</li><li>Sauvain, M. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genotypic+features+of+lentivirus+transgenic+mice.">Genotypic features of lentivirus transgenic mice.</a> Journal of Virology. 82 (14), 7111-7119 (2008).</li></ol>

La capacité des lentivirus à intégrer dans leur génome de l’hôte rend un vecteur idéal pour la livraison de gène stable. Vecteurs LENTIVIRAUX peuvent transporter jusqu'à 8,5 kilobases paire (kbp) du matériel génétique pouvant accueillir les promoteurs spécifiques des cellules ou inductibles, marqueurs de sélection ou moitiés fluorescents. Constituée de matériel génomique peut répliquer dans le cadre de leur génome de l’hôte et réglementé pour exprimer ou désactiver aux moments souhaités. Ces v...

Cette méthode fournit des instructions détaillées pour perméabiliser la zone pellucide des oeufs fécondée de souris pour fabriquer des cellules embryonnaires accessibles pour la livraison de gène de lentivirus. Lentivirus ont été conçues par nature pour la livraison efficace de gène aux cellules de mammifères. Ils infectent les cellules en division et non de division et intègrent le génome des gènes de leur hôte chromosomes1. La plage de cellules de l’hôte des gènes est facilement développée par pseudotypage le lentivirus recombinant avec la glycoprotéine de virus de stomatite vésiculaire (VSV-G), en raison de la large tropisme de la VSV-G protein2. Suite de transduction, les gènes des gènes sont stablement intégrés et exprimées dans le cadre de leurs chromosomes hôtes créant un outil idéal pour la production d’animaux transgéniques. S’il est livré à des cellules embryonnaires au stade précoce, le génome des gènes est reproduit et exprimé dans tout l’organisme. Transduction LENTIVIRAUX a conduit à la production de rat, souris, cailles, poulet et porc3,4,5,6,7 , parmi d’autres espèces d’organismes transgéniques. La méthode typique de la livraison de gène des gènes, toutefois, exige des techniciens qualifiés et un équipement spécialisé pour surmonter la barrière de la zone pellucide qui encapsule les embryons au stade précoce. L’objectif général de cette méthode est de décrire comment permeabilize la zona en utilisant un laser pour faciliter la livraison de gène des gènes.
Des oeufs chez les mammifères sont entourées par la zone pellucide qui durcit après la fertilisation afin de protéger les œufs fécondés contre polyspermie et de limiter les interactions environnementales8,9. Le zona forme une barrière qui empêche les lentivirus loin les cellules embryonnaires jusqu'à ce que les embryons sont éclos comme un blastocyste. Cultivés de souris fécondé les œufs éclosent après 4 jours et doivent être implantés chez des souris pseudopregnant avant l’éclosion pour un développement normal dans les petits. Par conséquent, pour la transduction, lentivirus sont micro avant l’éclosion de la zona dans la cavité périvitellin, l’espace entre le zona et les cellules embryonnaires.
La zone pellucide est souvent supprimée pour fécondation in vitro des ovocytes humains pour augmenter le taux de fécondation10. Cependant, élimination chimique de souris zone pellucide négativement affecte le développement embryonnaire chez la souris et est nocive pour les cellules embryonnaires11,12. Autres méthodes pour la livraison de gène aux oeufs souris fécondée surmonter la barrière de la zone pellucide par microinjection directe de l’ADN dans le noyau de cellule13. Microinjection pronucléaire est un moyen efficace de transporter les gènes dans des embryons. Toutefois, étant donné que chaque embryon est maintenu en place individuellement pour la micro-injection, la pratique peut être laborieux et fastidieux pour un utilisateur novice.
Autres méthodes comme l’électroporation et photoporation sont utiles pour transitoire et à court terme livraison de gène aux souris fécondés oeufs14,15,16. Ces méthodes sont largement utilisés pour livrer les recombinases et composants CRISPR-Cas9. Cependant, électroporation et photoporation livraison de gènes ne peut servir efficacement à créer des organismes transgéniques. Les spermatozoïdes qui proviennent de l’épididyme souris crevé aussi peuvent être transduites par lentivirus et utilisés pour la fécondation in vitro pour produire des animaux transgéniques17,18,19, 20.
Dans ce protocole, la livraison de gène des gènes à des embryons de souris est facilitée par perméabiliser le zona à l’aide d’un laser. Le laser XYClone a été développé pour aider à l’in vitro fertilization21 et de la culture de cellules souches embryonnaires,22. C’est un petit appareil qui est simple à installer et facile à utiliser. Une fois installé sur un microscope, il occupe la place d’une lentille de l’objectif et le logiciel permet pour viser le laser tout en regardant dans les oculaires de microscope (voir protocole: l’article 3). Une fois que le zona est perforé par le laser XYClone, lentivirus peuvent être introduits dans les milieux de culture pour la livraison de gène23. Lentivirus multiples pourraient servir à offrir simultanément plusieurs gènes chromosomiques incorporation.
Ce protocole décrit comment isoler et souris de la culture des oeufs fécondés, illustre l’utilisation de laser pour la perforation de la zone pellucide et illustre la transduction des cellules embryonnaires de souris de lentivirus.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>CD510B-1 plasmid</td>
			<td>System Biosciences</td>
			<td>CD510B-1</td>
			<td>used to package the lentivirus expressing EF1a-copGFP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethylpolysiloxane</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>DMPS5X</td>
			<td>culturing embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hyaluronidase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3506</td>
			<td>used to remove cumulus cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XYClone Laser</td>
			<td>Hamilton Thorne Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>perforating mouse fertilized eggs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-Surgical Embryo Transfer (NSET) Device</td>
			<td>ParaTechs</td>
			<td>60010</td>
			<td>NSET of embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KSOM medium</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MR-020P-5F</td>
			<td>culturing embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Composition of KSOM:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>mg/100mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>555</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>18.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>4.75</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4 7H2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>4.95</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2 2H2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>210</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>3.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na-Pyruvate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>2.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Lactic Acid, sodium salt</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.174mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10mM EDTA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>100&#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomycin</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>6.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5% phenol red</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.1mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>14.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Essential Amino Acids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-essential AA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.5mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M2 medium</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MR-015-D</td>
			<td>culturing embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Composition of M2:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>mg/100mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>25.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate (anhydrous)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>16.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>35.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate, Monobasic</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>16.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>35</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>553.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin, Bovine Fraction</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na-HEPES</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>54.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol Red</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvic Acid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>3.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Lactic Acid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>295</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

laser-assisted lentiviral gene delivery to mouse fertilized eggs

Lentivirus sont des vecteurs efficaces pour gène de cellules de mammifères. Suite de transduction, le génome des gènes est solidement intégré dans le chromosome de l’hôte et est transmis à la descendance. Ils sont donc un vecteur idéal pour la création de lignées cellulaires stables, en vivo livraison d’indicateurs et la transduction des oeufs seule cellule fertilisée pour créer des animaux transgéniques. Cependant, souris des oeufs fécondés et les embryons au stade précoce sont protégés par la zone pellucide, une matrice de glycoprotéine qui forme une barrière contre la livraison de gène des gènes. Lentivirus sont trop grosses pour pénétrer la zona et sont généralement livrés par microinjection de particules virales dans la cavité périvitellin, l’espace entre le zona et les cellules embryonnaires. L’exigence de techniciens hautement qualifiés et d’équipements spécialisés a réduit au minimum l’utilisation de lentivirus pour la livraison de gène à des embryons de souris. Cet article décrit un protocole pour perméabiliser les oeufs souris fécondée par perforer le zona avec un laser. Laser-perforation n’entraîne pas de dommages aux embryons et permet des lentivirus accéder aux cellules embryonnaires pour la livraison de gène. Transduite embryons peuvent devenir blastocyste in vitro et si implantés chez des souris pseudopregnant, évoluer vers des chiots transgéniques. Le laser utilisé dans le présent protocole est efficace et facile à utiliser. Gènes envoyés par lentivirus stablement incorporent sur les cellules embryonnaires de souris et sont transmissible germline. Il s’agit d’une méthode alternative pour la création de souris transgéniques qui ne nécessite aucun micromanipulation et microinjection des oeufs fécondés.

Développement des oeufs de souris isolé/transduites fécondée peut être vérifiée au microscope par jour (Figure 1). Santé des embryons se développent en blastocyste en 3 à 4 jours. Dans ce protocole, 60 à 70 % des embryons non traités développent en blastocyste23. Hors 114 perforé laser transduits embryons, 54 devenue blastocyste (taux de 47 %) et 46 blastocystes exprimé GFP (46/54 = 85 %)23.
<...

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Laser-assisted Lentiviral Gene Delivery to Mouse Fertilized Eggs

Souris fécondés et les embryons au stade précoce sont protégés par la zone pellucide, une matrice de glycoprotéine qui forme une barrière contre la livraison de gène. Cet article décrit un protocole pour perforer le zona avec un laser à transduce des cellules embryonnaires avec vecteurs LENTIVIRAUX et à créer des souris transgéniques.

Oeufs fécondés de livraison assistée par laser des gènes gène aux souris

Lentiviruses are efficient vectors for gene delivery to mammalian cells. Following transduction, the lentiviral genome is stably incorporated into the ...

Il s’agit d’une méthode alternative et facile à utiliser pour délivrer des gènes d’intérêt aux oeufs de souris fécondés par perforation laser de la zona pellucida et la livraison du gène lentiviral. La perforation assistée au laser de la procédure de donneur de souris peut également s’appliquer aux ovules fécondés d’autres espèces pour faciliter l’entrée d’autres types de virus ou de réamen transfection. Le principal avantage de cette technique est qu’elle ne nécessite pas de compétences spécialisées pour la micromanipulation et la micro-injection des œufs de souris fécondés.Page Myers, chercheur à la direction de la médecine comparée au NIEHS, fera la démonstration d’une procédure d’isolement des ovules de souris fécondés. 16 à 24 heures après l’accouplement, isoler les ovaires et les ovules des souris femelles avec des bouchons vaginaux, selon les protocoles standard. Lorsque tous les tissus ont été recueillis, déchirer l’ampulla de chaque ovaire, et libérer les ovules fécondés, entourés de cellules cumulées, et transférer les œufs dans des cellules cumulées à un plat de 35 millimètres contenant un x hyaluronidase dans le milieu M2 frais, pour une incubation de trois à cinq minutes à température ambiante.Pipette les oeufs à quelques reprises pour libérer les cellules cumulées, et transférer les œufs dans un nouveau plat de 35 millimètres contenant M2 moyen, avec pipetting pour laver l’enzyme. Ensuite, transférez les œufs lavés dans un plat de 35 millimètres contenant du simplex de potassium optimisé moyen, ou KSOM, et pipette pour laver le reste M2 moyen et hyaluronidase. Ensuite, transférez les œufs dans des plaques traitées de culture tissulaire de 35 millimètres épépinées de 50 microlitres de KSOM et de deux millilitres de diméthylpolysiloxane pendant un équilibre de deux heures à 37 degrés Celsius, 5 % de dioxyde de carbone et d’oxygène et 90 % d’azote.Pendant que les oeufs sont dans l’incubateur, installez et étalonnez le laser XYClone, selon les recommandations du fabricant. Lorsque les œufs sont prêts, placez la première plaque de chute sur le stade du microscope laser, et concentrez manuellement la zona pellucida. Après avoir confirmé que la lumière LED laser est visible à travers l’objectif, déplacer le stade microscope pour cibler la zona avec le laser LED, et utiliser le logiciel pour définir le laser XYClone à 250 microsecondes.Réglez la taille de la lumière LED aux dimensions appropriées, et perforer la zona pellucida de chaque œuf trois fois avec le laser pour produire trois trous de 10 micromètres. Il est essentiel d’effectuer la perforation rapidement, mais avec soin, car les œufs fécondés ne peuvent pas rester à l’extérieur de l’incubateur pendant plus de 15 minutes. Ensuite, retournez les œufs perforés à l’incubateur pendant encore deux heures.À la fin de la deuxième incubation, traiter la baisse de 50 microlitres KSOM avec deux microlitres de lentivirus concentré sans mélange. Et retourner les œufs à l’incubateur pendant quatre jours. Lorsque les ovules se sont développés en blastocystes, utilisez un dispositif non chirurgical de transfert d’embryons, pour déposer environ 10-15 embryons dans environ deux microlitres de KSOM.17 jours après le transfert de l’embryon, permettre à la souris enceinte d’accoucher naturellement ou de recueillir les nouveau-nés par césarienne si nécessaire. Ensuite, recueillir les tissus des chiots pour le génotypage, pour déterminer le taux de transgenèse. Le développement isolé et transduced d’oeuf fertilisé de souris peut être vérifié sous le microscope quotidiennement.60 à 70 % des embryons sains et non traités se développent en blastocystes dans un délai de trois à quatre jours. Alors qu’environ 47% des embryons transforés au laser se développent en blastocystes, dont 85% expriment le gène transduced d’intérêt. Viser le laser pour amincir la zona, au lieu de créer un trou, permet aux embryons en développement de bénéficier d’une zona pellucida intacte et encapsulante tout en restant permissif à la transduction lentivirale.La transduction avec un lentivirus recombinant, exprimant le GFP de copepod d’un promoteur de facteur d’allongement 1A induit des intégrations lentiviral multiples, et une expression élevée de GFP sous une lampe bleue de LED. Tout en essayant cette procédure, il est important de se rappeler que, tandis que la capacité des lentivirus à s’intégrer dans le génome hôte en fait un outil puissant pour la livraison stable des gènes, mais l’intégration aléatoire peut également introduire des mutations insertionnelles. Cette technique pourrait permettre aux chercheurs dans le domaine de la génétique de développer rapidement des modèles animaux transgéniques pour l’étude des maladies pour la production de protéines in vivo, ou pour des études génétiques fonctionnelles.Après cette procédure, d’autres méthodes comme l’immunohistochimie peuvent être effectuées sur des échantillons de tissus isolés provenant de chiots transduced pour répondre à des questions supplémentaires sur l’emplacement et l’étendue de l’expression des gènes dans divers tissus d’intérêt. N’oubliez pas que travailler avec des lentivirus peut être extrêmement dangereux. Veuillez donc suivre vos directives institutionnelles pour travailler avec les lentivirus.Portez des vêtements de protection individuelle et décontaminez tous les déchets avant l’élimination.

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