Name: laser-assisted lentiviral gene delivery to mouse fertilized eggs
Uploaded: 2018-11-01T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Laser-assisted Lentiviral Gene Delivery to Mouse Fertilized Eggs at JoVE.com

מחקר זה נתמך על ידי מגזר תוכנית המחקר של המכון הלאומי לבריאות (NIH), לאומי המכון למדעי בריאות הסביבה (NIEHS). . אנחנו אסירי תודה ד ר רוברט פטרוביץ, ד ר ג'ייסון ויליאמס על קריאה ביקורתית של כתב היד, עצות מועילות. אנחנו רוצים גם להכיר ולהודות ד ר ברנד מבריק, הליבה נוקאאוט, המתקן Cytometry זרימה, מיקרוסקופיה של זריחה, מרכז הדמיה ובמתקני ענף רפואה השוואתית NIEHS על תרומתם טכני. ברצוננו להודות מר דוד גולדינג מהענף רפואה השוואתית, גב' לויס Wyrick של מרכז הדמיה ב NIEHS סיפק לנו תצלומים ואיורים.

כל ההליכים בבעלי חיים וטיפולים בשימוש פרוטוקול זה היו בהתאם להנחיות NIH/NIEHS טיפול בבעלי חיים, אושרו על ידי טיפול בעלי חיים ועל שימוש הוועדה (ACUC) ב NIH/NIEHS, חיה פרוטוקול 2010-0004.
1. תכשירים
<ol><li>להכין/רכישה של recombinant lentiviruses הפצת שאינו נושא את הגן עניין. במחקר זה, lentivirus SBI511 ביטוי חלבון פ...

<ol>
	<li>Sakuma, T., Barry, M. A., Ikeda, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentiviral+vectors:+basic+to+translational.">Lentiviral vectors: basic to translational.</a> Biochemical Journal. 443 (3), 603-618 (2012).</li><li>Salmon, P., Trono, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+and+titration+of+lentiviral+vectors.">Production and titration of lentiviral vectors.</a> Current Protocols in Human Genetics. , (2007).</li><li>Lois, C., Hong, E. J., Pease, S., Brown, E. J., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germline+transmission+and+tissue-specific+expression+of+transgenes+delivered+by+lentiviral+vectors.">Germline transmission and tissue-specific expression of transgenes delivered by lentiviral vectors.</a> Science. 295 (5556), 868-872 (2002).</li><li>Filipiak, W. E., Saunders, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+transgenic+rat+production.">Advances in transgenic rat production.</a> Transgenic Research. 15 (6), 673-686 (2006).</li><li>McGrew, M. J., Sherman, A., Lillico, S. G., Taylor, L., Sang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+conservation+between+rodents+and+chicken+of+regulatory+sequences+driving+skeletal+muscle+gene+expression+in+transgenic+chickens.">Functional conservation between rodents and chicken of regulatory sequences driving skeletal muscle gene expression in transgenic chickens.</a> BMC Developmental Biology. 10, 26 (2010).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+transgenic+pigs+mediated+by+pseudotyped+lentivirus+and+sperm.">Production of transgenic pigs mediated by pseudotyped lentivirus and sperm.</a> PLoS One. 7 (4), e35335 (2012).</li><li>Zhang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+quail+production+by+microinjection+of+lentiviral+vector+into+the+early+embryo+blood+vessels.">Transgenic quail production by microinjection of lentiviral vector into the early embryo blood vessels.</a> PLoS One. 7 (12), e50817 (2012).</li><li>Wassarman, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zona+pellucida+glycoproteins.">Zona pellucida glycoproteins.</a> Annul Review of Biochemistry. 57, 415-442 (1988).</li><li>Clift, D., Schuh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Restarting+life:+fertilization+and+the+transition+from+meiosis+to+mitosis.">Restarting life: fertilization and the transition from meiosis to mitosis.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (9), 549-562 (2013).</li><li>Fong, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blastocyst+transfer+after+enzymatic+treatment+of+the+zona+pellucida:+improving+in-vitro+fertilization+and+understanding+implantation.">Blastocyst transfer after enzymatic treatment of the zona pellucida: improving in-vitro fertilization and understanding implantation.</a> Human Reproduction. 13 (10), 2926-2932 (1998).</li><li>Nijs, M., Van Steirteghem, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+different+isolation+procedures+for+blastomeres+from+two-cell+mouse+embryos.">Assessment of different isolation procedures for blastomeres from two-cell mouse embryos.</a> Human Reproduction. 2 (5), 421-424 (1987).</li><li>Ribas, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+zona+pellucida+removal+on+DNA+methylation+in+early+mouse+embryos.">Effect of zona pellucida removal on DNA methylation in early mouse embryos.</a> Biology of Reproduction. 74 (2), 307-313 (2006).</li><li>Gordon, J. W., Scangos, G. A., Plotkin, D. J., Barbosa, J. A., Ruddle, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+transformation+of+mouse+embryos+by+microinjection+of+purified+DNA.">Genetic transformation of mouse embryos by microinjection of purified DNA.</a> Proceedings of National Academy of Science U S A. 77 (12), 7380-7384 (1980).</li><li>Kaneko, T., Sakuma, T., Yamamoto, T., Mashimo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+knockout+by+electroporation+of+engineered+endonucleases+into+intact+rat+embryos.">Simple knockout by electroporation of engineered endonucleases into intact rat embryos.</a> Scientific Reports. 4, 6382 (2014).</li><li>Hosokawa, Y., Ochi, H., Iino, T., Hiraoka, A., Tanaka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoporation+of+biomolecules+into+single+cells+in+living+vertebrate+embryos+induced+by+a+femtosecond+laser+amplifier.">Photoporation of biomolecules into single cells in living vertebrate embryos induced by a femtosecond laser amplifier.</a> PLoS One. 6 (11), e27677 (2011).</li><li>Horii, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+microinjection+methods+for+generating+knockout+mice+by+CRISPR/Cas-mediated+genome+engineering.">Validation of microinjection methods for generating knockout mice by CRISPR/Cas-mediated genome engineering.</a> Scientific Reports. 4, 4513 (2014).</li><li>Hamra, F. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+transgenic+rats+by+lentiviral+transduction+of+male+germ-line+stem+cells.">Production of transgenic rats by lentiviral transduction of male germ-line stem cells.</a> Proceedings of National Academy of Science U S A. 99 (23), 14931-14936 (2002).</li><li>Kanatsu-Shinohara, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+transgenic+rats+via+lentiviral+transduction+and+xenogeneic+transplantation+of+spermatogonial+stem+cells.">Production of transgenic rats via lentiviral transduction and xenogeneic transplantation of spermatogonial stem cells.</a> Biology of Reproduction. 79 (6), 1121-1128 (2008).</li><li>Dann, C. T., Garbers, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+knockdown+rats+by+lentiviral+transduction+of+embryos+with+short+hairpin+RNA+transgenes.">Production of knockdown rats by lentiviral transduction of embryos with short hairpin RNA transgenes.</a> Methods in Molecular Biology. 450, 193-209 (2008).</li><li>Chandrashekran, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+generation+of+transgenic+mice+by+lentivirus-mediated+modification+of+spermatozoa.">Efficient generation of transgenic mice by lentivirus-mediated modification of spermatozoa.</a> FASEB Journal. 28 (2), 569-576 (2014).</li><li>Woods, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser-assisted+in+vitro+fertilization+facilitates+fertilization+of+vitrified-warmed+C57BL/6+mouse+oocytes+with+fresh+and+frozen-thawed+spermatozoa,+producing+live+pups.">Laser-assisted in vitro fertilization facilitates fertilization of vitrified-warmed C57BL/6 mouse oocytes with fresh and frozen-thawed spermatozoa, producing live pups.</a> PLoS One. 9 (3), e91892 (2014).</li><li>Tanaka, N., Takeuchi, T., Neri, Q. V., Sills, E. S., Palermo, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser-assisted+blastocyst+dissection+and+subsequent+cultivation+of+embryonic+stem+cells+in+a+serum/cell+free+culture+system:+applications+and+preliminary+results+in+a+murine+model.">Laser-assisted blastocyst dissection and subsequent cultivation of embryonic stem cells in a serum/cell free culture system: applications and preliminary results in a murine model.</a> Journal of Translational Medicine. 4, 20 (2006).</li><li>Martin, N. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=En+masse+lentiviral+gene+delivery+to+mouse+fertilized+eggs+via+laser+perforation+of+zona+pellucida.">En masse lentiviral gene delivery to mouse fertilized eggs via laser perforation of zona pellucida.</a> Transgenic Research. 27 (1), 39-49 (2018).</li><li>Lawitts, J. A., Biggers, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+of+preimplantation+embryos.">Culture of preimplantation embryos.</a> Methods in Enzymology. 225, 153-164 (1993).</li><li>Stein, P., Schindler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+oocyte+microinjection,+maturation+and+ploidy+assessment.">Mouse oocyte microinjection, maturation and ploidy assessment.</a> Journal of Visualized Experiments. (53), (2011).</li><li>Nagy, A., Gertsenstein, M., Vintersten, K., Behringer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caesarean+section+and+fostering.">Caesarean section and fostering.</a> CSH Protocols. 2006 (2), (2006).</li><li>Chum, P. Y., Haimes, J. D., Andre, C. P., Kuusisto, P. K., Kelley, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genotyping+of+plant+and+animal+samples+without+prior+DNA+purification.">Genotyping of plant and animal samples without prior DNA purification.</a> Journal of Visualized Experiments. (67), (2012).</li><li>Bin Ali, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+pregnancy+and+birth+rates+with+routine+application+of+nonsurgical+embryo+transfer.">Improved pregnancy and birth rates with routine application of nonsurgical embryo transfer.</a> Transgenic Research. 23 (4), 691-695 (2014).</li><li>Liu, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrase-deficient+lentivirus:+opportunities+and+challenges+for+human+gene+therapy.">Integrase-deficient lentivirus: opportunities and challenges for human gene therapy.</a> Current Gene Therapy. 14 (5), 352-364 (2014).</li><li>Sauvain, M. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genotypic+features+of+lentivirus+transgenic+mice.">Genotypic features of lentivirus transgenic mice.</a> Journal of Virology. 82 (14), 7111-7119 (2008).</li></ol>

היכולת של lentiviruses שילוב לתוך הגנום המארח שלהם גורם להם וקטור אידיאלי עבור המסירה הגן יציב. וקטורים lentiviral יכול לשאת kilobase עד 8.5 זוג (kbp) של חומר גנטי שיכול להכיל תאים ספציפיים או inducible היזמים, סמני הבחירה או moieties פלורסנט. החומר הגנומי incorporated יכולים לשכפל כחלק הגנום המארח שלהם, להיות מוסדרות כדי ?...

בשיטה זו מספק הוראות מפורטות עבור permeabilizing את pellucida zona של העכבר מופרית ביצים כדי להפוך תאים עובריים לנגיש עבור המסירה הגן על-ידי lentiviruses. Lentiviruses תוכננו על ידי הטבע למסירה גן יעיל בתרבית של תאים. הם להדביק תאים החלוקה הלא-חלוקת ולשלב את הגנום lentiviral שלהם מארח כרומוזומים1. טווח התאים מארח lentiviral ברצון מורחבת מאת pseudotyping את lentivirus רקומביננטי עם גליקופרוטאין וירוס vesicular stomatitis (VSV-G), בשל tropism רחב של חלבון VSV-G2. בעקבות התמרה חושית, גנים lentiviral stably משולב, הביע כחלק בכרומוזומים המארח שלהם יצירת כלי אידיאלי ליצירת חיות מהונדס. אם תימסר לתאים עובריים בשלב מוקדם, הגנום lentiviral משוכפלת, שבאה לידי ביטוי בכל המנגנון. התמרה חושית lentiviral הוביל הייצור של עכברים, עכברושים, עוף, שליו, חזיר3,4,5,6,,7 , בין מינים אחרים של transgenics. השיטה טיפוסי של המסירה הגן lentiviral, עם זאת, דורשת טכנאים מיומנים וציוד מיוחדים כדי להתגבר על המכשול zona pellucida המכיל את העוברים בשלב מוקדם. המטרה הכוללת של שיטה זו הוא לתאר כיצד permeabilize את zona באמצעות לייזר כדי להקל על המסירה הגן lentiviral.
ביצים יונקים מוקפים את pellucida zona אשר מתקשה בעקבות הפריה להגן על הביצים מפני polyspermy וכדי להגביל את האינטראקציות סביבתיים8,9. Zona יוצרת מחסום שמונע lentiviruses מן התאים מתחלקים עד העוברים בוקעים כמו הבלסטוציסט. העכבר בתרבית מופרית ביצים הפתח לאחר 4 ימים, חייב להיות מושתלים לתוך עכברים pseudopregnant לפני הבקיעה להתפתחות הרגילה לתוך הגורים. לכן, עבור התמרה חושית, lentiviruses הן microinjected לפני הבקיעה מן zona לתוך החלל perivitelline, הרווח בין zona של תאים עובריים.
Pellucida zona יוסר לעיתים קרובות עבור הפריה במבחנה של ביצים אנושי כדי להגביר את קצב הפריה10. אולם, הסרת כימי של העכבר zona pellucida לרעה משפיעה על התפתחות העובר העכבר, מזיקה תאים עובריים11,12. שיטות נוספות המסירה הגן ביצים העכבר מופרית להתגבר על המכשול zona pellucida על ידי microinjection ישירה של ה-DNA לתוך גרעין התא13. Pronuclear microinjection הוא אמצעי יעיל של אספקת גנים העוברים. עם זאת, מאז כל העובר מתקיים במקום בנפרד עבור microinjection, התרגול ניתן מפרך וצורכת זמן למשתמש המתחיל.
שיטות אחרות כגון אלקטרופורציה photoporation שימושיים ארעי, המסירה הגן לטווח קצר העכבר מופרית ביצים14,15,16. שיטות אלה משמשים בהרחבה להעברת רכיבים CRISPR-Cas9 ו- recombinases. עם זאת, משלוח אלקטרופורציה ו- photoporation של גנים לא ניתן להשתמש ביעילות כדי ליצור transgenics. Spermatozoa הנאספות מן העכבר מנוקבת יותרת האשך יכול גם להיות transduced על ידי lentiviruses, שימוש עבור הפריה במבחנה להפקת חיות הטרנסגניים17,18,19, 20.
ב פרוטוקול זה, המסירה הגן lentiviral העכבר עוברי בהנחייתם permeabilizing את zona באמצעות לייזר. הלייזר XYClone פותחה ככלי סיוע עבור במבחנה הדישון21 וטיפוח של תאי גזע עובריים22. זה מנגנון קטן פשוט להתקנת וניתן קל לשימוש. פעם להתקין מיקרוסקופ, הנתפש המרחב של עדשת המטרה בתוכנה הנלווית מאפשר מכוון הלייזר תוך התבוננות דרך של עיניות מיקרוסקופ (ראה פרוטוקול: סעיף 3). ברגע סונה הוא מחורר על ידי לייזר XYClone, lentiviruses יכול להיות מוחדרים התקשורת תרבות עבור ג'ין משלוח23. ניתן להשתמש lentiviruses מרובים בו זמנית לספק מספר גנים של התאגדות כרומוזומלית.
פרוטוקול זה יתאר כיצד לבודד, תרבות העכבר מופרית ביצים, מדגים את השימוש בלייזר עבור ניקוב של pellucida zona, ממחישה את התמרה חושית של תאים עובריים בעכבר על-ידי lentiviruses.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>CD510B-1 plasmid</td>
			<td>System Biosciences</td>
			<td>CD510B-1</td>
			<td>used to package the lentivirus expressing EF1a-copGFP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethylpolysiloxane</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>DMPS5X</td>
			<td>culturing embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hyaluronidase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3506</td>
			<td>used to remove cumulus cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XYClone Laser</td>
			<td>Hamilton Thorne Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>perforating mouse fertilized eggs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-Surgical Embryo Transfer (NSET) Device</td>
			<td>ParaTechs</td>
			<td>60010</td>
			<td>NSET of embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KSOM medium</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MR-020P-5F</td>
			<td>culturing embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Composition of KSOM:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>mg/100mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>555</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>18.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>4.75</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4 7H2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>4.95</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2 2H2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>210</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>3.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na-Pyruvate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>2.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Lactic Acid, sodium salt</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.174mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10mM EDTA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>100&#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomycin</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>6.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5% phenol red</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.1mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>14.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Essential Amino Acids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-essential AA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.5mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M2 medium</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MR-015-D</td>
			<td>culturing embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Composition of M2:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>mg/100mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>25.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate (anhydrous)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>16.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>35.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate, Monobasic</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>16.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>35</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>553.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin, Bovine Fraction</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na-HEPES</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>54.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol Red</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvic Acid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>3.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Lactic Acid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>295</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

laser-assisted lentiviral gene delivery to mouse fertilized eggs

Lentiviruses הם וקטורים יעיל למסירה גן בתרבית של תאים. בעקבות התמרה חושית, הגנום lentiviral stably הוא שולב כרומוזום המארח, מועברת אל רומא. לפיכך, הם וקטורים אידיאלי עבור יצירה של שורות תאים יציב, ויוו משלוח של אינדיקטורים, התמרה חושית של תא בודד מופרית ביצים כדי ליצור חיות מהונדס. עם זאת, העכבר מופרית ביצים, העוברים בשלב מוקדם מוגנים על-ידי zona pellucida, מטריצה גליקופרוטאין המהווה מחסום נגד המסירה הגן lentiviral. Lentiviruses גדולים מדי כדי לחדור את סונה, מועברים בדרך כלל על ידי microinjection של נגיפים לתוך החלל perivitelline, הרווח בין zona של תאים עובריים. הדרישה לבעיותיהם מיומנים וציוד מיוחדים יש למזער את השימוש lentiviruses למסירה גן העוברים העכבר. מאמר זה מתאר פרוטוקול עבור permeabilizing את הביצים העכבר מופרית על ידי לנקב את zona עם לייזר. לייזר-ניקוב לא לגרום כל נזק עוברי ומאפשר lentiviruses לקבל גישה לתאים עובריים למסירה גן. Transduced עוברי ניתן להתפתח הבלסטוציסט במבחנה, אם שהושתלו בעכברים pseudopregnant, להתפתח הטרנסגניים הגורים. הלייזר בשימוש פרוטוקול זה הוא יעיל, קל לשימוש. הגנים מועברים על ידי lentiviruses stably לשלב תאים עובריים בעכבר, germline שעוברת ביחסי. זה שיטה חלופית עבור יצירה של העכברים הטרנסגניים הדורשת אין המיקרומניפולציה ו- microinjection של הביצים.

פיתוח של ביצים מבודד/transduced העכבר מופרית ניתן לבדוק תחת מיקרוסקופ מדי יום (איור 1). העוברים בריאים להתפתח הבלסטוציסט תוך 3-4 ימים. ב פרוטוקול זה, 60-70% ללא טיפול עוברי להתפתח הבלסטוציסט23. מתוך 114 מחורר בלייזר transduced עוברי 54 התפתחה הבלסטוציסט (שיעור ש...

Watch this Scientific Journal Video about Laser-assisted Lentiviral Gene Delivery to Mouse Fertilized Eggs at JoVE.com

Laser-assisted Lentiviral Gene Delivery to Mouse Fertilized Eggs

עכבר הביצים, העוברים בשלב מוקדם מוגנים על-ידי zona pellucida, מטריצה גליקופרוטאין המהווה מחסום נגד המסירה הגן. מאמר זה מתאר עבור לנקב את zona עם לייזר כדי מגלי תאים עובריים עם וקטורים lentiviral וכדי ליצור העכברים הטרנסגניים פרוטוקול.

המסירה הגן Lentiviral לייזר בסיוע העכבר מופרית ביצים

Lentiviruses are efficient vectors for gene delivery to mammalian cells. Following transduction, the lentiviral genome is stably incorporated into the ...

זוהי שיטה חלופית וקלה לשימוש להעברת גנים מעניינים לביצים עכבר מופרות באמצעות ניקוב לייזר של זניה פלוצידה ואספקת גנים lentiviral. ניקוב בסיוע לייזר של הליך תורם העכבר עשוי להיות ישים גם ביצים מופרות של מינים אחרים להקל על כניסת סוגים אחרים של וירוסים או reagents transfection. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא אינה דורשת כישורים מיוחדים עבור micromanipulation והזרקת מיקרו של ביצי עכבר מופרות.הפגנת הליך בידוד ביצית עכבר מופרית תהיה Page Myers, מדען מחקר מסניף הרפואה ההשוואתית ב- NIEHS. 16 עד 24 שעות לאחר ההזדווגות, לבודד את השחלות ואת ovaducts מעכברים נקבה עם תקעים בנרתיק, על פי פרוטוקולים סטנדרטיים. כאשר כל הרקמות נאספו, לקרוע את האמפולה של כל השחלה לגזרים, ולשחרר את הביציות המופריות, מוקף תאים cumulous, ולהעביר את הביצים בתאים cumulous לצלחת 35 מילימטר המכיל אחד x hyaluronidase במדיום M2 טרי, עבור דגירה שלוש עד חמש דקות בטמפרטורת החדר.פיפטה את הביצים כמה פעמים כדי לשחרר את התאים cumulous, ולהעביר את הביצים לצלחת חדשה 35 מילימטר המכיל M2 בינוני, עם צינור לשטוף את האנזים. לאחר מכן, מעבירים את הביצים השטופות לתבשיל 35 מילימטר המכיל אשלגן סימפלקס ממוטב בינוני, או KSOM, ו pipette לשטוף את M2 הנותר בינוני היאלואורונידס. לאחר מכן, להעביר את הביצים 35 מילימטר רקמות תרבות מטופלים צלחות זרע עם 50 microliters של KSOM ושני מיליליטר של dimethylpolysiloxane עבור שיווי משקל של שעתיים ב 37 מעלות צלזיוס, 5% פחמן דו חמצני וחמצן, ו 90% חנקן.בעוד הביצים נמצאות באינקובטור, להגדיר ולכייל את לייזר XYClone, על פי המלצות היצרן. כאשר הביצים מוכנות, מניחים את צלחת הירידה הראשונה על שלב המיקרוסקופ בלייזר, וממקדים ידנית את הזונה פלוצ'ידה. לאחר אישור כי אור LED לייזר גלוי דרך המטרה, להזיז את שלב המיקרוסקופ כדי למקד את zona עם לייזר LED, ולהשתמש בתוכנת המחשב כדי להגדיר את לייזר XYClone ל 250 מיקרו שניות.התאימו את גודל תאורת ה-LED לממדים המתאימים, וניקוב הזונה פלוצ'ידה של כל ביצה שלוש פעמים באמצעות הלייזר כדי לייצר שלושה חורים של 10 מיקרומטר. זה קריטי לבצע את הניקוב במהירות, אבל בזהירות, כמו ביצים מופרות לא יכול לשמור מחוץ החממה במשך יותר מ 15 דקות. לאחר מכן, להחזיר את הביצים מחוררות לאנקובטור במשך שעתיים נוספות.בסוף הדגירה השנייה, לטפל טיפת KSOM 50 microliter עם שני microliters של lentivirus מרוכז ללא ערבוב. ולהחזיר את הביצים לאנקובטור לארבעה ימים. כאשר הביצים התפתחו לתוך blastocysts, להשתמש במכשיר העברת עוברים שאינם כירורגיים, להפקיד כ 10-15 עוברים על שני microliters של KSOM.17 ימים לאחר העברת העובר, לאפשר לעכבר בהריון ללדת באופן טבעי או לאסוף את הנידון על ידי ניתוח קיסרי לפי הצורך. לאחר מכן, לאסוף רקמה מן הגורים עבור genotyping, כדי לקבוע את קצב הטרנסגנזה. ניתן לבדוק מדי יום פיתוח ביציות מבודדות ומופרי עכבר תחת המיקרוסקופ.60 עד 70% מהעוברים הבריאים והבלתי מטופלים מתפתחים לבסטוציסט בתוך שלושה עד ארבעה ימים. בעוד שכ-47% מהעוברים מחוררים בלייזר ומתומרים מתפתחים לבולסטוציסטים, 85% מהם מבטאים את הגן המקוצר של העניין. מכוון את הלייזר כדי לדלל את zona, במקום ליצור חור, מאפשר לעוברים המתפתחים ליהנות שלם, אנקפסולציה zona pellucida תוך שמירה מתירנית כדי טרנסדוקציה lentiviral.התמרה עם lentivirus רקומביננטי, הבעת copepod GFP ממקדם הארכה 1A גורם אינטגרציות lentiviral מרובים, וביטוי גבוה של GFP תחת מנורת LED כחולה. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור כי בעוד היכולת של lentiviruses להשתלב בגנום המארח עושה אותם כלי רב עוצמה עבור אספקת גנים יציבה, אבל אינטגרציה אקראית עשויה גם להציג מוטציות הכנסה. טכניקה זו יכולה לאפשר לחוקרים בתחום הגנטיקה לפתח במהירות מודלים מהונדסים של בעלי חיים לחקר מחלות לייצור חלבון איבו, או למחקרי גנים תפקודיים.בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו אימונוהיסטוכימיה על דגימות רקמה מבודדות של גורים מתומרים כדי לענות על שאלות נוספות על המיקום והיקף ביטוי הגנים ברקמות שונות של עניין. אל תשכח כי עבודה עם lentiviruses יכול להיות מסוכן מאוד. לכן אנא בצע את ההנחיות המוסדיות שלך לעבודה עם lentiviruses.ללבוש בגדי מגן אישיים לטהר את כל הפסולת לפני סילוק.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Genetics

Viruses

SCIENTISTS IN ACTION

Windowing Chicken Eggs for Developmental Studies

עוף Windowing ביצים למחקרים התפתחותיים

The study of development has been greatly aided by the use of the chick embryo as an experimental model.  The ease of accessibility of the embryo has ...

Obtaining Eggs from Xenopus laevis Females

קבלת ביצים Xenopus laevis נקבות

The eggs of Xenopus laevis intact, lysed, and/or fractionated are useful for a wide variety of experiments. This protocol shows how to induce egg laying, ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

שימוש ג&#39;ין Pulser מערכת MXcell electroporation כדי Transfect תאים ראשוניים עם יעילות גבוהה

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

בשנת vivo ההדמיה לטיפולים במודל עכבר orthotopic של סרטן השחלות

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models.  This paper describes the development of an orthotopic mouse model ...

Isolation and Culture of Cells from the Nephrogenic Zone of the Embryonic Mouse Kidney

בידוד והתרבות של תאים מאזור nephrogenic של הכליה עכבר עובריים

Embryonic development of the kidney has been extensively studied both as a model for epithelial-mesenchymal interaction in organogenesis and  to gain ...

Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides

באמצעות רצף מעצר SecM ככלי לבודד פוליפפטידים כרוכים הריבוזום

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway ...

Intraductal Injection for Localized Drug Delivery to the Mouse Mammary Gland

הזרקת intraductal עבור משלוח סמים מקומיים לעכבר החלב בלוטת

Herein we describe a protocol to deliver various reagents to the mouse mammary gland via intraductal injections. Localized drug delivery and knock-down of ...

Transient Expression of Proteins by Hydrodynamic Gene Delivery in Mice

ביטוי חולף של חלבונים על ידי הידרודינמית ג&#39;ין משלוח בעכברים

Efficient expression of transgenes in vivo is of critical importance in studying gene function and developing treatments for diseases. Over the past ...

Phage-mediated Delivery of Targeted sRNA Constructs to Knock Down Gene Expression in E. coli

Phage-mediated Delivery of Targeted sRNA Constructs to Knock Down Gene Expression in E. coli

משלוח בתיווך הפאג של ממוקדת Srna בונה להפיל Gene Expression ב<em&gt; E. coli</em

RNA-mediated knockdowns are widely used to control gene expression. This versatile family of techniques makes use of short RNA (sRNA) that can be ...

Laser-assisted Microdissection (LAM) as a Tool for Transcriptional Profiling of Individual Cell Types

Laser-assisted Microdissection LAM as a Tool for Transcriptional Profiling of Individual Cell Types

Microdissection לייזר בסיוע (LAM) ככלי פרופיל תעתיק של סוגי תאים בודדים

The understanding of developmental processes at the molecular level requires insights into transcriptional regulation, and thus the transcriptome, at the ...