Name: laser-assisted lentiviral gene delivery to mouse fertilized eggs
Uploaded: 2018-11-01T14:30:00
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Questa ricerca è stata sostenuta dal programma di ricerca intramurale del National Institute of Health (NIH), National Institute di Environmental Health Sciences (NIEHS). Siamo grati al Dr. Robert Petrovich e Dr. Jason Williams per una lettura critica del manoscritto e consigli utili. Inoltre vorremmo citare e ringraziare il Dr. Bernd Gloss, il nucleo di Knockout, la struttura di citometria a flusso, la microscopia a fluorescenza e Imaging Center e le strutture di ramo di medicina comparativa del NIEHS per i loro contributi tecnici. Vorremmo ringraziare Mr. David Goulding dal ramo di medicina comparativa e MS. Lois Wyrick di Imaging Center presso il NIEHS per averci fornito con fotografie e illustrazioni.

Tutte le procedure animale e trattamenti utilizzati nel presente protocollo erano in conformità con le linee guida di NIH/NIEHS cura degli animali e sono stati approvati dalla cura degli animali e uso Comitato (ACUC) presso il NIH/NIEHS, animale protocollo 2010-0004.
1. preparati
<ol><li>Preparare/acquisto ricombinante non propagante lentivirus che trasporta il gene di interesse. In questo studio, lentivirus SBI511 espressione della proteina fluorescente verde Copepoda (copGFP; abbreviato i...

<ol>
	<li>Sakuma, T., Barry, M. A., Ikeda, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentiviral+vectors:+basic+to+translational.">Lentiviral vectors: basic to translational.</a> Biochemical Journal. 443 (3), 603-618 (2012).</li><li>Salmon, P., Trono, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+and+titration+of+lentiviral+vectors.">Production and titration of lentiviral vectors.</a> Current Protocols in Human Genetics. , (2007).</li><li>Lois, C., Hong, E. J., Pease, S., Brown, E. J., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germline+transmission+and+tissue-specific+expression+of+transgenes+delivered+by+lentiviral+vectors.">Germline transmission and tissue-specific expression of transgenes delivered by lentiviral vectors.</a> Science. 295 (5556), 868-872 (2002).</li><li>Filipiak, W. E., Saunders, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+transgenic+rat+production.">Advances in transgenic rat production.</a> Transgenic Research. 15 (6), 673-686 (2006).</li><li>McGrew, M. J., Sherman, A., Lillico, S. G., Taylor, L., Sang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+conservation+between+rodents+and+chicken+of+regulatory+sequences+driving+skeletal+muscle+gene+expression+in+transgenic+chickens.">Functional conservation between rodents and chicken of regulatory sequences driving skeletal muscle gene expression in transgenic chickens.</a> BMC Developmental Biology. 10, 26 (2010).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+transgenic+pigs+mediated+by+pseudotyped+lentivirus+and+sperm.">Production of transgenic pigs mediated by pseudotyped lentivirus and sperm.</a> PLoS One. 7 (4), e35335 (2012).</li><li>Zhang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+quail+production+by+microinjection+of+lentiviral+vector+into+the+early+embryo+blood+vessels.">Transgenic quail production by microinjection of lentiviral vector into the early embryo blood vessels.</a> PLoS One. 7 (12), e50817 (2012).</li><li>Wassarman, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zona+pellucida+glycoproteins.">Zona pellucida glycoproteins.</a> Annul Review of Biochemistry. 57, 415-442 (1988).</li><li>Clift, D., Schuh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Restarting+life:+fertilization+and+the+transition+from+meiosis+to+mitosis.">Restarting life: fertilization and the transition from meiosis to mitosis.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (9), 549-562 (2013).</li><li>Fong, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blastocyst+transfer+after+enzymatic+treatment+of+the+zona+pellucida:+improving+in-vitro+fertilization+and+understanding+implantation.">Blastocyst transfer after enzymatic treatment of the zona pellucida: improving in-vitro fertilization and understanding implantation.</a> Human Reproduction. 13 (10), 2926-2932 (1998).</li><li>Nijs, M., Van Steirteghem, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+different+isolation+procedures+for+blastomeres+from+two-cell+mouse+embryos.">Assessment of different isolation procedures for blastomeres from two-cell mouse embryos.</a> Human Reproduction. 2 (5), 421-424 (1987).</li><li>Ribas, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+zona+pellucida+removal+on+DNA+methylation+in+early+mouse+embryos.">Effect of zona pellucida removal on DNA methylation in early mouse embryos.</a> Biology of Reproduction. 74 (2), 307-313 (2006).</li><li>Gordon, J. W., Scangos, G. A., Plotkin, D. J., Barbosa, J. A., Ruddle, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+transformation+of+mouse+embryos+by+microinjection+of+purified+DNA.">Genetic transformation of mouse embryos by microinjection of purified DNA.</a> Proceedings of National Academy of Science U S A. 77 (12), 7380-7384 (1980).</li><li>Kaneko, T., Sakuma, T., Yamamoto, T., Mashimo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+knockout+by+electroporation+of+engineered+endonucleases+into+intact+rat+embryos.">Simple knockout by electroporation of engineered endonucleases into intact rat embryos.</a> Scientific Reports. 4, 6382 (2014).</li><li>Hosokawa, Y., Ochi, H., Iino, T., Hiraoka, A., Tanaka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoporation+of+biomolecules+into+single+cells+in+living+vertebrate+embryos+induced+by+a+femtosecond+laser+amplifier.">Photoporation of biomolecules into single cells in living vertebrate embryos induced by a femtosecond laser amplifier.</a> PLoS One. 6 (11), e27677 (2011).</li><li>Horii, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+microinjection+methods+for+generating+knockout+mice+by+CRISPR/Cas-mediated+genome+engineering.">Validation of microinjection methods for generating knockout mice by CRISPR/Cas-mediated genome engineering.</a> Scientific Reports. 4, 4513 (2014).</li><li>Hamra, F. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+transgenic+rats+by+lentiviral+transduction+of+male+germ-line+stem+cells.">Production of transgenic rats by lentiviral transduction of male germ-line stem cells.</a> Proceedings of National Academy of Science U S A. 99 (23), 14931-14936 (2002).</li><li>Kanatsu-Shinohara, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+transgenic+rats+via+lentiviral+transduction+and+xenogeneic+transplantation+of+spermatogonial+stem+cells.">Production of transgenic rats via lentiviral transduction and xenogeneic transplantation of spermatogonial stem cells.</a> Biology of Reproduction. 79 (6), 1121-1128 (2008).</li><li>Dann, C. T., Garbers, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+knockdown+rats+by+lentiviral+transduction+of+embryos+with+short+hairpin+RNA+transgenes.">Production of knockdown rats by lentiviral transduction of embryos with short hairpin RNA transgenes.</a> Methods in Molecular Biology. 450, 193-209 (2008).</li><li>Chandrashekran, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+generation+of+transgenic+mice+by+lentivirus-mediated+modification+of+spermatozoa.">Efficient generation of transgenic mice by lentivirus-mediated modification of spermatozoa.</a> FASEB Journal. 28 (2), 569-576 (2014).</li><li>Woods, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser-assisted+in+vitro+fertilization+facilitates+fertilization+of+vitrified-warmed+C57BL/6+mouse+oocytes+with+fresh+and+frozen-thawed+spermatozoa,+producing+live+pups.">Laser-assisted in vitro fertilization facilitates fertilization of vitrified-warmed C57BL/6 mouse oocytes with fresh and frozen-thawed spermatozoa, producing live pups.</a> PLoS One. 9 (3), e91892 (2014).</li><li>Tanaka, N., Takeuchi, T., Neri, Q. V., Sills, E. S., Palermo, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser-assisted+blastocyst+dissection+and+subsequent+cultivation+of+embryonic+stem+cells+in+a+serum/cell+free+culture+system:+applications+and+preliminary+results+in+a+murine+model.">Laser-assisted blastocyst dissection and subsequent cultivation of embryonic stem cells in a serum/cell free culture system: applications and preliminary results in a murine model.</a> Journal of Translational Medicine. 4, 20 (2006).</li><li>Martin, N. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=En+masse+lentiviral+gene+delivery+to+mouse+fertilized+eggs+via+laser+perforation+of+zona+pellucida.">En masse lentiviral gene delivery to mouse fertilized eggs via laser perforation of zona pellucida.</a> Transgenic Research. 27 (1), 39-49 (2018).</li><li>Lawitts, J. A., Biggers, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+of+preimplantation+embryos.">Culture of preimplantation embryos.</a> Methods in Enzymology. 225, 153-164 (1993).</li><li>Stein, P., Schindler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+oocyte+microinjection,+maturation+and+ploidy+assessment.">Mouse oocyte microinjection, maturation and ploidy assessment.</a> Journal of Visualized Experiments. (53), (2011).</li><li>Nagy, A., Gertsenstein, M., Vintersten, K., Behringer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caesarean+section+and+fostering.">Caesarean section and fostering.</a> CSH Protocols. 2006 (2), (2006).</li><li>Chum, P. Y., Haimes, J. D., Andre, C. P., Kuusisto, P. K., Kelley, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genotyping+of+plant+and+animal+samples+without+prior+DNA+purification.">Genotyping of plant and animal samples without prior DNA purification.</a> Journal of Visualized Experiments. (67), (2012).</li><li>Bin Ali, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+pregnancy+and+birth+rates+with+routine+application+of+nonsurgical+embryo+transfer.">Improved pregnancy and birth rates with routine application of nonsurgical embryo transfer.</a> Transgenic Research. 23 (4), 691-695 (2014).</li><li>Liu, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrase-deficient+lentivirus:+opportunities+and+challenges+for+human+gene+therapy.">Integrase-deficient lentivirus: opportunities and challenges for human gene therapy.</a> Current Gene Therapy. 14 (5), 352-364 (2014).</li><li>Sauvain, M. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genotypic+features+of+lentivirus+transgenic+mice.">Genotypic features of lentivirus transgenic mice.</a> Journal of Virology. 82 (14), 7111-7119 (2008).</li></ol>

La capacità di integrare nel loro genoma ospite il lentivirus li rende un vettore ideale per consegna stabile del gene. Vettori lentivirali possono trasportare fino a 8,5 paio di kilobase (kbp) di materiale genetico che può ospitare promotori cellula-specifico o inducibili, marcatori di selezione o moiety fluorescente. Materiale genomico incorporato può replicare come parte del loro genoma ospite e regolato per esprimere o disattivare a intervalli di tempo desiderato. Questi vettori consentono un controllo spatiotempo...

Questo metodo fornisce istruzioni dettagliate per permeabilizing la zona pellucida di uova fecondata mouse per rendere le cellule embrionali accessibile per la consegna del gene di lentivirus. Lentivirus sono progettati dalla natura per la consegna efficiente del gene in cellule di mammifero. Essi infettano le cellule di divisione e divisione e integrare il genoma lentivirale nella loro ospite cromosomi1. La gamma delle cellule dell'ospite lentivirali prontamente viene espanso dal pseudotipizzazione il lentivirus ricombinanti con la glicoproteina del virus di stomatite vescicolare (VSV-G), dovuto il vasto trofismo della proteina VSV-G2. A seguito di trasduzione, geni lentivirali sono stabilmente integrati ed espresso come parte del loro cromosomi ospite creando uno strumento ideale per la generazione di animali transgenici. Se consegnato alle prime cellule embrionali di fase, il genoma lentivirale è replicato ed espresso nell'intero organismo. Trasduzione lentivirale ha portato alla produzione di ratto, topi, quaglie, pollo e maiale3,4,5,6,7 , tra le altre specie di transgenica. Il tipico metodo di consegna del gene lentivirali, tuttavia, richiede attrezzature specializzate e tecnici specializzati di superare la barriera di zona pellucida che incapsula gli embrioni in fase precoce. L'obiettivo generale di questo metodo è quello di descrivere come permeabilize la zona usando un laser per facilitare la consegna del gene lentivirali.
Le uova dei mammiferi sono circondate dalla zona pellucida che indurisce dopo fertilizzazione per proteggere le uova fecondate contro gamete e per limitare le interazioni ambientali8,9. La zona costituisce una barriera che allontana le cellule embrionali lentivirus fino a quando gli embrioni sono nati come una blastocisti. Coltivati del topo fecondate le uova si schiudono dopo 4 giorni e devono essere impiantati in topi pseudopregnant prima schiusa per lo sviluppo normale in cuccioli. Pertanto, per la trasduzione, lentivirus vengono microiniettati prima della schiusa dalla zona in cavità perivitellino, lo spazio tra la zona e le cellule embrionali.
La zona pellucida viene spesso rimosso per fecondazione in vitro di ovuli umani per aumentare il tasso di fertilizzazione10. Tuttavia, rimozione chimica di mouse zona pellucida negativamente colpisce lo sviluppo dell'embrione di topo ed è nociva per le cellule embrionali11,12. Altri metodi per la consegna del gene di uova fecondata mouse superare la barriera di zona pellucida di microiniezione diretta del DNA nella cellula nucleo13. Microiniezione pronuclei è un mezzo efficace di fornire geni agli embrioni. Tuttavia, poiché ogni embrione è tenuto in posizione singolarmente per la microiniezione, la pratica può essere laborioso e che richiede tempo per un utente inesperto.
Altri metodi quali l'elettroporazione e photoporation sono utili per transitori e a breve termine consegna del gene di topo fecondato uova14,15,16. Questi metodi sono ampiamente utilizzati per la consegna di ricombinasi e componenti CRISPR-Cas9. Tuttavia, elettroporazione e photoporation consegna dei geni non utilizzabile in modo efficiente per creare transgenica. Gli spermatozoi che vengono raccolti da epididimo forato del mouse possono anche essere microlavorati lentivirus e utilizzati per la fecondazione in vitro per la produzione di animali transgenici17,18,19, 20.
In questo protocollo, la consegna del gene lentivirali di embrioni di topo è facilitata da permeabilizing la zona utilizzando un laser. Il laser XYClone è stato sviluppato come sussidio per la coltivazione di cellule staminali embrionali22e in vitro fertilizzazione21 . Si tratta di un piccolo apparecchio che è semplice da configurare e facile da usare. Una volta installata su un microscopio, occupa lo spazio di una lente obiettiva e il software in dotazione permette di puntamento laser mentre guardando attraverso gli oculari del microscopio (Vedi protocollo: sezione 3). Una volta che la zona è perforata dal laser XYClone, lentivirus può essere introdotto nel terreno di coltura per gene consegna23. Lentivirus multiple potrebbero essere utilizzati per inviare simultaneamente diversi geni per costituzione cromosomica.
Questo protocollo descriverà come isolare e cultura mouse fecondato uova, viene illustrato l'utilizzo del laser per perforazione della zona pellucida e dimostra la trasduzione di cellule embrionali di topo da lentivirus.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>CD510B-1 plasmid</td>
			<td>System Biosciences</td>
			<td>CD510B-1</td>
			<td>used to package the lentivirus expressing EF1a-copGFP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethylpolysiloxane</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>DMPS5X</td>
			<td>culturing embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hyaluronidase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3506</td>
			<td>used to remove cumulus cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XYClone Laser</td>
			<td>Hamilton Thorne Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>perforating mouse fertilized eggs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-Surgical Embryo Transfer (NSET) Device</td>
			<td>ParaTechs</td>
			<td>60010</td>
			<td>NSET of embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KSOM medium</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MR-020P-5F</td>
			<td>culturing embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Composition of KSOM:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>mg/100mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>555</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>18.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>4.75</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4 7H2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>4.95</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2 2H2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>210</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>3.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na-Pyruvate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>2.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Lactic Acid, sodium salt</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.174mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10mM EDTA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>100&#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomycin</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>6.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5% phenol red</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.1mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>14.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Essential Amino Acids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-essential AA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.5mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M2 medium</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MR-015-D</td>
			<td>culturing embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Composition of M2:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>mg/100mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>25.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate (anhydrous)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>16.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>35.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate, Monobasic</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>16.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>35</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>553.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin, Bovine Fraction</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na-HEPES</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>54.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol Red</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvic Acid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>3.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Lactic Acid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>295</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

laser-assisted lentiviral gene delivery to mouse fertilized eggs

Lentivirus sono efficienti vettori per la consegna del gene in cellule di mammifero. A seguito di trasduzione, il genoma lentivirale stabile è incorporato nel cromosoma ospite ed è passato sopra alla progenie. Pertanto, essi sono vettori ideale per la creazione di linee cellulari stabilizzate, in vivo consegna degli indicatori e trasduzione di uova di singola cellula fecondata per creare animali transgenici. Tuttavia, mouse fecondato uova ed embrioni in fase precoce sono protetti dalla zona pellucida, una matrice di glicoproteina che forma una barriera contro la consegna del gene lentivirali. Lentivirus sono troppo grandi per penetrare la zona e sono in genere consegnati dal microinjection di particelle virali in cavità perivitellino, lo spazio tra la zona e le cellule embrionali. Il requisito per i tecnologi altamente qualificati e attrezzature specializzate è ridotto al minimo l'uso di lentivirus per consegna del gene di embrioni di topo. Questo articolo descrive un protocollo per permeabilizing le uova fecondata del mouse di perforare la zona con un laser. Perforazione laser non comporta alcun danno agli embrioni e permette lentivirus ottenere l'accesso alle cellule embrionali per consegna del gene. Trasdotte embrioni possono svilupparsi in blastocisti in vitro e se impiantati nei topi pseudopregnant, svilupparsi in cuccioli transgenici. Il laser utilizzato in questo protocollo è efficace e facile da usare. Geni consegnati da lentivirus stabile incorporano nelle cellule embrionali di topo e sono germinale trasmissibile. Si tratta di un metodo alternativo per la creazione di topi transgenici che non richiede nessun micromanipolazione e microiniezione di uova fecondate.

Sviluppo di uova mouse isolato/trasdotte fertilizzato può essere verificato sotto il microscopio ogni giorno (Figura 1). Gli embrioni sani si sviluppano in blastocisti entro 3-4 giorni. In questo protocollo, 60 – 70% degli embrioni non trattati sviluppano in blastocisti23. Su 114 embrioni trasdotte traforato al laser, 54 sviluppato in blastocisti (tasso del 47%) e 46 blastocisti espresso GFP (46/54 = 85%)23.<...

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Laser-assisted Lentiviral Gene Delivery to Mouse Fertilized Eggs

Mouse di uova fecondate ed embrioni in fase precoce sono protetti dalla zona pellucida, una matrice di glicoproteina che forma una barriera contro la consegna del gene. Questo articolo descrive un protocollo per la zona di perforazione con un laser per trasdurre cellule embrionali con vettori lentivirali e creare topi transgenici.

Laser-assistita lentivirali Gene consegna al Mouse fecondate le uova

Lentiviruses are efficient vectors for gene delivery to mammalian cells. Following transduction, the lentiviral genome is stably incorporated into the ...

Questo è un metodo alternativo e facile da usare per fornire geni di interesse alle uova di topo fecondate tramite perforazione laser della zona pellucida e consegna del gene lentivirale. La perforazione assistita da laser della procedura del donatore di topi può essere applicabile anche alle uova fecondate di altre specie per facilitare l'ingresso di altri tipi di virus o reagenti di trasfezione. Il principale vantaggio di questa tecnica è che non richiede competenze specializzate per la micromanipolazione e la micro iniezione delle uova di topo fecondate.A dimostrare la procedura di isolamento delle uova di topo fecondato sarà Page Myers, una ricercatrice della filiale di Medicina Comparata del NIEHS. Da 16 a 24 ore dopo l'accoppiamento, isolare le ovaie e gli ovadotti da topi femmine con spine vaginali, secondo protocolli standard. Quando tutti i tessuti sono stati raccolti, strappare l'ampolla di ogni ovaia e rilasciare le uova fecondate, circondate da cellule cumulate, e trasferire le uova in cellule cumulate in un piatto di 35 millimetri contenente una x ialuronidasi in mezzo M2 fresco, per un'incubazione da tre a cinque minuti a temperatura ambiente.Pipettare le uova alcune volte per rilasciare le cellule cumule e trasferire le uova in un nuovo piatto da 35 millimetri contenente mezzo M2, con pipettazione per lavare via l'enzima. Successivamente, trasferire le uova lavate in un piatto da 35 millimetri contenente mezzo ottimizzato simplex di potassio, o KSOM, e pipetta per lavare via il mezzo M2 rimanente e l'ialuronidasi. Quindi, trasferire le uova in piastre trattate con coltura tissutale di 35 millimetri sementi con 50 microlitri di KSOM e due millilitri di dimetilpolisiloxano per un equilibrazione di due ore a 37 gradi Celsius, 5% di anidride carbonica e ossigeno e 90% azoto.Mentre le uova sono nell'incubatrice, impostare e calibrare il laser XYClone, secondo le raccomandazioni del produttore. Quando le uova sono pronte, posizionare la prima piastra di caduta sullo stadio del microscopio laser e mettere a fuoco manualmente la zona pellucida. Dopo aver confermato che la luce led laser è visibile attraverso l'obiettivo, spostare lo stadio del microscopio per colpire la zona con il laser a LED e utilizzare il software del computer per impostare il laser XYClone su 250 microsecondi.Regolare le dimensioni della luce a LED in base alle dimensioni appropriate e perforare la zona pellucida di ogni uovo tre volte con il laser per produrre tre fori da 10 micrometri. È fondamentale eseguire rapidamente la perforazione, ma con attenzione, poiché le uova fecondate non possono tenere al di fuori dell'incubatrice per più di 15 minuti. Quindi, restituire le uova perforate all'incubatrice per altre due ore.Al termine della seconda incubazione, trattare la goccia KSOM da 50 microlitri con due microlitri di lentivirus concentrato senza miscelazione. E riportare le uova nell'incubatrice per quattro giorni. Quando le uova si sono sviluppate in blastocisti, utilizzare un dispositivo di trasferimento dell'embrione non chirurgico, per depositare circa 10-15 embrioni in circa due microlitri di KSOM.17 giorni dopo il trasferimento dell'embrione, consentire al topo incinta di partorire naturalmente o raccogliere i neonati per sezione cesarea se necessario. Quindi, raccogliere il tessuto dai cuccioli per il genotipizzazione, per determinare il tasso di transgenesi. Lo sviluppo isolato e trasdotto di uova fecondate con topo può essere controllato al microscopio ogni giorno.Dal 60 al 70% degli embrioni sani e non trattati si trasformano in blastocsti entro tre o quattro giorni. Mentre circa il 47% degli embrioni trasdotti perforati al laser si sviluppa in blastocsti, l'85% dei quali esprime il gene trasdotto di interesse. Puntare il laser a assottigliare la zona, invece di creare un foro, permette agli embrioni in via di sviluppo di beneficiare di una zona pellucida intatta e incapsulante pur rimanendo permissiva alla trasduzione lentivirale.La trasduzione con un lentivirus ricombinante, che esprime il copepode GFP da un fattore di allungamento 1A promoter induce molteplici integrazioni lentivirali e un'alta espressione di GFP sotto una lampada a LED blu. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che, mentre la capacità dei lentivirus di integrarsi nel genoma ospite li rende un potente strumento per il parto genico stabile, ma l'integrazione casuale può anche introdurre mutazioni inserizionali. Questa tecnica potrebbe consentire ai ricercatori nel campo della genetica di sviluppare rapidamente modelli animali transgenici per lo studio delle malattie per la produzione di proteine in vivo o per studi genici funzionali.Seguendo questa procedura, altri metodi come l'immunoistochimica possono essere eseguiti su campioni di tessuto isolati da cuccioli trasdotti per rispondere a domande aggiuntive sulla posizione e l'estensione dell'espressione genica in vari tessuti di interesse. Non dimenticare che lavorare con i lentivirus può essere estremamente pericoloso. Pertanto, si prega di seguire le linee guida istituzionali per lavorare con i lentivirus.Indossare indumenti protettivi personali e decontaminare tutti i rifiuti prima dello smaltimento.

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