Name: laser-assisted lentiviral gene delivery to mouse fertilized eggs
Uploaded: 2018-11-01T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Laser-assisted Lentiviral Gene Delivery to Mouse Fertilized Eggs at JoVE.com

Denne forskningen ble støttet av Intramural forskningsprogrammet av National Institute of Health (NIH), National Institute of Environmental Health Sciences (NIEHS). Vi er takknemlige til Dr. Robert Petrovich og Dr. Jason Williams for kritisk lesing av manuskriptet og nyttige råd. Vi ønsker også å erkjenne og takker Dr. Bernd Gloss, Knockout kjernen, Flow cytometri anlegget, fluorescens mikroskopi og Imaging Center og komparativ medisin gren fasiliteter i NIEHS for deres teknisk bidrag. Vi vil gjerne takke Mr. David Goulding i sammenlignende medisin grenen og Ms. Lois Wyrick av Imaging Center på NIEHS for å gi oss med bilder og illustrasjoner.

Alle dyr prosedyrer og behandlinger i denne protokollen ble fulgt NIH/NIEHS dyr omsorg retningslinjene og ble godkjent av dyr omsorg og bruk Committee (ACUC) på NIH/NIEHS, dyr protokollen 2010-0004.
1. forberedelser
<ol><li>Forberede/kjøpe rekombinant ikke-spre lentiviruses bærer din genet av interesse. I denne studien, lentivirus SBI511 uttrykke hele grønne fluorescerende protein (copGFP, forkortet til GFP) fra en forlengelse faktor 1a promoter ble brukt for signaltransduksjon. Standard...

<ol>
	<li>Sakuma, T., Barry, M. A., Ikeda, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentiviral+vectors:+basic+to+translational.">Lentiviral vectors: basic to translational.</a> Biochemical Journal. 443 (3), 603-618 (2012).</li><li>Salmon, P., Trono, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+and+titration+of+lentiviral+vectors.">Production and titration of lentiviral vectors.</a> Current Protocols in Human Genetics. , (2007).</li><li>Lois, C., Hong, E. J., Pease, S., Brown, E. J., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germline+transmission+and+tissue-specific+expression+of+transgenes+delivered+by+lentiviral+vectors.">Germline transmission and tissue-specific expression of transgenes delivered by lentiviral vectors.</a> Science. 295 (5556), 868-872 (2002).</li><li>Filipiak, W. E., Saunders, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+transgenic+rat+production.">Advances in transgenic rat production.</a> Transgenic Research. 15 (6), 673-686 (2006).</li><li>McGrew, M. J., Sherman, A., Lillico, S. G., Taylor, L., Sang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+conservation+between+rodents+and+chicken+of+regulatory+sequences+driving+skeletal+muscle+gene+expression+in+transgenic+chickens.">Functional conservation between rodents and chicken of regulatory sequences driving skeletal muscle gene expression in transgenic chickens.</a> BMC Developmental Biology. 10, 26 (2010).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+transgenic+pigs+mediated+by+pseudotyped+lentivirus+and+sperm.">Production of transgenic pigs mediated by pseudotyped lentivirus and sperm.</a> PLoS One. 7 (4), e35335 (2012).</li><li>Zhang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+quail+production+by+microinjection+of+lentiviral+vector+into+the+early+embryo+blood+vessels.">Transgenic quail production by microinjection of lentiviral vector into the early embryo blood vessels.</a> PLoS One. 7 (12), e50817 (2012).</li><li>Wassarman, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zona+pellucida+glycoproteins.">Zona pellucida glycoproteins.</a> Annul Review of Biochemistry. 57, 415-442 (1988).</li><li>Clift, D., Schuh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Restarting+life:+fertilization+and+the+transition+from+meiosis+to+mitosis.">Restarting life: fertilization and the transition from meiosis to mitosis.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (9), 549-562 (2013).</li><li>Fong, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blastocyst+transfer+after+enzymatic+treatment+of+the+zona+pellucida:+improving+in-vitro+fertilization+and+understanding+implantation.">Blastocyst transfer after enzymatic treatment of the zona pellucida: improving in-vitro fertilization and understanding implantation.</a> Human Reproduction. 13 (10), 2926-2932 (1998).</li><li>Nijs, M., Van Steirteghem, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+different+isolation+procedures+for+blastomeres+from+two-cell+mouse+embryos.">Assessment of different isolation procedures for blastomeres from two-cell mouse embryos.</a> Human Reproduction. 2 (5), 421-424 (1987).</li><li>Ribas, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+zona+pellucida+removal+on+DNA+methylation+in+early+mouse+embryos.">Effect of zona pellucida removal on DNA methylation in early mouse embryos.</a> Biology of Reproduction. 74 (2), 307-313 (2006).</li><li>Gordon, J. W., Scangos, G. A., Plotkin, D. J., Barbosa, J. A., Ruddle, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+transformation+of+mouse+embryos+by+microinjection+of+purified+DNA.">Genetic transformation of mouse embryos by microinjection of purified DNA.</a> Proceedings of National Academy of Science U S A. 77 (12), 7380-7384 (1980).</li><li>Kaneko, T., Sakuma, T., Yamamoto, T., Mashimo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+knockout+by+electroporation+of+engineered+endonucleases+into+intact+rat+embryos.">Simple knockout by electroporation of engineered endonucleases into intact rat embryos.</a> Scientific Reports. 4, 6382 (2014).</li><li>Hosokawa, Y., Ochi, H., Iino, T., Hiraoka, A., Tanaka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoporation+of+biomolecules+into+single+cells+in+living+vertebrate+embryos+induced+by+a+femtosecond+laser+amplifier.">Photoporation of biomolecules into single cells in living vertebrate embryos induced by a femtosecond laser amplifier.</a> PLoS One. 6 (11), e27677 (2011).</li><li>Horii, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+microinjection+methods+for+generating+knockout+mice+by+CRISPR/Cas-mediated+genome+engineering.">Validation of microinjection methods for generating knockout mice by CRISPR/Cas-mediated genome engineering.</a> Scientific Reports. 4, 4513 (2014).</li><li>Hamra, F. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+transgenic+rats+by+lentiviral+transduction+of+male+germ-line+stem+cells.">Production of transgenic rats by lentiviral transduction of male germ-line stem cells.</a> Proceedings of National Academy of Science U S A. 99 (23), 14931-14936 (2002).</li><li>Kanatsu-Shinohara, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+transgenic+rats+via+lentiviral+transduction+and+xenogeneic+transplantation+of+spermatogonial+stem+cells.">Production of transgenic rats via lentiviral transduction and xenogeneic transplantation of spermatogonial stem cells.</a> Biology of Reproduction. 79 (6), 1121-1128 (2008).</li><li>Dann, C. T., Garbers, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+knockdown+rats+by+lentiviral+transduction+of+embryos+with+short+hairpin+RNA+transgenes.">Production of knockdown rats by lentiviral transduction of embryos with short hairpin RNA transgenes.</a> Methods in Molecular Biology. 450, 193-209 (2008).</li><li>Chandrashekran, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+generation+of+transgenic+mice+by+lentivirus-mediated+modification+of+spermatozoa.">Efficient generation of transgenic mice by lentivirus-mediated modification of spermatozoa.</a> FASEB Journal. 28 (2), 569-576 (2014).</li><li>Woods, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser-assisted+in+vitro+fertilization+facilitates+fertilization+of+vitrified-warmed+C57BL/6+mouse+oocytes+with+fresh+and+frozen-thawed+spermatozoa,+producing+live+pups.">Laser-assisted in vitro fertilization facilitates fertilization of vitrified-warmed C57BL/6 mouse oocytes with fresh and frozen-thawed spermatozoa, producing live pups.</a> PLoS One. 9 (3), e91892 (2014).</li><li>Tanaka, N., Takeuchi, T., Neri, Q. V., Sills, E. S., Palermo, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser-assisted+blastocyst+dissection+and+subsequent+cultivation+of+embryonic+stem+cells+in+a+serum/cell+free+culture+system:+applications+and+preliminary+results+in+a+murine+model.">Laser-assisted blastocyst dissection and subsequent cultivation of embryonic stem cells in a serum/cell free culture system: applications and preliminary results in a murine model.</a> Journal of Translational Medicine. 4, 20 (2006).</li><li>Martin, N. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=En+masse+lentiviral+gene+delivery+to+mouse+fertilized+eggs+via+laser+perforation+of+zona+pellucida.">En masse lentiviral gene delivery to mouse fertilized eggs via laser perforation of zona pellucida.</a> Transgenic Research. 27 (1), 39-49 (2018).</li><li>Lawitts, J. A., Biggers, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+of+preimplantation+embryos.">Culture of preimplantation embryos.</a> Methods in Enzymology. 225, 153-164 (1993).</li><li>Stein, P., Schindler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+oocyte+microinjection,+maturation+and+ploidy+assessment.">Mouse oocyte microinjection, maturation and ploidy assessment.</a> Journal of Visualized Experiments. (53), (2011).</li><li>Nagy, A., Gertsenstein, M., Vintersten, K., Behringer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caesarean+section+and+fostering.">Caesarean section and fostering.</a> CSH Protocols. 2006 (2), (2006).</li><li>Chum, P. Y., Haimes, J. D., Andre, C. P., Kuusisto, P. K., Kelley, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genotyping+of+plant+and+animal+samples+without+prior+DNA+purification.">Genotyping of plant and animal samples without prior DNA purification.</a> Journal of Visualized Experiments. (67), (2012).</li><li>Bin Ali, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+pregnancy+and+birth+rates+with+routine+application+of+nonsurgical+embryo+transfer.">Improved pregnancy and birth rates with routine application of nonsurgical embryo transfer.</a> Transgenic Research. 23 (4), 691-695 (2014).</li><li>Liu, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrase-deficient+lentivirus:+opportunities+and+challenges+for+human+gene+therapy.">Integrase-deficient lentivirus: opportunities and challenges for human gene therapy.</a> Current Gene Therapy. 14 (5), 352-364 (2014).</li><li>Sauvain, M. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genotypic+features+of+lentivirus+transgenic+mice.">Genotypic features of lentivirus transgenic mice.</a> Journal of Virology. 82 (14), 7111-7119 (2008).</li></ol>

Evne til lentiviruses å integrere deres vert genomet gjør dem en ideell vektor for stabil gen levering. Lentiviral vektorer kan bære opptil 8,5 kilobase par (kbp) av genetisk materiale som rommer celle-spesifikke eller induserbart arrangører, markørene eller fluorescerende moieties. Genomisk materiale replikeres som del av deres vert genom og reguleres uttrykkelig eller deaktivere på ønsket tidspunkt. Disse vektorer tillate spatiotemporal kontroll over genuttrykk på ulike stadier av utvikling og merkevare lentivi...

Denne metoden gir detaljerte instruksjoner for permeabilizing zona pellucida musen befruktet egg å gjøre embryonale celler tilgjengelig for gen levering av lentiviruses. Lentiviruses er designet av naturen for effektiv gen levering til pattedyrceller. De infisere dele og ikke dele celler og integrere lentiviral genomet i deres vert kromosomene1. Lentiviral vert celleområdet utvides lett ved pseudotyping av rekombinant lentivirus med vesicular stomatitt virus glykoprotein (VSV-G), på grunn av den brede tropism VSV-G protein2. Etter transduction, lentiviral gener er stabilt integrert og uttrykt som en del av deres vert kromosomene skaper et ideelt verktøy for generering av transgene dyr. Hvis leveres til tidlig stadium embryonale celler, er lentiviral genomet replikert og uttrykt i hele organismen. Lentiviral signaltransduksjon har ført til at mus, rotte, kylling, Vaktel, og gris3,4,5,6,7 blant andre arter av transgenics. Den typiske metoden for lentiviral gen levering, men krever dyktige teknikere og spesialisert utstyr for å overvinne den zona pellucida barrieren som omslutter de tidlig stadium embryoene. Det overordnede målet med denne metoden er å beskrive hvordan permeabilize zona bruker en laser til å lette lentiviral gen levering.
Pattedyr egg er omgitt av den zona pellucida som stivner etter befruktning å beskytte befruktede egg mot polyspermy og begrense miljømessige interaksjoner8,9. Zona danner en barriere som holder lentiviruses fra embryonale celler før embryoene er klekket som en blastocyst. Kultivert musen befruktede eggene klekkes etter 4 dager og må bli implantert i pseudopregnant mus før klekking for normal utvikling i pups. Derfor for transduction, er lentiviruses microinjected før klekking fra zona i perivitelline hulrom, avstanden mellom zona og embryonale celler.
Den zona pellucida er ofte fjernet for i vitro befruktning av menneskelig egg å øke befruktning rate10. Imidlertid kjemiske fjerning av musen zona pellucida negativt påvirker musen embryo utvikling og er skadelig for embryonale celler11,12. Andre metoder for gen levering til musen befruktet egg overvinne zona pellucida barrieren av direkte microinjection DNA i cellen kjernen13. Pronuclear microinjection er en effektiv måte å levere gener til embryoer. Siden hver embryoet holdes på plass for microinjection, kan imidlertid praksis arbeidskrevende og tidkrevende for en nybegynner.
Andre metoder som electroporation og photoporation er nyttig for forbigående kortsiktige gen levering til musen befruktet egg14,15,16. Disse metodene er mye brukt for å levere CRISPR-Cas9 komponenter og recombinases. Imidlertid kan ikke electroporation og photoporation levering av gener brukes effektivt til å opprette transgenics. Spermatozoa som er samlet inn fra punktert musen bitestikkel kan også transduced av lentiviruses og gjelder i vitro fertilisering produsere transgene dyr17,18,19, 20.
I denne protokollen, er lentiviral gen levering til mouse embryoer tilrettelagt av permeabilizing zona ved hjelp av en laser. XYClone laser ble utviklet som et hjelpemiddel i vitro fertilisering21 og dyrking av embryonale stamceller22. Det er en liten apparater som er enkel å konfigurere og enkel å bruke. Når installert på et mikroskop, det opptar for en linsen og den medfølgende programvaren tillater sikter laser mens du ser gjennom mikroskop okularene (se protokoll: avsnitt 3). Når zona er perforert av XYClone laser, kan lentiviruses bli introdusert i kultur media for gen levering23. Flere lentiviruses kan brukes samtidig levere flere gener for chromosomal innlemmelse.
Denne protokollen vil beskrive hvordan du isolerer og kultur mus befruktede egg, illustrerer bruken av laser for perforering av zona pellucida, og demonstrerer signaltransduksjon mus embryonale celler ved lentiviruses.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>CD510B-1 plasmid</td>
			<td>System Biosciences</td>
			<td>CD510B-1</td>
			<td>used to package the lentivirus expressing EF1a-copGFP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethylpolysiloxane</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>DMPS5X</td>
			<td>culturing embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hyaluronidase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3506</td>
			<td>used to remove cumulus cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XYClone Laser</td>
			<td>Hamilton Thorne Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>perforating mouse fertilized eggs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-Surgical Embryo Transfer (NSET) Device</td>
			<td>ParaTechs</td>
			<td>60010</td>
			<td>NSET of embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KSOM medium</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MR-020P-5F</td>
			<td>culturing embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Composition of KSOM:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>mg/100mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>555</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>18.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>4.75</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4 7H2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>4.95</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2 2H2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>210</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>3.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na-Pyruvate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>2.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Lactic Acid, sodium salt</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.174mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10mM EDTA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>100&#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomycin</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>6.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5% phenol red</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.1mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>14.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Essential Amino Acids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-essential AA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.5mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M2 medium</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MR-015-D</td>
			<td>culturing embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Composition of M2:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>mg/100mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>25.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate (anhydrous)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>16.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>35.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate, Monobasic</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>16.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>35</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>553.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin, Bovine Fraction</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na-HEPES</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>54.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol Red</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvic Acid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>3.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Lactic Acid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>295</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

laser-assisted lentiviral gene delivery to mouse fertilized eggs

Lentiviruses er effektiv vektorer for gen levering til pattedyrceller. Etter transduction, lentiviral genomet er stabilt integrert i det vert kromosomet og sendes videre til avkom. Dermed er de ideelle vektorer for etablering av stabil cellelinjer, i vivo levering av indikatorer og Albin på én celle befruktet egg til å opprette transgene dyr. Men musen befruktede egg og tidlig stadium embryo er beskyttet av zona pellucida, en glykoprotein matrise som danner en barriere mot lentiviral gen levering. Lentiviruses er for store til å trenge zona og er vanligvis levert av microinjection av virus partikler i perivitelline hulrom, avstanden mellom zona og embryonale celler. Behovet for svært dyktige teknikere og spesialisert utstyr har minimert bruken av lentiviruses genet levering til mouse embryoer. Denne artikkelen beskriver en protokoll for permeabilizing musen befruktet egg av perforating i zona med en laser. Laser-perforering resultere ikke i skade å embryoer og lar lentiviruses å få tilgang til embryonale celler for gen levering. Transduced embryo kan utvikle seg til blastocysten i vitro, og hvis implantert i pseudopregnant mus, utvikle seg til transgene pups. Laseren som brukes i denne protokollen er effektivt og brukervennlig. Gener levert av lentiviruses stabilt innlemme i mus embryonale celler og er germline overført. Dette er en alternativ metode for oppretting av transgene mus som krever ingen micromanipulation og microinjection av befruktet egg.

Utviklingen av isolert/transduced musen befruktet egg kan kontrolleres under mikroskopet daglig (figur 1). Sunn embryo utvikle i blastocysten innen 3-4 dager. Denne protokollen utvikle 60-70% av ubehandlet embryo i blastocysten23. Ut av 114 laser-perforert transduced embryoer, 54 utviklet i blastocysten (hastighet på 47%) og 46 blastocysts uttrykt GFP (46/54 = 85%)23.
<p class="jove_content" fo:keep-togethe...

Watch this Scientific Journal Video about Laser-assisted Lentiviral Gene Delivery to Mouse Fertilized Eggs at JoVE.com

Laser-assisted Lentiviral Gene Delivery to Mouse Fertilized Eggs

Mus befruktede egg og tidlig stadium embryo er beskyttet av zona pellucida, en glykoprotein matrise som danner en barriere mot gen levering. Denne artikkelen beskriver en protokoll for perforating i zona med en laser transduce embryonale celler med lentiviral vektorer og opprette transgene mus.

Laser-assistert Lentiviral gen levering til musen befruktede egg

Lentiviruses are efficient vectors for gene delivery to mammalian cells. Following transduction, the lentiviral genome is stably incorporated into the ...

Dette er en alternativ og enkel å bruke metode for å levere gener av interesse til befruktede museegg via laserperforering av zona pellucida og lentiviral genlevering. Laserassistert perforering av musen donor prosedyren kan også være aktuelt for befruktede egg av andre arter for å lette oppføring av andre typer virus eller transfection reagenser. Den største fordelen med denne teknikken er at det ikke krever spesialiserte ferdigheter for mikromanipulering og mikroinjeksjon av befruktede museegg.Viser befruktet mus egg isolasjon prosedyre vil være Page Myers, en forsker fra Comparative Medicine grenen ved NIEHS. 16 til 24 timer etter parring, isolere eggstokkene og eggstokkene fra kvinnelige mus med vaginale plugger, i henhold til standardprotokoller. Når alle vevene er samlet, rive ampulla av hver eggstokk fra hverandre, og slipp befruktede egg, omgitt av cumulous celler, og overføre eggene i cumulous celler til en 35 millimeter tallerken som inneholder en x hyaluronidase i frisk M2 medium, for en tre til fem minutters inkubasjon ved romtemperatur.Pipette eggene et par ganger for å frigjøre de cumulous cellene, og overføre eggene til en ny 35 millimeter tallerken som inneholder M2 medium, med pipettering for å vaske av enzymet. Deretter overfører du de vasket eggene til en 35 millimeter tallerken som inneholder kalium simplex optimalisert medium, eller KSOM, og pipette for å vaske av det gjenværende M2-mediet og hyaluronidase. Deretter overfører eggene til 35 millimeter vevskulturbehandlede plater seeded med 50 mikroliter KSOM og to milliliter dimetylpolysiloxane for en to timers likevekt ved 37 grader Celsius, 5% karbondioksid og oksygen og 90% nitrogen.Mens eggene er i inkubatoren, sett opp og kalibrer XYClone laseren, i henhold til produsentens anbefalinger. Når eggene er klare, plasser den første drop-platen på lasermikroskopstadiet, og fokuser zonna pellucida manuelt. Etter å ha bekreftet at laser-LED-lyset er synlig gjennom målet, flytter du mikroskopstadiet for å målrette zona med LED-laseren, og bruker dataprogramvaren til å sette XYClone-laseren til 250 mikrosekunder.Juster LED-lysstørrelsen til de riktige dimensjonene, og perforer zona pellucida av hvert egg tre ganger med laseren for å produsere tre 10-mikrometerhull. Det er viktig å utføre perforeringen raskt, men forsiktig, da de befruktede eggene ikke kan holde utenfor inkubatoren i mer enn 15 minutter. Deretter returnerer du de perforerte eggene til inkubatoren i ytterligere to timer.På slutten av den andre inkubasjonen, behandle 50 mikroliter KSOM-dråpen med to mikroliter konsentrert lentivirus uten blanding. Og returner eggene til inkubatoren i fire dager. Når eggene har utviklet seg til blastocysts, bruk en ikke-kirurgisk embryooverføringsenhet, for å deponere ca 10-15 embryoer i omtrent to mikroliter av KSOM.17 dager etter embryooverføringen, la den gravide musen føde naturlig eller samle nyfødte ved keisersnitt etter behov. Deretter samler vev fra valpene for genotyping, for å bestemme frekvensen av transgenese. Isolert og transdusert musebefruktet eggutvikling kan kontrolleres under mikroskopet daglig.60 til 70% av friske, ubehandlede embryoer utvikler seg til blastocysts innen tre til fire dager. Mens ca 47% av laserperforerte, transduserte embryoer utvikler seg til blastocysts, hvorav 85% uttrykker det tranduserte genet av interesse. Med sikte på laseren for å tynne zona, i stedet for å skape et hull, gjør det mulig for de utviklende embryoene å dra nytte av en intakt, innkapsling zona pellucida mens de forblir tillatt til lentiviral transduksjon.Transduksjon med et rekombinant lentivirus, uttrykker copepod GFP fra en forlengelsesfaktor 1A-promotor induserer flere lentivirale integrasjoner, og et høyt uttrykk for GFP under en blå LED-lampe. Mens du prøver denne prosedyren, er det viktig å huske at, mens lentivirusenes evne til å integreres i vertsgenomet gjør dem til et kraftig verktøy for stabil genlevering, men tilfeldig integrasjon kan også introdusere innsettende mutasjoner. Denne teknikken kan gjøre det mulig for forskere innen genetikk å raskt utvikle transgene dyremodeller for studiet av sykdom for in vivo proteinproduksjon, eller for funksjonelle genstudier.Etter denne prosedyren kan andre metoder som immunohistochemistry utføres på isolerte vevsprøver fra transduserte valper for å svare på flere spørsmål om plasseringen og omfanget av genuttrykk i ulike vev av interesse. Ikke glem at arbeid med lentivirus kan være ekstremt farlig. Følg derfor dine institusjonelle retningslinjer for arbeid med lentivirus.Bruk personlige verneklær og dekontaminer alt avfall før deponering.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Genetics

Viruses

SCIENTISTS IN ACTION

Windowing Chicken Eggs for Developmental Studies

The study of development has been greatly aided by the use of the chick embryo as an experimental model.  The ease of accessibility of the embryo has ...

Obtaining Eggs from Xenopus laevis Females

The eggs of Xenopus laevis intact, lysed, and/or fractionated are useful for a wide variety of experiments. This protocol shows how to induce egg laying, ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models.  This paper describes the development of an orthotopic mouse model ...

Isolation and Culture of Cells from the Nephrogenic Zone of the Embryonic Mouse Kidney

Embryonic development of the kidney has been extensively studied both as a model for epithelial-mesenchymal interaction in organogenesis and  to gain ...

Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides

Bruke SecM Arrest sekvens som et verktøy for å isolere ribosom Innbundne polypeptider

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway ...

Intraductal Injection for Localized Drug Delivery to the Mouse Mammary Gland

Intraductal Injection for Lokalisert Drug Deli til musemelkekjertlene

Herein we describe a protocol to deliver various reagents to the mouse mammary gland via intraductal injections. Localized drug delivery and knock-down of ...

Transient Expression of Proteins by Hydrodynamic Gene Delivery in Mice

Gående uttrykk av proteiner ved Hydrodynamisk Gene Levering i Mus

Efficient expression of transgenes in vivo is of critical importance in studying gene function and developing treatments for diseases. Over the past ...

Phage-mediated Delivery of Targeted sRNA Constructs to Knock Down Gene Expression in E. coli

Phage-mediated Delivery of Targeted sRNA Constructs to Knock Down Gene Expression in E. coli

Fag-mediert Levering av målrettet Srna Konstruerer å slå ned Gene Expression in<em&gt; E. coli</em

RNA-mediated knockdowns are widely used to control gene expression. This versatile family of techniques makes use of short RNA (sRNA) that can be ...

Laser-assisted Microdissection (LAM) as a Tool for Transcriptional Profiling of Individual Cell Types

Laser-assisted Microdissection LAM as a Tool for Transcriptional Profiling of Individual Cell Types

Laser-assistert mikrodisseksjon (LAM) som et verktøy for Transkripsjonell Profilering av individuelle celletyper

The understanding of developmental processes at the molecular level requires insights into transcriptional regulation, and thus the transcriptome, at the ...