Name: laser-assisted lentiviral gene delivery to mouse fertilized eggs
Uploaded: 2018-11-01T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Laser-assisted Lentiviral Gene Delivery to Mouse Fertilized Eggs at JoVE.com

Esta pesquisa foi apoiada pelo programa de pesquisa Intramural do Instituto Nacional de saúde (NIH), National Institute de Ciências de saúde ambiental (NIEHS). Nós estamos gratos ao Dr. Robert Petrovich e Dr. Jason Williams para leitura crítica do manuscrito e conselhos úteis. Também gostaríamos de reconhecer e agradecer o Dr. Bernd Gloss, o núcleo de nocaute, a facilidade de citometria de fluxo, a microscopia de fluorescência e centro de imagem e as instalações da filial de medicina comparativa do NIEHS por suas contribuições técnicas. Gostaríamos de agradecer o Sr. David Goulding do ramo de medicina comparativa e MS. Lois Wyrick do centro de imagem no NIEHS para fornecer-nos com fotografias e ilustrações.

Todos os animais procedimentos e tratamentos utilizados neste protocolo estavam em conformidade com as orientações de cuidados com animais de NIH/NIEHS e foram aprovados pelo Animal Care e Comissão de utilização (ACUC) no NIH/NIEHS, Animal protocolo 2010-0004.
1. preparações
<ol><li>Prepare-se compra e recombinação não-propagação lentivírus carreg o gene de interesse. Neste estudo, lentivirus SBI511 expressando a proteína fluorescente verde copépode (copGFP; abreviado para GFP...

<ol>
	<li>Sakuma, T., Barry, M. A., Ikeda, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentiviral+vectors:+basic+to+translational.">Lentiviral vectors: basic to translational.</a> Biochemical Journal. 443 (3), 603-618 (2012).</li><li>Salmon, P., Trono, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+and+titration+of+lentiviral+vectors.">Production and titration of lentiviral vectors.</a> Current Protocols in Human Genetics. , (2007).</li><li>Lois, C., Hong, E. J., Pease, S., Brown, E. 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K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+transgenic+rats+by+lentiviral+transduction+of+male+germ-line+stem+cells.">Production of transgenic rats by lentiviral transduction of male germ-line stem cells.</a> Proceedings of National Academy of Science U S A. 99 (23), 14931-14936 (2002).</li><li>Kanatsu-Shinohara, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+transgenic+rats+via+lentiviral+transduction+and+xenogeneic+transplantation+of+spermatogonial+stem+cells.">Production of transgenic rats via lentiviral transduction and xenogeneic transplantation of spermatogonial stem cells.</a> Biology of Reproduction. 79 (6), 1121-1128 (2008).</li><li>Dann, C. T., Garbers, D. 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E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser-assisted+in+vitro+fertilization+facilitates+fertilization+of+vitrified-warmed+C57BL/6+mouse+oocytes+with+fresh+and+frozen-thawed+spermatozoa,+producing+live+pups.">Laser-assisted in vitro fertilization facilitates fertilization of vitrified-warmed C57BL/6 mouse oocytes with fresh and frozen-thawed spermatozoa, producing live pups.</a> PLoS One. 9 (3), e91892 (2014).</li><li>Tanaka, N., Takeuchi, T., Neri, Q. V., Sills, E. S., Palermo, G. 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A., Biggers, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+of+preimplantation+embryos.">Culture of preimplantation embryos.</a> Methods in Enzymology. 225, 153-164 (1993).</li><li>Stein, P., Schindler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+oocyte+microinjection,+maturation+and+ploidy+assessment.">Mouse oocyte microinjection, maturation and ploidy assessment.</a> Journal of Visualized Experiments. (53), (2011).</li><li>Nagy, A., Gertsenstein, M., Vintersten, K., Behringer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caesarean+section+and+fostering.">Caesarean section and fostering.</a> CSH Protocols. 2006 (2), (2006).</li><li>Chum, P. Y., Haimes, J. D., Andre, C. P., Kuusisto, P. K., Kelley, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genotyping+of+plant+and+animal+samples+without+prior+DNA+purification.">Genotyping of plant and animal samples without prior DNA purification.</a> Journal of Visualized Experiments. (67), (2012).</li><li>Bin Ali, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+pregnancy+and+birth+rates+with+routine+application+of+nonsurgical+embryo+transfer.">Improved pregnancy and birth rates with routine application of nonsurgical embryo transfer.</a> Transgenic Research. 23 (4), 691-695 (2014).</li><li>Liu, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrase-deficient+lentivirus:+opportunities+and+challenges+for+human+gene+therapy.">Integrase-deficient lentivirus: opportunities and challenges for human gene therapy.</a> Current Gene Therapy. 14 (5), 352-364 (2014).</li><li>Sauvain, M. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genotypic+features+of+lentivirus+transgenic+mice.">Genotypic features of lentivirus transgenic mice.</a> Journal of Virology. 82 (14), 7111-7119 (2008).</li></ol>

A capacidade dos lentivírus para integrar o seu genoma hospedeiro torna um vetor ideal para a entrega do gene estável. Vetores de Lentivirus podem transportar até 8,5 mil par (kbp) de material genético que pode acomodar células específicas ou inducible promotores, marcadores de seleção ou partes fluorescentes. Material genómico incorporado pode replicar como parte de seu genoma do hospedeiro e ser regulamentado para expressar ou desactivar em pontos de tempo desejado. Estes vetores permitem spatiotemporal contro...

Este método fornece instruções detalhadas para permeabilizing a zona pelúcida de ovos fertilizado de rato para tornar as células embrionárias acessível para a entrega do gene lentivírus. Lentivírus são projetados pela natureza para entrega eficiente de gene de células de mamíferos. Eles infectam células de divisão e não dividindo e integrarem o genoma de Lentivirus seu anfitrião cromossomos1. O intervalo de células hospedeiras Lentivirus prontamente é expandido por pseudotyping o lentivirus recombinante com a glicoproteína de vírus estomatite vesicular (VSV-G), devido a ampla tropismo do VSV-G proteínas2. Após transdução, Lentivirus genes são integrados estàvel e expressa como parte de seus cromossomos de acolhimento criando uma ferramenta ideal para a geração de animais transgênicos. Se entregue para células embrionárias de estágio inicial, o genoma Lentivirus é replicado e expresso em todo o organismo. Transdução de Lentivirus conduziu à produção de ratos, rato, galinha, codorna e porco3,4,5,6,7 , entre outras espécies de transgênicos. O método típico de entrega de Lentivirus gene, no entanto, requer técnicos especializados e equipamentos especializados para superar a barreira da zona pelúcida que encapsula os embriões adiantados do palco. O objectivo geral deste método é que descrevem como permeabilize a zona com um laser para facilitar a entrega de Lentivirus gene.
Ovos de mamíferos estão rodeados pela zona pelúcida que endurece após a fecundação para proteger os ovos fertilizados contra poliespermia e limitar a interacções ambientais8,9. A zona forma uma barreira que mantém os lentivírus longe as células embrionárias até que os embriões são incubados como um blastocisto. Mouse culta fertilizado ovos eclodem após 4 dias e deve ser implantado em ratos pseudopregnant antes da incubação para o desenvolvimento normal em filhotes. Portanto, para a transdução, lentivírus são injetadas antes da eclosão da zona em cavidade perivitelline, o espaço entre a zona e as células embrionárias.
Muitas vezes, a zona pelúcida é removida para fertilização " in vitro " de ovos humanos para aumentar a taxa de fertilização10. No entanto, a remoção química de rato zona pelúcida negativamente afeta o desenvolvimento do embrião de rato e é prejudicial para as células embrionárias11,12. Outros métodos para a entrega do gene de ovos fertilizado de rato superar a barreira da zona pelúcida pelo microinjection direto do DNA para a célula núcleo13. Microinjeção pró-nuclear é um meio eficiente de entregar genes para embriões. No entanto, desde que cada embrião é mantido no lugar individualmente para microinjeção, a prática pode ser trabalhoso e demorado para um usuário iniciante.
Outros métodos como electroporation e photoporation são úteis para transiente e a curto prazo entrega de gene de rato fertilizado ovos14,15,16. Esses métodos são usados extensivamente para a entrega de recombinases e CRISPR-Cas9 componentes. No entanto, eletroporação e photoporation entrega de genes não pode ser usada com eficiência para criar transgênicos. Espermatozoides, que são coletadas do epidídimo de rato perfurado também podem ser transformados por lentivírus e utilizados para fertilização in vitro , para produzir animais transgénicos17,18,19, 20.
Neste protocolo, a entrega do gene Lentivirus de embriões do rato é facilitada pela permeabilizing a zona usando um laser. O laser de XYClone foi desenvolvido como um auxílio para em vitro fertilização21 e cultivo de células-tronco embrionárias22. É um pequeno aparelho que é simples de configurar e fácil de usar. Uma vez instalado em um microscópio, que ocupa o espaço de uma lente objetiva e o software que acompanha permite apontar o laser ao olhar através da ocular do microscópio (Veja o protocolo: seção 3). Uma vez que a zona é perfurada pelo laser XYClone, lentivírus podem ser introduzidos o meio de cultura para gene entrega23. Lentivírus múltiplas poderiam ser usados para entregar simultaneamente vários genes para incorporação cromossômica.
Este protocolo irá descrever como isolar e cultura mouse fertilizado ovos, ilustra o uso do laser para perfuração da zona pelúcida e demonstra a transdução de células embrionárias de rato por lentivírus.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>CD510B-1 plasmid</td>
			<td>System Biosciences</td>
			<td>CD510B-1</td>
			<td>used to package the lentivirus expressing EF1a-copGFP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethylpolysiloxane</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>DMPS5X</td>
			<td>culturing embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hyaluronidase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3506</td>
			<td>used to remove cumulus cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XYClone Laser</td>
			<td>Hamilton Thorne Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>perforating mouse fertilized eggs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-Surgical Embryo Transfer (NSET) Device</td>
			<td>ParaTechs</td>
			<td>60010</td>
			<td>NSET of embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KSOM medium</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MR-020P-5F</td>
			<td>culturing embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Composition of KSOM:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>mg/100mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>555</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>18.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>4.75</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4 7H2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>4.95</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2 2H2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>210</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>3.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na-Pyruvate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>2.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Lactic Acid, sodium salt</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.174mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10mM EDTA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>100&#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomycin</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>6.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5% phenol red</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.1mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>14.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Essential Amino Acids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-essential AA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.5mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M2 medium</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MR-015-D</td>
			<td>culturing embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Composition of M2:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>mg/100mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>25.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate (anhydrous)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>16.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>35.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate, Monobasic</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>16.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>35</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>553.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin, Bovine Fraction</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na-HEPES</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>54.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol Red</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvic Acid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>3.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Lactic Acid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>295</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

laser-assisted lentiviral gene delivery to mouse fertilized eggs

Lentivírus são eficientes vetores para entrega de gene em células de mamíferos. Seguindo a transdução, o genoma de Lentivirus estàvel é incorporado ao cromossomo do hospedeiro e é passado para a descendência. Assim, eles são vetores ideais para a criação de linhas de célula estável, na vivo entrega dos indicadores e transdução de ovos única célula fertilizada para criar animais transgénicos. No entanto, rato fertilizado ovos e embriões adiantados do palco são protegidos pela zona pelúcida, uma matriz de glicoproteína que forma uma barreira contra a entrega do gene Lentivirus. Lentivírus são demasiado grandes para penetrar a zona e são tipicamente entregues pela microinjeção de partículas virais em cavidade perivitelline, o espaço entre a zona e as células embrionárias. O requisito para tecnólogos altamente qualificados e equipamentos especializados minimizou o uso do lentivírus para entrega de genes em embriões de rato. Este artigo descreve um protocolo para permeabilizing os ovos fertilizado de rato por perfurar a zona com um laser. Laser-perfuração não resulta em danos aos embriões e permite lentivírus ter acesso às células embrionárias para a entrega do gene. Transduzidas embriões podem desenvolver-se em blastocisto in vitro e se implantado em ratos pseudopregnant, evoluir para filhotes transgênicos. O laser utilizado neste protocolo é eficaz e fácil de usar. Genes, entregados por lentivírus estàvel incorporam em células embrionárias de rato e são transmissível germline. Este é um método alternativo para a criação de ratos transgênicos que requer sem micromanipulação e microinjeção de ovos fertilizados.

Desenvolvimento de ovos de rato isolado/transfectadas fertilizado pode ser verificado ao microscópio diariamente (Figura 1). Os embriões saudáveis desenvolvem-se em blastocisto dentro de 3-4 dias. Neste protocolo, 60-70% dos embriões não tratados desenvolvem-se em blastocisto23. Fora 114 embriões transduzidos laser-perfurados, 54 desenvolveu-se em blastocisto (taxa de 47%) e 46 blastocistos expressaram GFP (46/54 = 85%)<sup class...

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Laser-assisted Lentiviral Gene Delivery to Mouse Fertilized Eggs

Mouse de ovos fertilizados e embriões adiantados do palco são protegidos pela zona pelúcida, uma matriz de glicoproteína que forma uma barreira contra a entrega do gene. Este artigo descreve um protocolo para perfurar a zona com um laser para transduce células embrionárias com vetores Lentivirus e criar ratos transgénicos.

Entrega de gene lentiviral assistida por laser em óvulos fertilizados de camundongos

Lentiviruses are efficient vectors for gene delivery to mammalian cells. Following transduction, the lentiviral genome is stably incorporated into the ...

Trata-se de um método alternativo e fácil de usar para fornecer genes de interesse aos ovos de camundongos fertilizados através da perfuração a laser da zona pellucida e da entrega de genes lentiviral. A perfuração assistida a laser do procedimento de doação de camundongos também pode ser aplicável aos óvulos fertilizados de outras espécies para facilitar a entrada de outros tipos de vírus ou reagentes de transfecção. A principal vantagem dessa técnica é que ela não requer habilidades especializadas para a micromanipulação e micro injeção dos ovos de camundongos fertilizados.Demonstrando o procedimento de isolamento de ovos de rato fertilizado será Page Myers, um cientista pesquisador do ramo de Medicina Comparada do NIEHS. 16 a 24 horas após o acasalamento, isolar os ovários e ovários de camundongos fêmeas com plugues vaginais, de acordo com protocolos padrão. Quando todos os tecidos tiverem sido coletados, rasgue a ampola de cada ovário, e solte os óvulos fertilizados, cercados por células cumulosas, e transfira os ovos em células cumulantes para um prato de 35 milímetros contendo um x hyaluronidase em m2 médio fresco, para uma incubação de três a cinco minutos à temperatura ambiente.Pipeta os ovos algumas vezes para liberar as células cumulajadas, e transfira os ovos para um novo prato de 35 milímetros contendo m2 médio, com pipetação para lavar a enzima. Em seguida, transfira os ovos lavados para um prato de 35 milímetros contendo meio otimizado de potássio, ou KSOM, e pipeta para lavar o m2 médio e hialuronidase restante. Em seguida, transfira os ovos para placas tratadas de cultura tecidual de 35 milímetros semeadas com 50 microliters de KSOM e dois mililitros de dimetilpolísiloxano para um equilíbrio de duas horas a 37 graus Celsius, 5% de dióxido de carbono e oxigênio, e 90% de nitrogênio.Enquanto os ovos estiverem na incubadora, configure e calibra o laser XYClone, de acordo com as recomendações do fabricante. Quando os ovos estiverem prontos, coloque a primeira placa de gota no estágio do microscópio laser e concentre manualmente a zona pellucida. Depois de confirmar que a luz LED laser é visível através do objetivo, mova o estágio do microscópio para atingir a zona com o laser LED, e use o software do computador para definir o laser XYClone para 250 microsegundos.Ajuste o tamanho da luz LED para as dimensões apropriadas e perfure a zona pellucida de cada ovo três vezes com o laser para produzir três furos de 10 micrômetros. É fundamental realizar a perfuração rapidamente, mas com cuidado, pois os ovos fertilizados não podem ficar fora da incubadora por mais de 15 minutos. Em seguida, devolva os ovos perfurados à incubadora por mais duas horas.No final da segunda incubação, trate a queda de 50 microliter KSOM com dois microliters de lentivírus concentrados sem misturar. E devolva os ovos à incubadora por quatro dias. Quando os ovos se desenvolverem em blastocistos, use um dispositivo de transferência de embriões não cirúrgicos, para depositar aproximadamente 10-15 embriões em cerca de dois microliters de KSOM.17 dias após a transferência do embrião, permita que o camundongo gestante dê à luz naturalmente ou colete os recém-nascidos por cesariana, conforme necessário. Em seguida, coletar tecido dos filhotes para genotipagem, para determinar a taxa de transgênese. O desenvolvimento isolado e transduzido de óvulos fertilizados por camundongos pode ser verificado diariamente sob o microscópio.60 a 70% dos embriões saudáveis e não tratados desenvolvem-se em blastocistos dentro de três a quatro dias. Enquanto cerca de 47% dos embriões perfurados a laser se desenvolvem em blastocistos, 85% dos quais expressam o gene de interesse tranduzido. Mirar o laser para afinar a zona, em vez de criar um buraco, permite que os embriões em desenvolvimento se beneficiem de uma zona pellucida intacta e encapsulante enquanto permanecem permissivos à transdução lentiviral.A transdução com um lentivírus recombinante, expressando o GFP do copépod de um promotor fator de alongamento 1A induz múltiplas integrações lentivirais e uma alta expressão de GFP sob uma lâmpada LED azul. Ao tentar esse procedimento, é importante lembrar que, embora a capacidade dos lentivírus se integrarem ao genoma hospedeiro, torna-os uma ferramenta poderosa para a entrega estável de genes, mas a integração aleatória também pode introduzir mutações insercionais. Essa técnica poderia permitir que pesquisadores da área da genética desenvolvessem rapidamente modelos de animais transgênicos para o estudo de doenças para produção de proteína in vivo, ou para estudos genéticos funcionais.Após esse procedimento, outros métodos como a imunohistoquímica podem ser realizados em amostras de tecidos isolados de filhotes transduzidos para responder a perguntas adicionais sobre a localização e a extensão da expressão genética em vários tecidos de interesse. Não se esqueça que trabalhar com lentivírus pode ser extremamente perigoso. Portanto, siga suas diretrizes institucionais para trabalhar com lentivírus.Use roupas de proteção pessoal e descontamine todos os resíduos antes do descarte.

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SCIENTISTS IN ACTION

Windowing Chicken Eggs for Developmental Studies

Windowing Ovos de galinha para Estudos do Desenvolvimento

The study of development has been greatly aided by the use of the chick embryo as an experimental model.  The ease of accessibility of the embryo has ...

Biologia

Obtaining Eggs from Xenopus laevis Females

Obtenção de ovos de Xenopus laevis fêmeas

The eggs of Xenopus laevis intact, lysed, and/or fractionated are useful for a wide variety of experiments. This protocol shows how to induce egg laying, ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

Usando o Sistema de Eletroporação Gene Pulser MXcell para transfectar pilhas com Alta Eficiência

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

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In vivo de imagens e tratamentos terapêuticos em um modelo de camundongo ortotópico de câncer de ovário

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models.  This paper describes the development of an orthotopic mouse model ...

Isolation and Culture of Cells from the Nephrogenic Zone of the Embryonic Mouse Kidney

Isolamento e cultura de células da zona nefrogênica do rim do rato embrionárias

Embryonic development of the kidney has been extensively studied both as a model for epithelial-mesenchymal interaction in organogenesis and  to gain ...

Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides

Usando Seqüência de Detenção SECM como uma ferramenta para isolar Ribossomos Polipeptídeos encadernados

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Intraductal Injection for Localized Drug Delivery to the Mouse Mammary Gland

Injeção Intraductal para localizada Drug Delivery ao Rato glândula mamária

Herein we describe a protocol to deliver various reagents to the mouse mammary gland via intraductal injections. Localized drug delivery and knock-down of ...

Transient Expression of Proteins by Hydrodynamic Gene Delivery in Mice

Expressão transiente de proteínas por hidrodinâmica Gene Entrega em Ratos

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Phage-mediated Delivery of Targeted sRNA Constructs to Knock Down Gene Expression in E. coli

Phage-mediated Delivery of Targeted sRNA Constructs to Knock Down Gene Expression in E. coli

Entrega mediada por fago de sRNA alvejado Constrói para bater para baixo Expressão Gênica em<em&gt; E. coli</em

RNA-mediated knockdowns are widely used to control gene expression. This versatile family of techniques makes use of short RNA (sRNA) that can be ...

Laser-assisted Microdissection (LAM) as a Tool for Transcriptional Profiling of Individual Cell Types

Laser-assisted Microdissection LAM as a Tool for Transcriptional Profiling of Individual Cell Types

assistida por laser Microdissecção (LAM) como ferramenta para transcricional Profiling de tipos de células individuais

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