Name: laser-assisted lentiviral gene delivery to mouse fertilized eggs
Uploaded: 2018-11-01T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Laser-assisted Lentiviral Gene Delivery to Mouse Fertilized Eggs at JoVE.com

Это исследование было поддержано очной программе исследований Национального института здравоохранения (НИЗ), Национальный институт окружающей среды медицинских наук (NIEHS). Мы благодарны д-р Роберт Петрович и доктор Джейсон Уильямс для критических чтении рукописи и полезные советы. Мы также хотели бы выразить признательность и поблагодарить д-р Бернд глянец, нокаут ядро, поток цитометрии фондом, микроскопии флуоресцирования и центр томографии и сравнительные ветвь медицины услуги NIEHS для их технический вклад. Мы хотели бы поблагодарить г-н Дэвид Гулдинг от сравнительной ветвь медицины и г-жа Лоис Вириком из центра изображения на NIEHS за предоставленную нам с фотографиями и иллюстрациями.

Все животные процедуры и процедуры, используемые в настоящем Протоколе соблюдают руководящие принципы ухода за животными NIH/NIEHS и были одобрены Уход за животными и использования Комитета (ACUC) на NIH/NIEHS, животное протокол 2010-0004.
1. Подготовка
<ol><li>Подготовка/Покупка рекомби?...

<ol>
	<li>Sakuma, T., Barry, M. A., Ikeda, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentiviral+vectors:+basic+to+translational.">Lentiviral vectors: basic to translational.</a> Biochemical Journal. 443 (3), 603-618 (2012).</li><li>Salmon, P., Trono, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+and+titration+of+lentiviral+vectors.">Production and titration of lentiviral vectors.</a> Current Protocols in Human Genetics. , (2007).</li><li>Lois, C., Hong, E. J., Pease, S., Brown, E. J., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germline+transmission+and+tissue-specific+expression+of+transgenes+delivered+by+lentiviral+vectors.">Germline transmission and tissue-specific expression of transgenes delivered by lentiviral vectors.</a> Science. 295 (5556), 868-872 (2002).</li><li>Filipiak, W. E., Saunders, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+transgenic+rat+production.">Advances in transgenic rat production.</a> Transgenic Research. 15 (6), 673-686 (2006).</li><li>McGrew, M. J., Sherman, A., Lillico, S. G., Taylor, L., Sang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+conservation+between+rodents+and+chicken+of+regulatory+sequences+driving+skeletal+muscle+gene+expression+in+transgenic+chickens.">Functional conservation between rodents and chicken of regulatory sequences driving skeletal muscle gene expression in transgenic chickens.</a> BMC Developmental Biology. 10, 26 (2010).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+transgenic+pigs+mediated+by+pseudotyped+lentivirus+and+sperm.">Production of transgenic pigs mediated by pseudotyped lentivirus and sperm.</a> PLoS One. 7 (4), e35335 (2012).</li><li>Zhang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+quail+production+by+microinjection+of+lentiviral+vector+into+the+early+embryo+blood+vessels.">Transgenic quail production by microinjection of lentiviral vector into the early embryo blood vessels.</a> PLoS One. 7 (12), e50817 (2012).</li><li>Wassarman, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zona+pellucida+glycoproteins.">Zona pellucida glycoproteins.</a> Annul Review of Biochemistry. 57, 415-442 (1988).</li><li>Clift, D., Schuh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Restarting+life:+fertilization+and+the+transition+from+meiosis+to+mitosis.">Restarting life: fertilization and the transition from meiosis to mitosis.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (9), 549-562 (2013).</li><li>Fong, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blastocyst+transfer+after+enzymatic+treatment+of+the+zona+pellucida:+improving+in-vitro+fertilization+and+understanding+implantation.">Blastocyst transfer after enzymatic treatment of the zona pellucida: improving in-vitro fertilization and understanding implantation.</a> Human Reproduction. 13 (10), 2926-2932 (1998).</li><li>Nijs, M., Van Steirteghem, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+different+isolation+procedures+for+blastomeres+from+two-cell+mouse+embryos.">Assessment of different isolation procedures for blastomeres from two-cell mouse embryos.</a> Human Reproduction. 2 (5), 421-424 (1987).</li><li>Ribas, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+zona+pellucida+removal+on+DNA+methylation+in+early+mouse+embryos.">Effect of zona pellucida removal on DNA methylation in early mouse embryos.</a> Biology of Reproduction. 74 (2), 307-313 (2006).</li><li>Gordon, J. W., Scangos, G. A., Plotkin, D. J., Barbosa, J. A., Ruddle, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+transformation+of+mouse+embryos+by+microinjection+of+purified+DNA.">Genetic transformation of mouse embryos by microinjection of purified DNA.</a> Proceedings of National Academy of Science U S A. 77 (12), 7380-7384 (1980).</li><li>Kaneko, T., Sakuma, T., Yamamoto, T., Mashimo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+knockout+by+electroporation+of+engineered+endonucleases+into+intact+rat+embryos.">Simple knockout by electroporation of engineered endonucleases into intact rat embryos.</a> Scientific Reports. 4, 6382 (2014).</li><li>Hosokawa, Y., Ochi, H., Iino, T., Hiraoka, A., Tanaka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoporation+of+biomolecules+into+single+cells+in+living+vertebrate+embryos+induced+by+a+femtosecond+laser+amplifier.">Photoporation of biomolecules into single cells in living vertebrate embryos induced by a femtosecond laser amplifier.</a> PLoS One. 6 (11), e27677 (2011).</li><li>Horii, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+microinjection+methods+for+generating+knockout+mice+by+CRISPR/Cas-mediated+genome+engineering.">Validation of microinjection methods for generating knockout mice by CRISPR/Cas-mediated genome engineering.</a> Scientific Reports. 4, 4513 (2014).</li><li>Hamra, F. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+transgenic+rats+by+lentiviral+transduction+of+male+germ-line+stem+cells.">Production of transgenic rats by lentiviral transduction of male germ-line stem cells.</a> Proceedings of National Academy of Science U S A. 99 (23), 14931-14936 (2002).</li><li>Kanatsu-Shinohara, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+transgenic+rats+via+lentiviral+transduction+and+xenogeneic+transplantation+of+spermatogonial+stem+cells.">Production of transgenic rats via lentiviral transduction and xenogeneic transplantation of spermatogonial stem cells.</a> Biology of Reproduction. 79 (6), 1121-1128 (2008).</li><li>Dann, C. T., Garbers, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+knockdown+rats+by+lentiviral+transduction+of+embryos+with+short+hairpin+RNA+transgenes.">Production of knockdown rats by lentiviral transduction of embryos with short hairpin RNA transgenes.</a> Methods in Molecular Biology. 450, 193-209 (2008).</li><li>Chandrashekran, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+generation+of+transgenic+mice+by+lentivirus-mediated+modification+of+spermatozoa.">Efficient generation of transgenic mice by lentivirus-mediated modification of spermatozoa.</a> FASEB Journal. 28 (2), 569-576 (2014).</li><li>Woods, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser-assisted+in+vitro+fertilization+facilitates+fertilization+of+vitrified-warmed+C57BL/6+mouse+oocytes+with+fresh+and+frozen-thawed+spermatozoa,+producing+live+pups.">Laser-assisted in vitro fertilization facilitates fertilization of vitrified-warmed C57BL/6 mouse oocytes with fresh and frozen-thawed spermatozoa, producing live pups.</a> PLoS One. 9 (3), e91892 (2014).</li><li>Tanaka, N., Takeuchi, T., Neri, Q. V., Sills, E. S., Palermo, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser-assisted+blastocyst+dissection+and+subsequent+cultivation+of+embryonic+stem+cells+in+a+serum/cell+free+culture+system:+applications+and+preliminary+results+in+a+murine+model.">Laser-assisted blastocyst dissection and subsequent cultivation of embryonic stem cells in a serum/cell free culture system: applications and preliminary results in a murine model.</a> Journal of Translational Medicine. 4, 20 (2006).</li><li>Martin, N. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=En+masse+lentiviral+gene+delivery+to+mouse+fertilized+eggs+via+laser+perforation+of+zona+pellucida.">En masse lentiviral gene delivery to mouse fertilized eggs via laser perforation of zona pellucida.</a> Transgenic Research. 27 (1), 39-49 (2018).</li><li>Lawitts, J. A., Biggers, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+of+preimplantation+embryos.">Culture of preimplantation embryos.</a> Methods in Enzymology. 225, 153-164 (1993).</li><li>Stein, P., Schindler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+oocyte+microinjection,+maturation+and+ploidy+assessment.">Mouse oocyte microinjection, maturation and ploidy assessment.</a> Journal of Visualized Experiments. (53), (2011).</li><li>Nagy, A., Gertsenstein, M., Vintersten, K., Behringer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caesarean+section+and+fostering.">Caesarean section and fostering.</a> CSH Protocols. 2006 (2), (2006).</li><li>Chum, P. Y., Haimes, J. D., Andre, C. P., Kuusisto, P. K., Kelley, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genotyping+of+plant+and+animal+samples+without+prior+DNA+purification.">Genotyping of plant and animal samples without prior DNA purification.</a> Journal of Visualized Experiments. (67), (2012).</li><li>Bin Ali, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+pregnancy+and+birth+rates+with+routine+application+of+nonsurgical+embryo+transfer.">Improved pregnancy and birth rates with routine application of nonsurgical embryo transfer.</a> Transgenic Research. 23 (4), 691-695 (2014).</li><li>Liu, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrase-deficient+lentivirus:+opportunities+and+challenges+for+human+gene+therapy.">Integrase-deficient lentivirus: opportunities and challenges for human gene therapy.</a> Current Gene Therapy. 14 (5), 352-364 (2014).</li><li>Sauvain, M. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genotypic+features+of+lentivirus+transgenic+mice.">Genotypic features of lentivirus transgenic mice.</a> Journal of Virology. 82 (14), 7111-7119 (2008).</li></ol>

Lentiviruses способность интегрироваться в их геном принимающей делает их идеальным вектор для доставки стабильного ген. Лентивирусные векторы могут нести до 8,5 kilobase пары (kbp) генетического материала, который может вместить клеток конкретных или индуцибельной промоутеров, маркеры выделения...

Этот метод предоставляет подробные инструкции сделать доступными для доставки генов эмбриональных клеток, lentiviruses для permeabilizing вителлинового мыши оплодотворенных яиц. Lentiviruses созданным природой для доставки эффективного гена в mammalian клетках. Они заразить деления и не деления клетки и интегрировать их принимающих хромосомы1лентивирусные генома. Диапазон ячеек, лентивирусные узла легко расширяется pseudotyping рекомбинантных человека с гликопротеина вирус везикулярного стоматита (VSV-G), из-за широкого тропизм белка VSV-G2. После трансдукции лентивирусные гены являются стабильно интегрированы и выразили в рамках их принимающих хромосом, создавая идеальный инструмент для создания трансгенных животных. Если доставлены на ранней стадии эмбриональных клеток, лентивирусные генома реплицируется и выражена в весь организм. Лентивирусные трансдукции привела к производству мышей, крыс, курица, перепела и свиней3,4,5,6,7 среди других видов мутация. Типичный способ доставки лентивирусные гена, однако, требует квалифицированных техников и специализированное оборудование для преодоления вителлинового барьер, который инкапсулирует эмбрионы ранней стадии. Общая цель этого метода является описывают разрушения zona, с помощью лазера для облегчения доставки лентивирусные ген.
У млекопитающих яйца окружены zona pellucida, которая твердеет после оплодотворения для защиты оплодотворенных яиц против polyspermy и ограничить экологических взаимодействий8,9. Zona образует барьер, который удерживает lentiviruses от эмбриональных клеток до тех пор, пока эмбрионы вылупились как бластоциста. Культивированный мыши оплодотворенные яйца люк после 4 дней и должен быть имплантированы в pseudopregnant мышей до вылупления для нормального развития в детенышей. Таким образом для трансдукции, lentiviruses microinjected до вылупления из zona в полость наблюдаться, пространство между zona и эмбриональных клеток.
Zona pellucida часто удаляется в пробирке оплодотворение яйцеклетки человека увеличить скорость оплодотворение10. Однако химическое удаление мыши вителлинового отрицательно влияет на развитие эмбриона мыши и вредно для эмбриональных клеток11,12. Другие методы для доставки ген мыши оплодотворенные яйца преодолеть барьер вителлинового прямого микроинъекции ДНК в ядре клетки13. Pronuclear микроинъекции является эффективным средством доставки гены эмбрионов. Однако поскольку каждый эмбрион удерживается на месте индивидуально для микроинъекции, практика может быть трудоемким и требует много времени для начинающего пользователя.
Другие методы, такие как электропорации и photoporation являются полезными для переходных и краткосрочные поставки ген мыши оплодотворенные яйца14,,1516. Эти методы широко используются для доставки компонентов ТРИФОСФАТЫ-Cas9 и recombinases. Однако электропорация и photoporation доставки генов не может эффективно использоваться для создания мутация. Сперматозоидов, которые собираются из пробитого мыши придатка яичка также могут быть преобразованы в lentiviruses и используется для оплодотворения в пробирке для производства трансгенных животных17,18,19, 20.
В этом протоколе лентивирусные гена доставки эмбрионов мыши способствует permeabilizing зона, с помощью лазера. XYClone лазер был разработан для помощи в пробирке оплодотворение21 и культивирование эмбриональных стволовых клеток22. Это небольшой аппарат, который прост в установке и прост в использовании. После того, как установлен на микроскопе, он занимает пространство объектива и сопровождающих программное обеспечение позволяет для направленного лазерного глядя через окуляры микроскопа (см. протокол: раздел 3). После zona Перфорированная лазером XYClone, lentiviruses могут быть введены в культуру СМИ для доставки генов23. Несколько lentiviruses могут использоваться одновременно поставить несколько генов для регистрации хромосом.
Этот протокол будет описывать как изолировать и культуры мыши оплодотворенные яйца, иллюстрирует использование лазерной перфорации zona pellucida и демонстрирует трансдукции мышиных эмбриональных клеток, lentiviruses.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>CD510B-1 plasmid</td>
			<td>System Biosciences</td>
			<td>CD510B-1</td>
			<td>used to package the lentivirus expressing EF1a-copGFP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethylpolysiloxane</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>DMPS5X</td>
			<td>culturing embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hyaluronidase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3506</td>
			<td>used to remove cumulus cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XYClone Laser</td>
			<td>Hamilton Thorne Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>perforating mouse fertilized eggs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-Surgical Embryo Transfer (NSET) Device</td>
			<td>ParaTechs</td>
			<td>60010</td>
			<td>NSET of embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KSOM medium</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MR-020P-5F</td>
			<td>culturing embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Composition of KSOM:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>mg/100mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>555</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>18.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>4.75</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4 7H2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>4.95</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2 2H2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>210</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>3.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na-Pyruvate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>2.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Lactic Acid, sodium salt</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.174mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10mM EDTA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>100&#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomycin</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>6.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5% phenol red</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.1mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>14.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Essential Amino Acids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-essential AA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.5mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M2 medium</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MR-015-D</td>
			<td>culturing embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Composition of M2:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>mg/100mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>25.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate (anhydrous)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>16.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>35.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate, Monobasic</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>16.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>35</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>553.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin, Bovine Fraction</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na-HEPES</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>54.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol Red</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvic Acid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>3.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Lactic Acid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>295</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

laser-assisted lentiviral gene delivery to mouse fertilized eggs

Lentiviruses являются эффективным векторов для доставки гена в mammalian клетках. После трансдукции лентивирусные генома стабильно включены в хромосоме хост и передается потомству. Таким образом они являются идеальным векторов для создания стабильных клеточных линий, в естественных условиях доставки показателей и трансдукция одноклеточного оплодотворенных яиц для создания трансгенных животных. Однако мыши оплодотворенные яйца и ранней стадии эмбрионы находятся под защитой zona pellucida, гликопротеин матрицу, которая формирует барьер против лентивирусные гена доставки. Lentiviruses слишком велики, чтобы проникнуть zona и обычно поставляются микроинъекции вирусных частиц в полость наблюдаться, пространство между zona и эмбриональных клеток. Потребность в высококвалифицированных технологов и специализированного оборудования свести к минимуму использование lentiviruses для доставки генов эмбрионов мыши. Эта статья описывает протокол для permeabilizing мыши оплодотворенные яйца, перфорации zona с помощью лазера. Лазерная перфорация не приводят к любой ущерб эмбрионов и позволяет lentiviruses для получения доступа к эмбриональных клеток для доставки генов. Transduced эмбрионы могут развиться в бластоцисты в пробирке и если имплантированы в мышей, pseudopregnant, перерасти в трансгенных щенков. Лазер, используемый в настоящем Протоколе, эффективный и простой в использовании. Гены, поставляемые lentiviruses стабильно инкорпорировать в мышиных эмбриональных клеток и являются инфекционными микрофлорой. Это альтернативный метод для создания трансгенных мышей, которая требует не микроманипуляции и микроинъекции оплодотворенных яиц.

Разработка изолированных/преобразованы мыши оплодотворенные яйца могут быть проверены под микроскопом ежедневно (рис. 1). Здорового эмбриона развиться в бластоцисты в течение 3 – 4 дней. В этом протоколе 60 – 70% необработанных эмбрионов развиться в блас?...

Watch this Scientific Journal Video about Laser-assisted Lentiviral Gene Delivery to Mouse Fertilized Eggs at JoVE.com

Laser-assisted Lentiviral Gene Delivery to Mouse Fertilized Eggs

Мыши оплодотворенные яйца и ранней стадии эмбрионы находятся под защитой zona pellucida, гликопротеин матрицу, которая формирует барьер против Джин доставки. Эта статья описывает протокол для перфорации zona с лазером для передают эмбриональных клеток с лентивирусные векторы и создания трансгенных мышей.

Доставки при помощи лазера лентивирусные ген мыши оплодотворенные яйца

Lentiviruses are efficient vectors for gene delivery to mammalian cells. Following transduction, the lentiviral genome is stably incorporated into the ...

Это альтернативный и простой в использовании метод для доставки генов, представляющих интерес для оплодотворенных яйцеклеток мыши с помощью лазерной перфорации zona pellucida и лентивирусной доставки генов. Лазерная перфорация процедуры донора мыши может также применяться к оплодотворенным яйцеклеткам других видов для облегчения проникновения других типов вирусов или трансфекционных реагентов. Основным преимуществом этой техники является то, что она не требует специальных навыков для микроманипуляции и микро-инъекций оплодотворенных яйцеклеток мыши.Демонстрация оплодотворенной процедуры изоляции яйцеклетки мыши будет Пейдж Майерс, научный сотрудник из отделения сравнительной медицины в NIEHS. От 16 до 24 часов после спаривания, изолировать яичники и овадуки от самок мышей с вагинальными пробками, в соответствии со стандартными протоколами. Когда все ткани были собраны, разорвать ампулы каждого яичника друг от друга, и освободить оплодотворенные яйца, окруженные кучевыми клетками, и передать яйца в кучевых клетках 35 миллиметров блюдо, содержащее один х гиалуронидазы в свежем M2 среды, в течение трех-пяти минут инкубации при комнатной температуре.Pipette яйца несколько раз, чтобы освободить кучевые клетки, и передать яйца в новый 35-миллиметровый блюдо, содержащее M2 среды, с пипеткой, чтобы смыть фермент. Затем перенесите вымытые яйца в 35-миллиметровое блюдо, содержащее калийный сикс, оптимизированный средний, или KSOM, и пипетку, чтобы смыть оставшуюся среду M2 и гиалуронидазы. Затем перенесите яйца на 35-миллиметровые ткани-культуры обработанные пластины, посеянные с 50 микролитров KSOM и два миллилитров диметилполисилоксана в течение двух часов эквилибрации при 37 градусах Цельсия, 5%углекислого газа и кислорода, и 90%азот.В то время как яйца находятся в инкубаторе, настроить и откалибровать лазер XYClone, в соответствии с рекомендациями производителя. Когда яйца будут готовы, поместите первую пластину капли на стадии лазерного микроскопа, и вручную сосредоточить zona pellucida. После подтверждения того, что лазерный светодиодный свет виден через цель, переместить микроскоп этапе целевой zona со светодиодным лазером, и использовать компьютерное программное обеспечение, чтобы установить лазер XYClone до 250 микросекунд.Отрегулируйте размер светодиодного света до соответствующих размеров, и перфорировать zona pellucida каждого яйца три раза с лазером, чтобы произвести три 10-микрометровых отверстий. Очень важно выполнить перфорацию быстро, но осторожно, так как оплодотворенные яйцеклетки не могут храниться за пределами инкубатора дольше 15 минут. Затем верните перфорированные яйца в инкубатор еще на два часа.В конце второй инкубации, лечить 50 микролитер KSOM падение с двумя микролитров концентрированного лентивируса без смешивания. И вернуть яйца в инкубатор на четыре дня. Когда яйцеклетки превратились в бластоцисты, используйте нехирургическое устройство для переноса эмбрионов, чтобы внести около 10-15 эмбрионов в около двух микролитров KSOM.Через 17 дней после переноса эмбриона, позвольте беременной мыши рожать естественным путем или собирать новорожденных путем кесарева сечения по мере необходимости. Затем, собирать ткани из щенков для генотипирования, чтобы определить скорость трансгенеза. Изолированное и трансудерированные мыши оплодотворенные яйцеклетки развития могут быть проверены под микроскопом ежедневно.От 60 до 70% здоровых, необработанных эмбрионов развиваются в бластоцисты в течение трех-четырех дней. В то время как около 47% лазерных перфорированных, транс индуцированных эмбрионов развиваются в бластоцисты, 85% из которых выражают трансвеститный ген, представляющий интерес. Нацеливание лазера на истончение зоны, вместо того, чтобы создавать отверстие, позволяет развивающимся эмбрионам извлечь выгоду из нетронутой, инкапсулируя zona pellucida, оставаясь при этом вседозволенной для лентивирусной трансдукции.Трансдукция с рекомбинантным лентивирусом, выражающих копепод GFP от удлиненного фактора 1A промоутера вызывает многочисленные лентивирусные интеграции, а также высокое выражение GFP под синей светодиодной лампой. При попытке этой процедуры, важно помнить, что, в то время как способность лентивирусов интегрироваться в геном хозяина делает их мощным инструментом для стабильной доставки генов, но случайная интеграция может также ввести вставки мутаций. Этот метод мог бы позволить исследователям в области генетики быстро разрабатывать трансгенные модели животных для изучения болезни для производства белка in vivo, или для функциональных исследований генов.После этой процедуры, другие методы, такие как иммуногистохимия могут быть выполнены на изолированных образцах тканей от транс индуцированных щенков, чтобы ответить на дополнительные вопросы о местоположении и степени экспрессии генов в различных тканях, представляющих интерес. Не забывайте, что работа с лентивирусами может быть чрезвычайно опасной. Поэтому, пожалуйста, следуйте вашим институциональным руководящим принципам для работы с лентивирусами.Носите личную защитную одежду и обеззараживать все отходы до удаления.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Genetics

Viruses

SCIENTISTS IN ACTION

Windowing Chicken Eggs for Developmental Studies

Windowing куриные яйца целях развития исследований

The study of development has been greatly aided by the use of the chick embryo as an experimental model.  The ease of accessibility of the embryo has ...

Obtaining Eggs from Xenopus laevis Females

Получение Яйца Xenopus laevis Женщины

The eggs of Xenopus laevis intact, lysed, and/or fractionated are useful for a wide variety of experiments. This protocol shows how to induce egg laying, ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

Использование генной Pulser MXcell Электропорация системы для трансфекции первичных элементов с высоким КПД

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

В естественных изображений и лечебных процедур в Ортотопическая мышиной модели рака яичников

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models.  This paper describes the development of an orthotopic mouse model ...

Isolation and Culture of Cells from the Nephrogenic Zone of the Embryonic Mouse Kidney

Выделение и культуре клеток из нефрогенной зона эмбриональных почек мышь

Embryonic development of the kidney has been extensively studied both as a model for epithelial-mesenchymal interaction in organogenesis and  to gain ...

Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides

Использование МЭСМ последовательности арест как средство изолировать Рибосома связанных полипептидов

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway ...

Intraductal Injection for Localized Drug Delivery to the Mouse Mammary Gland

Внутрипротоковый впрыска для локализованной доставки лекарств к молочной железы мыши

Herein we describe a protocol to deliver various reagents to the mouse mammary gland via intraductal injections. Localized drug delivery and knock-down of ...

Transient Expression of Proteins by Hydrodynamic Gene Delivery in Mice

Кратковременная экспрессия белков гидродинамическими доставки генов у мышей

Efficient expression of transgenes in vivo is of critical importance in studying gene function and developing treatments for diseases. Over the past ...

Phage-mediated Delivery of Targeted sRNA Constructs to Knock Down Gene Expression in E. coli

Phage-mediated Delivery of Targeted sRNA Constructs to Knock Down Gene Expression in E. coli

Фаг-опосредованной доставки целевых рРНК Создаёт к нокдауна экспрессии генов в<em&gt; E. палочки</em

RNA-mediated knockdowns are widely used to control gene expression. This versatile family of techniques makes use of short RNA (sRNA) that can be ...

Laser-assisted Microdissection (LAM) as a Tool for Transcriptional Profiling of Individual Cell Types

Laser-assisted Microdissection LAM as a Tool for Transcriptional Profiling of Individual Cell Types

Помощью лазера микродиссекция (LAM) в качестве инструмента для транскрипционные Профилирование отдельных типов клеток

The understanding of developmental processes at the molecular level requires insights into transcriptional regulation, and thus the transcriptome, at the ...