Name: laser-assisted lentiviral gene delivery to mouse fertilized eggs
Uploaded: 2018-11-01T14:30:00
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Esta investigación fue apoyada por el programa de investigación Intramural del Instituto Nacional de salud (NIH), nacional Instituto de Ciencias de salud ambiental (NIEHS). Agradecemos al Dr. Robert Petrovich y Dr. Jason Williams lectura crítica del manuscrito y consejos útiles. También nos gustaría reconocer y agradecer a Dr. Bernd Gloss, el núcleo de octavos de final, el servicio de citometría de flujo, la microscopía de fluorescencia y centro de la imagen y las instalaciones de la rama de medicina comparativa de la NIEHS por sus contribuciones técnicas. Nos gustaría agradecer al Sr. David Goulding desde la rama de medicina comparativa y la Sra. Lois Wyrick del centro de la imagen en el NIEHS por facilitarnos fotografías e ilustraciones.

Todos los animales procedimientos y tratamientos que se utilizan en este protocolo fueron cumpliendo con las directrices de cuidado de los animales de NIH/NIEHS y fueron aprobados por el cuidado Animal y el Comité uso (ACUC) en el NIH/NIEHS, Animal protocolo 2010-0004.
1. preparaciones
<ol><li>Prepara o compra recombinantes lentivirus no multiplicación llevando tu gen de interés. En este estudio, lentivirus SBI511 expresan la proteína fluorescente verde de copépodo (copGFP; abreviado a ...

<ol>
	<li>Sakuma, T., Barry, M. A., Ikeda, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentiviral+vectors:+basic+to+translational.">Lentiviral vectors: basic to translational.</a> Biochemical Journal. 443 (3), 603-618 (2012).</li><li>Salmon, P., Trono, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+and+titration+of+lentiviral+vectors.">Production and titration of lentiviral vectors.</a> Current Protocols in Human Genetics. , (2007).</li><li>Lois, C., Hong, E. J., Pease, S., Brown, E. 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E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser-assisted+in+vitro+fertilization+facilitates+fertilization+of+vitrified-warmed+C57BL/6+mouse+oocytes+with+fresh+and+frozen-thawed+spermatozoa,+producing+live+pups.">Laser-assisted in vitro fertilization facilitates fertilization of vitrified-warmed C57BL/6 mouse oocytes with fresh and frozen-thawed spermatozoa, producing live pups.</a> PLoS One. 9 (3), e91892 (2014).</li><li>Tanaka, N., Takeuchi, T., Neri, Q. V., Sills, E. S., Palermo, G. 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A., Biggers, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+of+preimplantation+embryos.">Culture of preimplantation embryos.</a> Methods in Enzymology. 225, 153-164 (1993).</li><li>Stein, P., Schindler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+oocyte+microinjection,+maturation+and+ploidy+assessment.">Mouse oocyte microinjection, maturation and ploidy assessment.</a> Journal of Visualized Experiments. (53), (2011).</li><li>Nagy, A., Gertsenstein, M., Vintersten, K., Behringer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caesarean+section+and+fostering.">Caesarean section and fostering.</a> CSH Protocols. 2006 (2), (2006).</li><li>Chum, P. Y., Haimes, J. D., Andre, C. P., Kuusisto, P. K., Kelley, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genotyping+of+plant+and+animal+samples+without+prior+DNA+purification.">Genotyping of plant and animal samples without prior DNA purification.</a> Journal of Visualized Experiments. (67), (2012).</li><li>Bin Ali, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+pregnancy+and+birth+rates+with+routine+application+of+nonsurgical+embryo+transfer.">Improved pregnancy and birth rates with routine application of nonsurgical embryo transfer.</a> Transgenic Research. 23 (4), 691-695 (2014).</li><li>Liu, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrase-deficient+lentivirus:+opportunities+and+challenges+for+human+gene+therapy.">Integrase-deficient lentivirus: opportunities and challenges for human gene therapy.</a> Current Gene Therapy. 14 (5), 352-364 (2014).</li><li>Sauvain, M. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genotypic+features+of+lentivirus+transgenic+mice.">Genotypic features of lentivirus transgenic mice.</a> Journal of Virology. 82 (14), 7111-7119 (2008).</li></ol>

La capacidad de los lentivirus para integrarse en su genoma de host hace un vector ideal para genes estable. Vectores lentivirales pueden llevar hasta 8,5 pares del kilobase (kbp) de material genético que puede acomodar a promotores celulares específicos o inducibles, marcadores o moléculas fluorescentes. Incorporado material genómico puede replicar como parte de su genoma huésped y regularse para expresar o desactivar en puntos de tiempo deseado. Estos vectores permiten control spatiotemporal sobre expresión géni...

Este método proporciona instrucciones detalladas para permeabilizing la zona pelúcida de los huevos fertilizado de ratón para acercar a las células embrionarias para la entrega del gene por lentivirus. Lentiviruses son diseñados por naturaleza para la entrega eficaz de genes a células de mamíferos. Infectar células divisorias y no se dividen e integrar el genoma lentivirales su anfitrión cromosomas1. La gama de las células del huésped lentivirales se expande fácilmente por pseudotyping los lentivirus recombinante con la glicoproteína del virus de la estomatitis vesicular (VSV-G), debido al amplio tropismo del VSV-G proteína2. Después de transducción, lentivirales genes estable están integrados y expresados como parte de sus cromosomas de host creando una herramienta ideal para la generación de animales transgénicos. Si se entrega a las células embrionarias de la etapa temprana, el genoma lentivirales es replica y expresa en todo el organismo. Transducción de lentivirales ha llevado a la producción de ratones, rata, pollo, codorniz y cerdo3,4,5,6,7 entre otras especies de transgénicos. El método típico de la entrega del gene lentivirales, sin embargo, requiere de técnicos especializados y equipo especializado para superar la barrera de la zona pelúcida que encapsula los embriones de etapa temprana. El objetivo general de este método es describir cómo permeabilizar la zona usando un laser para facilitar la entrega del gene lentivirales.
Huevos de mamíferos están rodeados por la zona pelúcida que se endurece después de fertilización para proteger los huevos fertilizados contra polyspermy y limitar las interacciones ambientales8,9. La zona forma una barrera que aleja de lentiviruses las células embrionarias hasta que los embriones están sombreados como blastocisto. Cultivado ratón fertilizado los huevos traman después de 4 días y debe ser implantado en ratones seudopreñadas antes de incubación para el desarrollo normal en los cachorros. Por lo tanto, para la transducción, los lentiviruses son microinyectados antes de la eclosión de la zona en la cavidad perivitelino, el espacio entre la zona y las células embrionarias.
La zona pelúcida se quita a menudo para fertilización in vitro de óvulos humanos para aumentar la tasa de fertilización del10. Sin embargo, remoción química de ratón zona pelúcida adversamente afecta el desarrollo del embrión de ratón y es perjudicial para las células embrionarias11,12. Otros métodos para la entrega de genes en huevos fertilizado de ratón superan la barrera de la zona pelúcida por microinyección directa de ADN en el núcleo de la célula del13. Microinyección pronuclear es un medio eficaz de entrega de genes a los embriones. Sin embargo, puesto que cada embrión se lleva a cabo en el lugar individualmente para microinyección, la práctica puede ser laborioso y desperdiciador de tiempo para un usuario novicio.
Otros métodos como la electroporación y photoporation son útiles para transitorio y a corto plazo entrega de genes ratón fertilizado huevos14,15,16. Estos métodos son ampliamente utilizados para la entrega de recombinasas y CRISPR Cas9 componentes. Sin embargo, electroporación y photoporation entrega de genes no puede utilizarse eficazmente para crear transgénicos. Espermatozoides que se recogen del epidídimo de ratón pinchado también pueden ser transduced por lentivirus y utilizados para la fertilización in vitro para producir animales transgénicos17,18,19, 20.
En el presente Protocolo, la entrega del gene lentivirales a embriones de ratón facilita permeabilizing la zona utilizando un láser. El láser de XYClone fue desarrollado como una ayuda para el cultivo de células madre embrionarias22y en vitro fecundación21 . Es un aparato pequeño que es fácil de configurar y fácil de usar. Una vez instalado en un microscopio, que ocupa el espacio de un objetivo y permite que el software que lo acompaña para apuntar el láser mientras mira a través de los oculares del microscopio (ver Protocolo: la sección 3). Una vez que la zona está perforado por el láser de XYClone, lentivirus pueden introducirse en los medios de cultivo para gene entrega23. Lentiviruses múltiples podrían utilizarse para ofrecer simultáneamente varios genes cromosómicos incorporación.
Este protocolo describe cómo aislar y cultura ratón huevos fertilizados, muestra el uso del laser para la perforación de la zona pelúcida y demuestra la transducción de células embrionarias de ratón por lentivirus.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>CD510B-1 plasmid</td>
			<td>System Biosciences</td>
			<td>CD510B-1</td>
			<td>used to package the lentivirus expressing EF1a-copGFP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethylpolysiloxane</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>DMPS5X</td>
			<td>culturing embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hyaluronidase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3506</td>
			<td>used to remove cumulus cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XYClone Laser</td>
			<td>Hamilton Thorne Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>perforating mouse fertilized eggs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-Surgical Embryo Transfer (NSET) Device</td>
			<td>ParaTechs</td>
			<td>60010</td>
			<td>NSET of embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KSOM medium</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MR-020P-5F</td>
			<td>culturing embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Composition of KSOM:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>mg/100mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>555</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>18.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>4.75</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4 7H2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>4.95</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2 2H2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>210</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>3.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na-Pyruvate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>2.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Lactic Acid, sodium salt</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.174mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10mM EDTA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>100&#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomycin</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>6.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5% phenol red</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.1mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>14.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Essential Amino Acids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-essential AA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.5mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M2 medium</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MR-015-D</td>
			<td>culturing embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Composition of M2:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>mg/100mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>25.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate (anhydrous)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>16.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>35.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate, Monobasic</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>16.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>35</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>553.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin, Bovine Fraction</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na-HEPES</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>54.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol Red</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvic Acid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>3.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Lactic Acid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>295</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

laser-assisted lentiviral gene delivery to mouse fertilized eggs

Lentiviruses son eficientes vectores para la entrega de genes a células de mamíferos. Después de transducción, el genoma lentivirales estable se incorpora en el cromosoma del huésped y se pasa a la progenie. Así, son vectores ideales para la creación de líneas celulares estables, en vivo entrega de indicadores y transducción de los huevos sola célula fertilizada para crear animales transgénicos. Sin embargo, ratón huevos fertilizados y embriones de etapa temprana están protegidos por la zona pelúcida, una matriz de la glicoproteína que forma una barrera contra la entrega del gene lentivirales. Lentiviruses son demasiado grandes para penetrar en la zona y por lo general son entregados por microinyección de partículas virales en la cavidad perivitelino, el espacio entre la zona y las células embrionarias. El requisito para tecnólogos altamente capacitados y equipo especializado ha minimizado el uso de lentiviruses para la entrega de genes a los embriones de ratón. Este artículo describe un protocolo para permeabilizing los huevos fertilizado de ratón por la zona de perforación con láser. Perforación del laser no produce ningún daño a los embriones y permite lentiviruses acceder a las células embrionarias para la entrega del gene. Transduced embriones pueden convertirse en blastocistos in vitro y si implantados en ratones seudopreñadas, convertirse en crías transgénicas. El láser utilizado en este protocolo es eficaz y fácil de usar. Entregado por lentivirus estable los genes incorporan células embrionarias de ratón y son germinales transmisibles. Se trata de un método alternativo para la creación de ratones transgénicos que no requiere micromanipulación y microinyección de huevos fertilizados.

Desarrollo de los huevos fertilizado de ratón aislados/transduced puede comprobarse diariamente al microscopio (figura 1). Embriones sanos convierten en blastocisto dentro de 3 a 4 días. En este protocolo, 60 – 70% de los embriones convertirse en blastocisto23. De embriones transduced perforada por láser 114, 54 convertido en blastocisto (tasa del 47%) y 46 blastocistos expresan GFP (46/54 = 85%)23.
<p ...

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Laser-assisted Lentiviral Gene Delivery to Mouse Fertilized Eggs

Ratón huevos fertilizados y embriones de etapa temprana están protegidos por la zona pelúcida, una matriz de la glicoproteína que forma una barrera contra la entrega del gene. Este artículo describe un protocolo para perforar la zona con un láser para transducir las células embrionarias con vectores lentivirales y crear ratones transgénicos.

Entrega de Gene lentivirales asistida por láser ratón huevos fertilizados

Lentiviruses are efficient vectors for gene delivery to mammalian cells. Following transduction, the lentiviral genome is stably incorporated into the ...

Este es un método alternativo y fácil de usar para entregar genes de interés a los huevos de ratón fertilizados a través de la perforación láser de la zona pellucida y la entrega de genes lentivirales. La perforación asistida por láser del procedimiento de donante de ratón también puede aplicarse a los óvulos fertilizados de otras especies para facilitar la entrada de otros tipos de virus o reactivos de transfección. La principal ventaja de esta técnica es que no requiere habilidades especializadas para la micromanipulación y microinyección de los huevos de ratón fertilizados.Demostrar el procedimiento de aislamiento de óvulos de ratón fertilizado será Page Myers, un científico de investigación de la rama de Medicina Comparada en el NIEHS. 16 a 24 horas después del apareamiento, aislar los ovarios y ovucetos de ratones hembra con tapones vaginales, de acuerdo con los protocolos estándar. Cuando se hayan recogido todos los tejidos, desgarra la ampolla de cada ovario y libera los óvulos fertilizados, rodeados de células cumulous, y transfiere los huevos en células cumulous a un plato de 35 milímetros que contiene una x hialuronidasa en medio M2 fresco, para una incubación de tres a cinco minutos a temperatura ambiente.Pipetear los huevos un par de veces para liberar las células cumulous, y transferir los huevos a un nuevo plato de 35 milímetros que contenga el medio M2, con pipeteo para lavar la enzima. A continuación, transfiera los huevos lavados a un plato de 35 milímetros que contenga un medio optimizado para potasio simplex, o KSOM, y la pipeta para lavar el medio M2 restante y la hialuronidasa. Luego, transfiera los huevos a placas tratadas de cultivo de tejido de 35 milímetros sembradas con 50 microlitros de KSOM y dos mililitros de dimetilpolisiloxano para un equilibrio de dos horas a 37 grados centígrados, 5% dióxido de carbono y oxígeno, y 90%nitrógeno.Mientras los huevos están en la incubadora, configurar y calibrar el láser XYClone, de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Cuando los huevos estén listos, coloque la primera placa de gota en la etapa del microscopio láser y enfoque manualmente la zona pellucida. Después de confirmar que la luz LED láser es visible a través del objetivo, mueva la etapa del microscopio para apuntar a la zona con el láser LED, y utilice el software de la computadora para establecer el láser XYClone en 250 microsegundos.Ajuste el tamaño de la luz LED a las dimensiones adecuadas y perfore la zona pellucida de cada huevo tres veces con el láser para producir tres agujeros de 10 micrómetros. Es fundamental realizar la perforación rápidamente, pero con cuidado, ya que los óvulos fertilizados no pueden mantenerse fuera de la incubadora durante más de 15 minutos. Luego, devuelva los huevos perforados a la incubadora durante otras dos horas.Al final de la segunda incubación, tratar la caída de 50 microlitros KSOM con dos microlitros de lentivirus concentrado sin mezclar. Y devolver los huevos a la incubadora durante cuatro días. Cuando los óvulos se hayan convertido en blastocistos, utilice un dispositivo de transferencia de embriones no quirúrgicos para depositar aproximadamente 10-15 embriones en unos dos microlitros de KSOM.17 días después de la transferencia del embrión, permitir que el ratón embarazada dé a luz naturalmente o recoger los neonatos por cesárea según sea necesario. Luego, recoger el tejido de los cachorros para el genotipado, para determinar la tasa de transgénesis. El desarrollo de óvulos aislados y transducidos fertilizados con ratón se puede comprobar diariamente bajo el microscopio.Entre el 60 y el 70% de los embriones sanos y no tratados se convierten en blastocistos en un plazo de tres a cuatro días. Mientras que alrededor del 47% de los embriones transducidos perforados con láser se convierten en blastocistos, de los cuales el 85% expresan el gen de interés tranducido. Apuntar al láser a adelgazar la zona, en lugar de crear un agujero, permite que los embriones en desarrollo se beneficien de una zona pellucida intacta, encapsulando sin dejar de ser permisiva a la transducción lentiviral.La transducción con un lentivirus recombinante, expresando copepod GFP de un promotor de factor de alargamiento 1A induce múltiples integraciones lentivirales, y una alta expresión de GFP bajo una lámpara LED azul. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que, si bien la capacidad de los lentivirus para integrarse en el genoma del huésped los convierte en una poderosa herramienta para la entrega estable de genes, pero la integración aleatoria también puede introducir mutaciones de inserción. Esta técnica podría permitir a los investigadores en el campo de la genética desarrollar rápidamente modelos animales transgénicos para el estudio de la enfermedad para la producción de proteínas in vivo, o para estudios genéticos funcionales.Después de este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como la inmunohistoquímica en muestras de tejido aislado de cachorros transducidos para responder preguntas adicionales sobre la ubicación y el alcance de la expresión génica en diversos tejidos de interés. No olvide que trabajar con lentivirus puede ser extremadamente peligroso. Por lo tanto, siga sus pautas institucionales para trabajar con lentivirus.Use ropa protectora personal y descontamine todos los residuos antes de su eliminación.

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