Name: laser-assisted lentiviral gene delivery to mouse fertilized eggs
Uploaded: 2018-11-01T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Laser-assisted Lentiviral Gene Delivery to Mouse Fertilized Eggs at JoVE.com

Denna forskning stöds av intramurala forskningsprogrammet av National Institute of Health (NIH), nationella Institute of Environmental Health Sciences (NIEHS). Vi är tacksamma att Dr. Robert Petrovich och Dr Jason Williams för kritisk läsning av manuskript och användbara råd. Vi vill också erkänna och tacka Dr. Bernd Gloss, Knockout kärnan, Flow flödescytometri anläggningen, den fluorescensmikroskopi och Imaging Center och jämförande medicin gren anläggningar i NIEHS för deras tekniska bidrag. Vi vill tacka Mr David Goulding från grenen jämförande medicin och Ms. Lois Wyrick för Imaging Center vid NIEHS för att förse oss med fotografier och illustrationer.

Alla djur förfaranden och behandlingar som används i detta protokoll var enligt NIH/NIEHS djurvård riktlinjer och godkändes av djur vård och användning kommittén (ACUC) på den NIH/NIEHS, djur protokoll 2010-0004.
1. förberedelser
<ol><li>Förbereda/köp rekombinant icke-föröknings lentiviruses transporterar din gen av intresse. I denna studie, lentivirus SBI511 uttrycker hoppkräftor grönt fluorescerande protein (copGFP; förkortas till GFP) från en töjning faktor 1a arrangöre...

<ol>
	<li>Sakuma, T., Barry, M. A., Ikeda, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentiviral+vectors:+basic+to+translational.">Lentiviral vectors: basic to translational.</a> Biochemical Journal. 443 (3), 603-618 (2012).</li><li>Salmon, P., Trono, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+and+titration+of+lentiviral+vectors.">Production and titration of lentiviral vectors.</a> Current Protocols in Human Genetics. , (2007).</li><li>Lois, C., Hong, E. J., Pease, S., Brown, E. J., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germline+transmission+and+tissue-specific+expression+of+transgenes+delivered+by+lentiviral+vectors.">Germline transmission and tissue-specific expression of transgenes delivered by lentiviral vectors.</a> Science. 295 (5556), 868-872 (2002).</li><li>Filipiak, W. E., Saunders, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+transgenic+rat+production.">Advances in transgenic rat production.</a> Transgenic Research. 15 (6), 673-686 (2006).</li><li>McGrew, M. J., Sherman, A., Lillico, S. G., Taylor, L., Sang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+conservation+between+rodents+and+chicken+of+regulatory+sequences+driving+skeletal+muscle+gene+expression+in+transgenic+chickens.">Functional conservation between rodents and chicken of regulatory sequences driving skeletal muscle gene expression in transgenic chickens.</a> BMC Developmental Biology. 10, 26 (2010).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+transgenic+pigs+mediated+by+pseudotyped+lentivirus+and+sperm.">Production of transgenic pigs mediated by pseudotyped lentivirus and sperm.</a> PLoS One. 7 (4), e35335 (2012).</li><li>Zhang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+quail+production+by+microinjection+of+lentiviral+vector+into+the+early+embryo+blood+vessels.">Transgenic quail production by microinjection of lentiviral vector into the early embryo blood vessels.</a> PLoS One. 7 (12), e50817 (2012).</li><li>Wassarman, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zona+pellucida+glycoproteins.">Zona pellucida glycoproteins.</a> Annul Review of Biochemistry. 57, 415-442 (1988).</li><li>Clift, D., Schuh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Restarting+life:+fertilization+and+the+transition+from+meiosis+to+mitosis.">Restarting life: fertilization and the transition from meiosis to mitosis.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (9), 549-562 (2013).</li><li>Fong, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blastocyst+transfer+after+enzymatic+treatment+of+the+zona+pellucida:+improving+in-vitro+fertilization+and+understanding+implantation.">Blastocyst transfer after enzymatic treatment of the zona pellucida: improving in-vitro fertilization and understanding implantation.</a> Human Reproduction. 13 (10), 2926-2932 (1998).</li><li>Nijs, M., Van Steirteghem, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+different+isolation+procedures+for+blastomeres+from+two-cell+mouse+embryos.">Assessment of different isolation procedures for blastomeres from two-cell mouse embryos.</a> Human Reproduction. 2 (5), 421-424 (1987).</li><li>Ribas, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+zona+pellucida+removal+on+DNA+methylation+in+early+mouse+embryos.">Effect of zona pellucida removal on DNA methylation in early mouse embryos.</a> Biology of Reproduction. 74 (2), 307-313 (2006).</li><li>Gordon, J. W., Scangos, G. A., Plotkin, D. J., Barbosa, J. A., Ruddle, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+transformation+of+mouse+embryos+by+microinjection+of+purified+DNA.">Genetic transformation of mouse embryos by microinjection of purified DNA.</a> Proceedings of National Academy of Science U S A. 77 (12), 7380-7384 (1980).</li><li>Kaneko, T., Sakuma, T., Yamamoto, T., Mashimo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+knockout+by+electroporation+of+engineered+endonucleases+into+intact+rat+embryos.">Simple knockout by electroporation of engineered endonucleases into intact rat embryos.</a> Scientific Reports. 4, 6382 (2014).</li><li>Hosokawa, Y., Ochi, H., Iino, T., Hiraoka, A., Tanaka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoporation+of+biomolecules+into+single+cells+in+living+vertebrate+embryos+induced+by+a+femtosecond+laser+amplifier.">Photoporation of biomolecules into single cells in living vertebrate embryos induced by a femtosecond laser amplifier.</a> PLoS One. 6 (11), e27677 (2011).</li><li>Horii, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+microinjection+methods+for+generating+knockout+mice+by+CRISPR/Cas-mediated+genome+engineering.">Validation of microinjection methods for generating knockout mice by CRISPR/Cas-mediated genome engineering.</a> Scientific Reports. 4, 4513 (2014).</li><li>Hamra, F. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+transgenic+rats+by+lentiviral+transduction+of+male+germ-line+stem+cells.">Production of transgenic rats by lentiviral transduction of male germ-line stem cells.</a> Proceedings of National Academy of Science U S A. 99 (23), 14931-14936 (2002).</li><li>Kanatsu-Shinohara, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+transgenic+rats+via+lentiviral+transduction+and+xenogeneic+transplantation+of+spermatogonial+stem+cells.">Production of transgenic rats via lentiviral transduction and xenogeneic transplantation of spermatogonial stem cells.</a> Biology of Reproduction. 79 (6), 1121-1128 (2008).</li><li>Dann, C. T., Garbers, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+knockdown+rats+by+lentiviral+transduction+of+embryos+with+short+hairpin+RNA+transgenes.">Production of knockdown rats by lentiviral transduction of embryos with short hairpin RNA transgenes.</a> Methods in Molecular Biology. 450, 193-209 (2008).</li><li>Chandrashekran, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+generation+of+transgenic+mice+by+lentivirus-mediated+modification+of+spermatozoa.">Efficient generation of transgenic mice by lentivirus-mediated modification of spermatozoa.</a> FASEB Journal. 28 (2), 569-576 (2014).</li><li>Woods, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser-assisted+in+vitro+fertilization+facilitates+fertilization+of+vitrified-warmed+C57BL/6+mouse+oocytes+with+fresh+and+frozen-thawed+spermatozoa,+producing+live+pups.">Laser-assisted in vitro fertilization facilitates fertilization of vitrified-warmed C57BL/6 mouse oocytes with fresh and frozen-thawed spermatozoa, producing live pups.</a> PLoS One. 9 (3), e91892 (2014).</li><li>Tanaka, N., Takeuchi, T., Neri, Q. V., Sills, E. S., Palermo, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser-assisted+blastocyst+dissection+and+subsequent+cultivation+of+embryonic+stem+cells+in+a+serum/cell+free+culture+system:+applications+and+preliminary+results+in+a+murine+model.">Laser-assisted blastocyst dissection and subsequent cultivation of embryonic stem cells in a serum/cell free culture system: applications and preliminary results in a murine model.</a> Journal of Translational Medicine. 4, 20 (2006).</li><li>Martin, N. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=En+masse+lentiviral+gene+delivery+to+mouse+fertilized+eggs+via+laser+perforation+of+zona+pellucida.">En masse lentiviral gene delivery to mouse fertilized eggs via laser perforation of zona pellucida.</a> Transgenic Research. 27 (1), 39-49 (2018).</li><li>Lawitts, J. A., Biggers, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+of+preimplantation+embryos.">Culture of preimplantation embryos.</a> Methods in Enzymology. 225, 153-164 (1993).</li><li>Stein, P., Schindler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+oocyte+microinjection,+maturation+and+ploidy+assessment.">Mouse oocyte microinjection, maturation and ploidy assessment.</a> Journal of Visualized Experiments. (53), (2011).</li><li>Nagy, A., Gertsenstein, M., Vintersten, K., Behringer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caesarean+section+and+fostering.">Caesarean section and fostering.</a> CSH Protocols. 2006 (2), (2006).</li><li>Chum, P. Y., Haimes, J. D., Andre, C. P., Kuusisto, P. K., Kelley, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genotyping+of+plant+and+animal+samples+without+prior+DNA+purification.">Genotyping of plant and animal samples without prior DNA purification.</a> Journal of Visualized Experiments. (67), (2012).</li><li>Bin Ali, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+pregnancy+and+birth+rates+with+routine+application+of+nonsurgical+embryo+transfer.">Improved pregnancy and birth rates with routine application of nonsurgical embryo transfer.</a> Transgenic Research. 23 (4), 691-695 (2014).</li><li>Liu, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrase-deficient+lentivirus:+opportunities+and+challenges+for+human+gene+therapy.">Integrase-deficient lentivirus: opportunities and challenges for human gene therapy.</a> Current Gene Therapy. 14 (5), 352-364 (2014).</li><li>Sauvain, M. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genotypic+features+of+lentivirus+transgenic+mice.">Genotypic features of lentivirus transgenic mice.</a> Journal of Virology. 82 (14), 7111-7119 (2008).</li></ol>

Lentiviruses förmåga att integrera i sin värd genomet gör dem en idealisk vektor för stabil gen leverans. Lentiviral vektorer kan bära upp till 8,5 kilobase par (kbp) av genetiskt material som kan rymma-specifika eller inducerbara initiativtagare, markörerna eller fluorescerande beståndsdelarna. Bolagiserade genomisk material kan replikeras som en del av sin värd genomet och regleras för att uttrycka eller inaktivera vid önskade tidpunkter. Dessa vektorer Tillåt för spatiotemporal kontroll över genuttryck i...

Denna metod ger detaljerade anvisningar för permeabilizing zona pellucida mus befruktade ägg att göra embryonala celler tillgängligt för gen leverans genom lentiviruses. Lentiviruses är designad av naturen för effektiv gen leverans till däggdjursceller. De infektera avdelande och icke-dela celler och integrera deras värd kromosomerna1lentiviral genomet. Lentiviral värd cellintervallet utökas lätt genom pseudotyping den rekombinanta lentivirus med den vesikulär stomatit virus glykoprotein (VSV-G), på grund av den breda tropism av VSV-G protein2. Efter transduktion, lentiviral gener är stabilt integrerat och uttryckt som del av deras värd kromosomer skapar ett idealiskt verktyg för att generera transgena djur. Om levereras till tidiga skede embryonala celler, lentiviral genomet replikeras och uttryckt i hela organismen. Lentiviral transduktion har lett till produktionen av möss, råttor, kyckling, vaktel och gris3,4,5,6,7 bland andra arter av transgenics. Den typiska lentiviral gen leverans, dock kräver skickliga tekniker och specialutrustning för att övervinna den zona pellucida barriär som kapslar in de tidiga skede embryona. Det övergripande målet med denna metod är att beskriva hur man permeabilize de zona använder en laser för att underlätta lentiviral gen leverans.
Däggdjur ägg är omgivna av zona pellucida som stelnar efter befruktning att skydda de befruktade äggen mot polyspermy och begränsa miljösamspel8,9. Zona bildar en barriär som håller lentiviruses borta från de embryonala cellerna tills embryon har kläckts som en blastocyst. Odlade mus befruktade äggen kläcks efter 4 dagar och måste implanteras i pseudopregnant möss före kläckningen för normal utveckling till valpar. Därför för transduktion, är lentiviruses microinjected före kläckningen från zona in i det perivitelline hålet, avståndet mellan zona och embryonala celler.
Zona pellucida är ofta bort för in vitro- befruktning av ägg från människa att öka de befruktning ränta10. Dock kemisk borttagning av mus zona pellucida negativt påverkar mus embryots utveckling och är skadligt för embryonala celler11,12. Andra metoder för genterapi leverans till mus befruktade ägg övervinna zona pellucida barriären av direkta Mikroskop av DNA i cellen kärna13. Pronukleär Mikroskop är ett effektivt sätt att leverera gener till embryon. Eftersom varje embryo hålls på plats individuellt för Mikroskop, kan praxis dock mödosamt och tidskrävande för en novis användare.
Andra metoder såsom elektroporation och photoporation är användbara för övergående och kortvariga gen leverans till mus befruktade ägg14,15,16. Dessa metoder används i stor utsträckning för att leverera CRISPR-Cas9 komponenter och rekombinaser. Elektroporation och photoporation leverans av gener inte kan dock användas effektivt skapa transgenics. Spermier som samlas in från punkterad mus bitestiklarna kan också sensorik av lentiviruses och används för in vitro- befruktning för att producera transgena djur17,18,19, 20.
I detta protokoll underlättas lentiviral gen leverans till musembryon av permeabilizing i zona med hjälp av en laser. XYClone lasern utvecklades som ett stöd för in vitro- fertilisering21 och odling av embryonala stamceller22. Det är en liten apparat som är enkel att installera och lätt att använda. En gång installerat på ett mikroskop, det upptar utrymmet av en objektiv och den medföljande programvaran tillåter för att sikta lasern medan du tittar i Mikroskop okularen (se protokoll: avsnitt 3). När zona är perforerad av XYClone lasern, kan lentiviruses införas i kultur media för gen leverans23. Flera lentiviruses kunde användas samtidigt leverera flera gener för kromosomala iblandning.
Detta protokoll ska beskriva hur man isolera och kultur mus befruktade ägg, illustrerar användningen av laser för perforering av zona pellucida och visar transduktion mus embryonala celler av lentiviruses.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>CD510B-1 plasmid</td>
			<td>System Biosciences</td>
			<td>CD510B-1</td>
			<td>used to package the lentivirus expressing EF1a-copGFP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethylpolysiloxane</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>DMPS5X</td>
			<td>culturing embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hyaluronidase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3506</td>
			<td>used to remove cumulus cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XYClone Laser</td>
			<td>Hamilton Thorne Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>perforating mouse fertilized eggs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-Surgical Embryo Transfer (NSET) Device</td>
			<td>ParaTechs</td>
			<td>60010</td>
			<td>NSET of embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KSOM medium</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MR-020P-5F</td>
			<td>culturing embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Composition of KSOM:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>mg/100mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>555</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>18.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>4.75</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4 7H2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>4.95</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2 2H2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>210</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>3.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na-Pyruvate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>2.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Lactic Acid, sodium salt</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.174mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10mM EDTA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>100&#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomycin</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>6.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5% phenol red</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.1mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>14.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Essential Amino Acids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-essential AA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.5mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M2 medium</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MR-015-D</td>
			<td>culturing embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Composition of M2:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>mg/100mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>25.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate (anhydrous)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>16.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>35.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate, Monobasic</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>16.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>35</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>553.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin, Bovine Fraction</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na-HEPES</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>54.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol Red</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvic Acid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>3.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Lactic Acid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>295</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

laser-assisted lentiviral gene delivery to mouse fertilized eggs

Lentiviruses är effektiva vektorer för gen leverans till däggdjursceller. Efter transduktion, lentiviral genomet är stabilt införlivas med kromosomen värd och förs vidare till avkomman. Således, är de idealiska vektorer för skapandet av stabila cellinjer, i vivo leverans av indikatorer och transduktion enda cell befruktade ägg att skapa transgena djur. Men musen befruktade ägg och tidiga skede embryon skyddas av zona pellucida, ett glykoprotein matris som bildar en barriär mot lentiviral gen leverans. Lentiviruses är för stora för att tränga in i zona och levereras vanligtvis av Mikroskop av viruspartiklar in perivitelline kaviteten, avståndet mellan zona och embryonala celler. Kravet på högutbildade tekniker och specialutrustning har minimerat användningen av lentiviruses för gen leverans till musembryon. I artikeln beskrivs ett protokoll för permeabilizing mus befruktade ägg av perforering i zona med laser. Laserperforering resulterar inte i någon skada embryon och tillåter lentiviruses att få tillgång till embryonala celler för gen leverans. Sensorik embryon kan utvecklas till blastocysten in vitro och om implanteras i pseudopregnant möss, utvecklas till transgena pups. Den laser som används i detta protokoll är effektiv och lätt att använda. Gener som levereras av lentiviruses stabilt införliva mus embryonala celler och är könsceller överförbara. Detta är en alternativ metod för skapandet av transgena möss som kräver ingen mikromanipulation och Mikroskop av befruktade ägg.

Utveckling av isolerade/sensorik mus befruktade ägg kan kontrolleras under mikroskopet dagligen (figur 1). Friska embryon utvecklas till blastocyst inom 3 – 4 dagar. I detta protokoll utvecklas 60 – 70% av obehandlade embryon till blastocyst23. Av 114 laser-perforerade sensorik embryon, 54 utvecklats till blastocyst (andelen 47%) och 46 blastocyster uttryckt GFP (46/54 = 85%)23.
<p class="jove_content" ...

Watch this Scientific Journal Video about Laser-assisted Lentiviral Gene Delivery to Mouse Fertilized Eggs at JoVE.com

Laser-assisted Lentiviral Gene Delivery to Mouse Fertilized Eggs

Mus befruktade ägg och tidiga skede embryon skyddas av zona pellucida, ett glykoprotein matris som bildar en barriär mot gen leverans. I artikeln beskrivs ett protokoll för perforering av zona med laser transduce embryonala celler med lentiviral vektorer och skapa transgena möss.

Laser-assisted Lentiviral gen leverans till mus befruktade ägg

Lentiviruses are efficient vectors for gene delivery to mammalian cells. Following transduction, the lentiviral genome is stably incorporated into the ...

Detta är en alternativ och lättanvänd metod för att leverera gener av intresse för befruktade musägg via laserperforering av zona pellucida och lentiviral genleverans. Laserassisterad perforering av musdonatorförfarandet kan också vara tillämpligt på andra arters befruktade ägg för att underlätta inträde av andra typer av virus eller reagenser för transfektion. Den största fördelen med denna teknik är att det inte kräver några specialiserade färdigheter för mikromanipulation och mikroinjektion av de befruktade musäggen.Visar befruktade mus ägg isolering förfarande kommer att Page Myers, en forskare från jämförande medicin gren vid NIEHS. 16 till 24 timmar efter parning, isolera äggstockarna och ägggångarna från kvinnliga möss med vaginala pluggar, enligt standardprotokoll. När alla vävnader har samlats in, riva ampulla av varje äggstock isär, och släppa de befruktade äggen, omgiven av cumulous celler, och överföra äggen i cumulous celler till en 35 millimeters maträtt som innehåller en x hyaluronidase i färskt M2 medium, för en tre till fem minuters inkubering vid rumstemperatur.Pipettera äggen några gånger för att frigöra cumulous celler, och överföra äggen till en ny 35 millimeter maträtt som innehåller M2 medium, med pipettering att tvätta bort enzymet. Därefter överför de tvättade äggen till en 35 millimeters maträtt som innehåller kalium simplex optimerat medium, eller KSOM, och pipetten för att tvätta bort de återstående M2-medium och hyaluronidase. Sedan överföra äggen till 35 millimeter vävnad-kultur behandlade plattor seedade med 50 mikroliter av KSOM och två milliliter dimetylpolysiloxan för en två timmars jämvikt vid 37 grader Celsius, 5%koldioxid och syre, och 90%kväve.Medan äggen är i inkubatorn, ställa in och kalibrera XYClone laser, enligt tillverkarens rekommendationer. När äggen är klara, placera den första droppplattan på lasermikroskopet scenen, och manuellt fokusera zona pellucida. Efter att ha bekräftat att laser LED-ljuset är synligt genom målet, flytta mikroskopet scenen för att rikta zona med LED-laser, och använda datorns programvara för att ställa in XYClone laser till 250 mikrosekond.Justera LED-ljusstorleken till lämpliga dimensioner, och perforera zona pellucida av varje ägg tre gånger med lasern för att producera tre 10-mikrometer hål. Det är avgörande att utföra perforeringen snabbt, men försiktigt, eftersom de befruktade äggen inte kan hålla utanför inkubatorn längre än 15 minuter. Sedan, returnera perforerade ägg till ruvmaskinen i ytterligare två timmar.Vid slutet av den andra inkubationen behandlar du 50 mikroliter KSOM-droppen med två mikroliter av koncentrerat lentivirus utan att blanda. Och återlämna äggen till ruvmaskinen i fyra dagar. När äggen har utvecklats till blastocysts, använd en icke-kirurgisk embryoöverföringsanordning, för att deponera cirka 10-15 embryon i en cirka två mikroliter av KSOM.17 dagar efter embryoöverföringen, låt den dräktiga musen föda naturligt eller samla in de nyfödda med kejsarsnitt vid behov. Sedan, samla vävnad från ungarna för genotypning, för att bestämma graden av transgenesis. Isolerade och transduced mus-befruktade ägg utveckling kan kontrolleras under mikroskop dagligen.60 till 70% av friska, obehandlade embryon utvecklas till blastocysts inom tre till fyra dagar. Medan omkring 47%av laser-perforerade, transduced embryon utvecklas till blastocysts, 85%av vilka uttrycka den tranduced genen av intresse. Siktar lasern för att tunna zona, istället för att skapa ett hål, gör det möjligt för de växande embryon att dra nytta av en intakt, inkapsla zona pellucida samtidigt som den är tillåtande till lentiviral transduktion.Transduktion med en rekombinant lentivirus, uttrycker copepod GFP från en töjning faktor 1A promotorn inducerar flera lentiviral integrationer, och ett högt uttryck för GFP under en blå LED-lampa. Samtidigt som man försöker detta förfarande, är det viktigt att komma ihåg att, medan förmågan hos lentiviruses att integrera i värdgenomet gör dem ett kraftfullt verktyg för stabil gen leverans, men slumpmässiga integration kan också införa insertional mutationer. Denna teknik skulle kunna göra det möjligt för forskare inom genetik att snabbt utveckla transgena djurmodeller för studier av sjukdom för in vivo proteinproduktion, eller för funktionella genstudier.Efter detta förfarande, andra metoder som immunohistokemi kan utföras på isolerade vävnadsprover från transduced ungar att svara på ytterligare frågor om platsen och omfattningen av genuttryck i olika vävnader av intresse. Glöm inte att arbeta med lentivirus kan vara extremt farligt. Följ därför dina institutionella riktlinjer för arbete med lentivirus.Använd personliga skyddskläder och sanera allt avfall före bortskaffande.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Genetics

Viruses

SCIENTISTS IN ACTION

Windowing Chicken Eggs for Developmental Studies

Windowing hönsägg för utvecklingsstudier

The study of development has been greatly aided by the use of the chick embryo as an experimental model.  The ease of accessibility of the embryo has ...

Obtaining Eggs from Xenopus laevis Females

Skaffa Ägg från Xenopus laevis Kvinnor

The eggs of Xenopus laevis intact, lysed, and/or fractionated are useful for a wide variety of experiments. This protocol shows how to induce egg laying, ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

Använda Gene Pulser MXcell elektroporation System till transfektera primärceller med hög verkningsgrad

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

In vivo Imaging och terapeutiska behandlingar i en Orthotopic musmodell av äggstockscancer

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models.  This paper describes the development of an orthotopic mouse model ...

Isolation and Culture of Cells from the Nephrogenic Zone of the Embryonic Mouse Kidney

Isolering och odling av celler från Nefrogen Zonen av embryonala Mouse Kidney

Embryonic development of the kidney has been extensively studied both as a model for epithelial-mesenchymal interaction in organogenesis and  to gain ...

Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides

Använda SecM Arrest sekvens som ett verktyg för Isolera ribosom Bundna Polypeptider

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway ...

Intraductal Injection for Localized Drug Delivery to the Mouse Mammary Gland

Intraductal Injektion för Lokaliserad Drug Delivery till Mouse bröstkörtel

Herein we describe a protocol to deliver various reagents to the mouse mammary gland via intraductal injections. Localized drug delivery and knock-down of ...

Transient Expression of Proteins by Hydrodynamic Gene Delivery in Mice

Transient Expression av proteiner från Hydrodynamisk Gene Delivery hos möss

Efficient expression of transgenes in vivo is of critical importance in studying gene function and developing treatments for diseases. Over the past ...

Phage-mediated Delivery of Targeted sRNA Constructs to Knock Down Gene Expression in E. coli

Phage-mediated Delivery of Targeted sRNA Constructs to Knock Down Gene Expression in E. coli

Fag-medierad leverans av riktade sRNA Konstruerar slå ner genuttryck i<em&gt; E. coli</em

RNA-mediated knockdowns are widely used to control gene expression. This versatile family of techniques makes use of short RNA (sRNA) that can be ...

Laser-assisted Microdissection (LAM) as a Tool for Transcriptional Profiling of Individual Cell Types

Laser-assisted Microdissection LAM as a Tool for Transcriptional Profiling of Individual Cell Types

Laser-assisted Microdissection (LAM) som ett verktyg för transkriptions Profilering av enskilda celltyper

The understanding of developmental processes at the molecular level requires insights into transcriptional regulation, and thus the transcriptome, at the ...