Name: fabrication of anisotropic polymeric artificial antigen presenting cells for cd8+ t cell activation
Uploaded: 2018-10-12T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fabrication of Anisotropic Polymeric Artificial Antigen Presenting Cells for CD8+ T Cell Activation at JoVE.com

EBA (DGE-1746891) og KRR (DGE-1232825) takke NSF Graduate Research Fellowship program for støtte. RAM tak National Research Service Award NIH NCI F31 (F31CA214147) og præstation belønninger for College forskere Fellowship for støtte. Forfatterne takke NIH (R01EB016721 og R01CA195503), forskning at forebygge blindhed James og Carole gratis katalysator Award, og JHU Bloomberg-Kimmel Institute for Cancer immunterapi for støtte.

Alle metoder beskrevet her er blevet godkendt af institutionelle Animal Care og brug udvalg (IACUC) af Johns Hopkins University.
1. fabrikation af sfæriske PLGA partikler af afstemmelige størrelse
<ol><li>Udarbejdelse af materialer til partikel syntese<ol>
<li>Forberede 5% w/w polyvinylalkohol (PVA) løsning.<ol>
<li>Tilføje 500 mL deioniseret vand (DI) vand til en Erlenmeyer-kolbe med en magnetisk røre bar og placere på varmepladen omrører ved 500 rpm og overvåge temperatur med termo...

<ol>
	<li>Eggermont, L. J., Paulis, L. E., Tel, J., Figdor, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+efficient+cancer+immunotherapy:+Advances+in+developing+artificial+antigen-presenting+cells.">Towards efficient cancer immunotherapy: Advances in developing artificial antigen-presenting cells.</a> Trends in Biotechnology. 32 (9), 456-465 (2014).</li><li>Maus, M. V., Riley, J. L., Kwok, W. W., Nepom, G. T., June, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HLA+tetramer-based+artificial+antigen-presenting+cells+for+stimulation+of+CD4++T+cells.">HLA tetramer-based artificial antigen-presenting cells for stimulation of CD4+ T cells.</a> Clinical Immunology. 106 (1), 16-22 (2003).</li><li>Oelke, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+induction+and+expansion+of+antigen-specific+cytotoxic+T+cells+by+HLA-Ig-coated+artificial+antigen-presenting+cells.">Ex vivo induction and expansion of antigen-specific cytotoxic T cells by HLA-Ig-coated artificial antigen-presenting cells.</a> Nature Medicine. 9 (5), 619-624 (2003).</li><li>Rudolf, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potent+costimulation+of+human+CD8+T+cells+by+anti-4-1BB+and+anti-CD28+on+synthetic+artificial+antigen+presenting+cells.">Potent costimulation of human CD8 T cells by anti-4-1BB and anti-CD28 on synthetic artificial antigen presenting cells.</a> Cancer Immunology, Immunotherapy. 57 (2), 175-183 (2008).</li><li>Tham, E. L., Jensen, P. L., Mescher, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+antigen-specific+T+cells+by+artificial+cell+constructs+having+immobilized+multimeric+peptide-class+I+complexes+and+recombinant+B7-Fc+proteins.">Activation of antigen-specific T cells by artificial cell constructs having immobilized multimeric peptide-class I complexes and recombinant B7-Fc proteins.</a> Journal of Immunological Methods. 249 (1-2), 111-119 (2001).</li><li>Perica, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+field-induced+T+cell+receptor+clustering+by+nanoparticles+enhances+T+cell+activation+and+stimulates+antitumor+activity.">Magnetic field-induced T cell receptor clustering by nanoparticles enhances T cell activation and stimulates antitumor activity.</a> ACS Nano. 8 (3), 2252-2260 (2014).</li><li>Steenblock, E. R., Fadel, T., Labowsky, M., Pober, J. S., Fahmy, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+artificial+antigen-presenting+cell+with+paracrine+delivery+of+IL-2+impacts+the+magnitude+and+direction+of+the+T+cell+response.">An artificial antigen-presenting cell with paracrine delivery of IL-2 impacts the magnitude and direction of the T cell response.</a> The Journal of Biological Chemistry. 286 (40), 34883-34892 (2011).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paracrine+release+of+IL-2+and+anti-CTLA-4+enhances+the+ability+of+artificial+polymer+antigen-presenting+cells+to+expand+antigen-specific+T+cells+and+inhibit+tumor+growth+in+a+mouse+model.">Paracrine release of IL-2 and anti-CTLA-4 enhances the ability of artificial polymer antigen-presenting cells to expand antigen-specific T cells and inhibit tumor growth in a mouse model.</a> Cancer Immunology, Immunotherapy. 66 (9), 1229-1241 (2017).</li><li>Mescher, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+contact+requirements+for+activation+of+cytotoxic+T+lymphocytes.">Surface contact requirements for activation of cytotoxic T lymphocytes.</a> The Journal of Immunology. 149 (7), 2402-2405 (1992).</li><li>Steenblock, E. R., Fahmy, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+platform+for+ex+vivo+T-cell+expansion+based+on+biodegradable+polymeric+artificial+antigen-presenting+cells.">A comprehensive platform for ex vivo T-cell expansion based on biodegradable polymeric artificial antigen-presenting cells.</a> Molecular Therapy. 16 (4), 765-772 (2008).</li><li>Fifis, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size-dependent+immunogenicity:+therapeutic+and+protective+properties+of+nano-vaccines+against+tumors.">Size-dependent immunogenicity: therapeutic and protective properties of nano-vaccines against tumors.</a> The Journal of Immunology. 173 (5), 3148-3154 (2004).</li><li>Sunshine, J. C., Perica, K., Schneck, J. P., Green, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Particle+shape+dependence+of+CD8++T+cell+activation+by+artificial+antigen+presenting+cells.">Particle shape dependence of CD8+ T cell activation by artificial antigen presenting cells.</a> Biomaterials. 35 (1), 269-277 (2014).</li><li>Meyer, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biodegradable+nanoellipsoidal+artificial+antigen+presenting+cells+for+antigen+specific+T-cell+activation.">Biodegradable nanoellipsoidal artificial antigen presenting cells for antigen specific T-cell activation.</a> Small. 11 (13), 1519-1525 (2015).</li><li>Champion, J. A., Katare, Y. K., Mitragotri, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Particle+shape:+a+new+design+parameter+for+micro-+and+nanoscale+drug+delivery+carriers.">Particle shape: a new design parameter for micro- and nanoscale drug delivery carriers.</a> Journal of Controlled Release. 121 (1-2), 3-9 (2007).</li><li>Meyer, R. A., Meyer, R. S., Green, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+automated+multidimensional+thin+film+stretching+device+for+the+generation+of+anisotropic+polymeric+micro-+and+nanoparticles.">An automated multidimensional thin film stretching device for the generation of anisotropic polymeric micro- and nanoparticles.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 103 (8), 2747-2757 (2015).</li><li>Ho, C. C., Keller, A., Odell, J. A., Ottewill, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+monodisperse+ellipsoidal+polystyrene+particles.">Preparation of monodisperse ellipsoidal polystyrene particles.</a> Colloid and Polymer Science. 271 (5), 469-479 (1993).</li><li>Shum, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet+microfluidics+for+fabrication+of+non-spherical+particles.">Droplet microfluidics for fabrication of non-spherical particles.</a> Macromolecular Rapid Communications. 31 (2), 108-118 (2010).</li><li>Lan, W., Li, S., Xu, J., Luo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controllable+preparation+of+nanoparticle-coated+chitosan+microspheres+in+a+co-axial+microfluidic+device.">Controllable preparation of nanoparticle-coated chitosan microspheres in a co-axial microfluidic device.</a> Lab on a Chip. 11 (4), 652-657 (2011).</li><li>Yang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+synthesis+of+multifunctional+Janus+particles+for+biomedical+applications.">Microfluidic synthesis of multifunctional Janus particles for biomedical applications.</a> Lab on a Chip. 12 (12), 2097-2102 (2012).</li><li>Zhou, Z., Anselmo, A. C., Mitragotri, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+protein-based,+rod-shaped+particles+from+spherical+templates+using+layer-by-layer+assembly.">Synthesis of protein-based, rod-shaped particles from spherical templates using layer-by-layer assembly.</a> Advanced Materials. 25 (19), 2723-2727 (2013).</li><li>Jang, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Striped,+ellipsoidal+particles+by+controlled+assembly+of+diblock+copolymers.">Striped, ellipsoidal particles by controlled assembly of diblock copolymers.</a> Journal of the American Chemical Society. 135 (17), 6649-6657 (2013).</li><li>Petzetakis, N., Dove, A. P., O'Reilly, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cylindrical+micelles+from+the+living+crystallization-driven+self-assembly+of+poly(lactide)-containing+block+copolymers.">Cylindrical micelles from the living crystallization-driven self-assembly of poly(lactide)-containing block copolymers.</a> Chemical Science. 2 (5), 955-960 (2011).</li><li>Rolland, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+fabrication+and+harvesting+of+monodisperse,+shape-specific+nanobiomaterials.">Direct fabrication and harvesting of monodisperse, shape-specific nanobiomaterials.</a> Journal of the American Chemical Society. 127 (28), 10096-10100 (2005).</li><li>Meyer, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anisotropic+biodegradable+lipid+coated+particles+for+spatially+dynamic+protein+presentation.">Anisotropic biodegradable lipid coated particles for spatially dynamic protein presentation.</a> Acta Biomaterialia. 72, 228-238 (2018).</li></ol>

Denne protokol beskriver i detaljer en alsidig metode for den præcise generation af anisotrope polymere partikler. Den tynde film stretching teknik beskrevet her er skalerbar, stærkt reproducerbare og billig. Alternative teknikker til at generere anisotrope partikler lider af mange begrænsninger, herunder høje omkostninger, lav overførselshastighed og begrænset partikelstørrelse. Den tynde film stretching tilgang er også en fordel fordi partiklerne er ændret til at være anisotrope efter syntese og som følge he...

Kunstige antigen præsentere celler (aAPC) har vist lovende som immunmodulerende stoffer, fordi de kan skabe en robust antigen-specifikke T-celle respons. Essential til disse platforme er deres evne til effektivt præsentere vigtige signaler for T-celle aktivering. Acellulær aAPC er et attraktivt alternativ til celle-baserede aAPC, fordi de er nemmere og billigere at fabrikere, færre udfordringer under skala-up og oversættelse, og mindske risici forbundet med celle-baserede behandlinger. Acellulær aAPC også mulighed for en høj grad af kontrol over signal præsentation parametre og fysiske egenskaber af den overflade, der vil kommunikere med T celler1.
aAPC skal sammenfatte mindst to signaler afgørende for T-celle aktivering. Signal 1 giver antigen anerkendelse og opstår, når T-celle receptoren (TCR) genkender og engagerer med en MHC klasse I eller II forsynet med dens beslægtet antigen, som kulminerede i signalering gennem TCR kompleks. For at omgå antigen specificitet behov, bærer aAPC systemer ofte en agonistisk monoklonale antistoffer mod CD3 receptor, som nonspecifically stimulerer TCR kompleks. Rekombinant former for MHC, især MHC multimerer, har også været brugt på overfladen af aAPC for at give antigen specificitet2,3. Signal 2 er en costimulatory signal, der dirigerer T-celleaktivitet. For at give den nødvendige for T-celle aktivering costimulation, er CD28 receptor generelt stimuleret med en agonistisk antistof præsenteret på aAPC overflade, selv om andre costimulatory receptorer som 4-1BB har været succesfuldt målrettet4. Signal 1 og 2 proteiner er typisk immobiliseret på overfladen af stive partikler til at syntetisere aAPC. Historisk set har aAPC været fremstillet af en række materialer, herunder polystyren4,5 og jern dextran6. Nyere systemer udnytter biologisk nedbrydelige polymerer som poly (mælkesyre-co-glycolic acid) (PLGA) til at generere aAPC, der kan kobles nemt til at signalere proteiner og er egnet til direkte administration i vivoog kan lette den vedvarende frigivelse af indkapslet cytokiner eller opløselige faktorer til at forøge T-celle aktivering7,8.
Udover tilstedeværelse af nødvendige signal proteiner er receptor engagement over et tilstrækkeligt stort areal under aAPC/T celle interaktion afgørende for T-celle aktivering. Således fysiske parametre af aAPC størrelse og form drastisk ændre deres tilgængelige kontaktområde og påvirke deres evne til at stimulere T-celler. Micron mellemstore aAPC har vist sig at være mere effektive på stimulere T-celler end deres nanoskala modparter9,10. Nano-aAPC kan dog have superior biodistribution og bedre dræning til lymfeknuderne, der kan forbedre deres præstationer i vivo over mikro-aAPC11. Figuren er en anden variabel af interesse i partikel-baserede aAPC systemer. Anisotropisk aAPC har for nylig vist sig at være mere effektiv end isotropic partikler på stimulere T-celler, hovedsagelig på grund af forbedrede interaktion med target-cellerne kombineret med reduceret uspecifikke celle optagelse. Celler binder sig fortrinsvis til den lange akse af elliptisk partikler, og større radius af krumningen og fladere overflade giver mulighed for mere kontakt mellem aAPC og T-celle12. Den lange akse af elliptisk partikler også afskrækker fagocytose, hvilket resulterer i øget omsætning tid sammenlignet med sfæriske partikler efter i vivo administration12,13. På grund af disse fordele mægle elliptisk partikler større ekspansion af antigen-specifikke T celler in vitro- og i vivo sammenlignet med sfæriske partikler, en effekt observeret på både mikro- og nanoscales12, 13. Der er forskellige strategier til at fabrikere anisotrope partikler, men tynd-hinde stretching er en enkel, almindeligt anerkendte metode bruges til at generere en række forskellige partikel figurer14. Efter syntese, partikler er støbt ind i film og strakte sig i en eller to dimensioner ved en temperatur over glasset overgang temperatur af partikel materiale. Filmen er så opløst for at hente partikler. Trods en voksende interesse for anisotrope partikler, nuværende strategier for opdigte partikel-baserede aAPC er for det meste begrænset til isotropic systemer og metoder til at ændre partikel form kan være vanskelige at gennemføre, uforenelig med visse aAPC syntese strategier, og mangel på præcision og reproducerbarhed15. Vores tynd-hinde strækker teknik kan udføres manuelt eller i en automatiseret måde til hurtigt at generere anisotrope partikler syntetiseret fra en bred vifte af biologisk nedbrydelige polymerer, strakt til en ønskede størrelsesforhold i et eller to dimensioner15.
Baseret på vores tidligere arbejde, udviklede vi en biologisk nedbrydeligt partikel-baserede tilgang kombineret med skalerbar tynd-hinde strækker teknologi til hurtigt at generere aAPC med afstemmelige størrelse og form på en standardiseret måde for T-celle ekspansion ex vivo eller i vivo. Vores protein konjugation strategi kan bruges til at koble eventuelle de(n) af interesse til carboxyl grupper på partikel overflade på en ønskede tæthed, giver denne aAPC system en høj grad af fleksibilitet. Vi beskriver også metoder til at karakterisere størrelse, morfologi og overflade protein indhold af aAPC og evaluere deres funktionalitet i vitro. Denne protokol kan tilpasses nemt at udvide immunceller ex vivo eller i vivo til en lang række immunterapeutisk applikationer.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Poly(vinyl alcohol), MW 25000, 88% hydrolyzed</td>
			<td>Polysciences, Inc.</td>
			<td>02975-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Thermometer</td>
			<td>Fluke</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Model name: Fluke 52 II</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersion Temperature Probe</td>
			<td>Fluke</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Model name: Fluke 80PK 22</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Hotplate &#38; Stirrer</td>
			<td>Benchmark Scientific</td>
			<td>H3760-HS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multipoint stirrer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>50093538</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Resomer RG 504 H, Poly(D,L-lactide-co-glycolide)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>719900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichloromethane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D65100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homogenizer</td>
			<td>IKA</td>
			<td>&#160;0003725001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>Sonics &#38; Materials, Inc.</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Model number: VC 505</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator sound abating enclosure</td>
			<td>Sonics &#38; Materials, Inc.</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Part number: 630-0427</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator probe</td>
			<td>Sonics &#38; Materials, Inc.</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Part number: 630-0220</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator microtip</td>
			<td>Sonics &#38; Materials, Inc.</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Part number: 630-0423</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High speed centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Model number: J-20XP (discontinued), alternative model: J-26XP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High speed centrifuge rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>369691</td>
			<td>Model number: JA-17</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High speed polycarbonate centrifuge tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>3118-0050</td>
			<td>50 mL, screw cap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rectangular disposable petri dish</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>25384-322</td>
			<td>75 x 50 x 10 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Square disposable petri dish</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>10799-140</td>
			<td>100 mm x 100 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LEAF&#160;Purified anti-mouse CD3&#949; Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>InVivoMab anti-mouse CD28, clone 37.51</td>
			<td>Bio X Cell</td>
			<td>BE0015-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-(3-Dimethylaminopropyl)-N&#8242;-ethylcarbodiimide hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E6383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Hydroxysulfosuccinimide sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>56485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3671</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 anti-mouse CD3 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-mouse CD28 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>102109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning&#160;96 Well Solid Polystyrene Microplate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS3915</td>
			<td>flat bottom, black polystyrene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein LoBind Tubes, 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22431081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Medium (+ L-Glutamine)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11875093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F4135</td>
			<td>Heat Inactivated, sterile-filtered</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ciprofloxacin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>17850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human IL-2 (carrier-free)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>589102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate (100 mM)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11360070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Vitamin Solution (100X)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11120052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD8a+&#160;T Cell Isolation Kit, mouse</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-104-075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>C34554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS Columns</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MidiMACS Separator</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-042-302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS Multistand</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-042-303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Cytometer</td>
			<td>Accuri C6</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synergy 2 Multi-Detection Microplate Reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>autoMACS Running Buffer</td>
			<td>Miltenyi BIotech</td>
			<td>130-091-221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>22363548</td>
			<td>Sterile, 70 &#181;m nylon mesh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACK Lysing Buffer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A1049201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6J (Black 6) Mouse</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>000664</td>
			<td>Male, at least 7 weeks old</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-Bottom Tissue Culture Plates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>353227</td>
			<td>Sterile, 96-well tissue culture treated polystyrene plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 V DC Power Supply</td>
			<td>Probotix</td>
			<td>LPSK-4010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE Coated Wire</td>
			<td>Mouser</td>
			<td>602-5858-100-01</td>
			<td>This is for a 100 ft. spool but an equivalent wire will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stepper Motor Driver</td>
			<td>Probotix</td>
			<td>MondoStep5.6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IDC Connector Kit</td>
			<td>Probotix</td>
			<td>IDCM-10-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcontroller</td>
			<td>Probotix</td>
			<td>PBX-RF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4A Fuses</td>
			<td>Radio Shack</td>
			<td>2701026</td>
			<td>Equivalent fuses will work as well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DB25 Male to Male Cable</td>
			<td>Probotix</td>
			<td>DB25-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USB-A to USB-B Cable</td>
			<td>Staples</td>
			<td>2094915</td>
			<td>Equivalent cable will work as well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-Pin Amphenol Connectors Male and Female</td>
			<td>Mouser</td>
			<td>654-97-3100A-20-7P and 654-97-3106A20-7S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stepper Motor</td>
			<td>Probotix</td>
			<td>HT23-420-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Right Hand Lead Screw</td>
			<td>Roton</td>
			<td>60722</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Left Hand Lead Screw</td>
			<td>Roton</td>
			<td>60723</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screws</td>
			<td>McMaster Carr</td>
			<td>92196A151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neoprene Rubber</td>
			<td>McMaster Carr</td>
			<td>8698K51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Right Handed Flanged Lead Nut</td>
			<td>Roton</td>
			<td>91962</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Left Handed Flanged Lead Nut</td>
			<td>Roton</td>
			<td>91963</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Linux Control Computer</td>
			<td>Probotix</td>
			<td>LCNC-PC</td>
			<td>Any computer with matching specification and Linux operating system will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning bottle-top vacuum filter system</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS431097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution, 0.4 %</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fabrication of anisotropic polymeric artificial antigen presenting cells for cd8+ t cell activation

Kunstige antigen præsentere celler (aAPC) er en lovende platform for immun graduering på grund af deres potent evne til at stimulere T-celler. Acellulær substrater tilbyder vigtige fordele over celle-baserede aAPC, herunder præcis kontrol af signal præsentation parametre og fysiske egenskaber af aAPC overflade til at modulere dens interaktioner med T-celler. aAPC fremstillet af anisotrope partikler, især elliptisk partikler, har vist sig at være mere effektiv end deres sfæriske modstykker til stimulere T-celler på grund af øget bindende og større areal tilgængelig for T-celle kontakter, samt som reduceret uspecifik optagelse og forbedret farmakokinetiske egenskaber. Trods øget interesse for anisotrope partikler, accepteret selv bredt metoder til at generere anisotrope partikler, såsom tynde film stretching kan være en udfordring at implementere og bruge reproducerbar.
Til dette formål, vi beskriver en protokol for den hurtige, standardiseret fabrikation af bionedbrydeligt anisotrope partikel-baseret aAPC med afstemmelige størrelse, form, og signal præsentation for T-celle ekspansion ex vivo eller i vivo, sammen med metoder til at karakteriserer deres størrelse, morfologi og overflade proteinindhold, og vurdere deres funktionalitet. Denne tilgang til at opdigte anisotrope aAPC er skalerbar og reproducerbar, gør det ideelt til at generere aAPC for "hyldevare" immunoterapi.

En skematisk for automatiseret 2D tynd filmen strækker enhed som vist i figur 1. En skematisk og beskrivelse for en 1D tynd film strækker enhed er givet i Ho et al.17 båre er konstrueret af aluminium dele ved hjælp af standard fræsning og spåntagende teknikker. Svarende til 1D båre, den 2D båre består af metallisk greb og styreskinner. Tovejs bly skruer bruges til at oversætte lineær til roterende bevægelse. Bly skruerne er...

Watch this Scientific Journal Video about Fabrication of Anisotropic Polymeric Artificial Antigen Presenting Cells for CD8+ T Cell Activation at JoVE.com

Fabrication of Anisotropic Polymeric Artificial Antigen Presenting Cells for CD8+ T Cell Activation

Vi præsenterer her, en protokol for at hurtigt og reproducerbar generere biologisk inspirerede, biologisk nedbrydelige articifical antigen præsentere celler (aAPC) med afstemmelige størrelse, form og overflade protein præsentation for T-celle ekspansion ex vivo eller in vivo .

Fabrikation af anisotrope polymere kunstige Antigen præsentere celler for CD8 + T-celle aktivering

Artificial antigen presenting cells (aAPC) are a promising platform for immune modulation due to their potent ability to stimulate T cells. Acellular ...

Denne metode kan hjælpe med at besvare vigtige spørgsmål inden for amino-engineering området. Såsom, hvad er den rolle, partikel fysiske egenskaber på biomateriale immuncelleinteraktioner og aktivering. Den største fordel ved denne teknik er, at det muliggør en uafhængig kontrol af størrelsen og formen af biomimetiske partikler.Konsekvenserne af denne teknik strækker sig mod behandling af kræft, da det er en off the shelf partikelterapi, der kan forårsage in vivo celle medieret immunrespons. Selv om denne metode kan give indsigt i kræft amino-terapi, Det kan også anvendes til andre systemer. Såsom, smitsomme sygdomme eller type 1 diabetes.For mikropartikelsyntese påbegyndes ved at veje 100 mg poly (mælkesyre med glykolsyre) eller PLGA i et scintillationsglas og opløse PLGA i fem milliliter dichlormethan ved vortexing. Et homogenisator i et bægerglas med 50 milliliter 1 % polyvinylalkohol eller PVA-opløsning, således at homogenisatoren er så tæt på bunden af bægerglasset som muligt uden at røre ved det. Tænd for homogenisatoren til den rette hastighed, og tilsæt PLGA-opløsningen til bægerglasset i et minuts homogenisering.Ved afslutningen af homogeniseringen hældes polyvinylalkoholen PLGA mikropartikelopløsning i et bægerglas indeholdende 100 milliliter 5%PVA-opløsning på en røreplade i en kemisk hætte, og opløsningen omrøres i mindst fire timer. Når opløsningsmidlet er fordampet, hældes partikelopløsningen i 50 milliliter koniske rør og opsaml partiklerne ved centrifugering. Udskift supernatanten i hvert rør med 20 milliliter de-ioniseret vand og re-suspendere partiklerne ved vortexing.Derefter bringes det endelige volumen i hvert rør op til 50 milliliter med frisk de-ioniseret vand og vask partiklerne to gange mere som netop påvist. For nanopartikelsyntese opløses 200 mg PLGA i fem milliliter dichlormethan, og der skal foretages en sonikatorsonde i et bægerglas med 50 milliliter 1%PVA-opløsning på is uden at røre bunden af bægerglasset. Begynd sonikeringen ved 12 watt og tilsæt straks PLGA-opløsningen til bægerglasset i to minutters sonikering for at generere nanopartikler med en omtrentlig 200 nanometerdiameter.Efter sonikering hældes 1% polyvinylalkohol PLGA nanopartikelopløsning i et bægerglas indeholdende 100 milliliter 5 PVA-opløsning på en røreplade i fire timers opløsningsmiddelfordampning i en kemisk røghætte. Når alt opløsningsmidlet er fordampet, hældes partikelopløsningen i 50 milliliter koniske rør til centrifugering for at fjerne eventuelle mikropartikler og fjerne supernatanterne. Overfør derefter nanopartiklerne til centrifugerør med høj hastighed til tre vaske i deioniseret vand som påvist.Til polymer partikelfabrikation skal partiklerne efter den sidste vask genspoleres i ca. en milliliter frisk deioniseret vand og tilsættes filmstøbningsopløsning til partiklerne til en endelig koncentration på 2,5 mg pr. milliliterpartikler. Partikel suspension i 10 milliliter aliquots i 75 af 50 millimeter rektangulære Petri retter til endimensionel stretching. Eller i 15 milliliter aliquots i 100 af 100 millimeter firkantede petriskåle til todimensionelle stretching.Efter natten tørring i en kemisk hætte, bruge pincet til at fjerne filmene og trimme kanterne med en saks. Til 1D-stretching skal du placere de to korte kanter på en film mellem to stykker neoprengummi til montering på aluminiumsblokkene på en akse i en automatiseret tyndfilmsstrækenhed. Brug derefter en unbrakonøgle til at skrue metalgrebene oven på gummiet for at holde filmen på plads.For 2D stretching, montere alle fire kanter på fire aluminium blokke til at strække filmen på begge akser måle og optage længden af filmen i mellem aluminium blokke på en akse for en D stretching eller begge akser til 2D stretching og beregne den afstand, der kræves for at strække filmen i en eller to retninger baseret på den ønskede fold strækning. Placer derefter filmen lastet stretching enhed i en ovn ved 90 grader Celsius ved siden af et større bæger af en lille mængde vand for at bringe filmen til temperatur over 10 minutter. Når strækningen er færdig, skal du lade filmen køle af til stuetemperatur i 20 minutter.For 1D stretching, skære filmen ud af stretching enhed på kanterne. For 2D stretching, skåret ud og gemme midten kvadrat af film, der er ensartet strakt på begge akser. Filmene anbringes i 50 milliliter koniske rør med højst to film pr. rør, og der tilsættes ca. 25 milliliter deioniseret vand til hvert rør til hvirvel.Når filmene er opløst, vaskes partiklerne tre gange i de-ioniseret vand som påvist. Genspoler partiklerne i ca. en milliliter frisk deioniseret vand pr. rør efter den sidste vask. Derefter fryse partiklerne på minus 80 grader Celsius i en time eller natten over lyophilization.Den næste morgen, re-suspendere lyophilized mikro eller nano-partikler på 20 mg pr. milliliter i friskforberedte MES buffer med vortexing. Der tilsættes 100 mikroliter af partikelopløsningen til et polypropylenmikrocentrifugerør, der indeholder 900 mikroliter MES-buffer, og der tilsættes 100 mikroliter frisklavet EDC NHS-opløsning. Bland partiklerne ved at hvirvle og inkubere partiklerne på en inverter ved stuetemperatur i 30 minutter.Ved inkubationens afslutning opsamler partiklerne ved centrifugering, og mikropartikelpillerne suspenderes igen i en milliliter PBS ved at hvirvle eller genskrænke nanopartiklerne i en milliliter PBS med fem sekunders sonikering ved to til tre watt. Dernæst tilsættes otte mikrogram af et passende signal et protein og 10 mikrogram antimus CD28 antistof til mikropartiklerne, eller 16 mikrogram af signalet et protein og 20 mikrogram antimus CD28 til nanopartiklerne. Bring det endelige volumen i hvert rør til 1,1 milliliter med PBS og inkuber partiklerne natten over på en inverter ved fire grader Celsius.Den næste dag, vaske partiklerne tre gange i de-ioniseret vand som påvist. Disse PLGA nano- og mikropartikler blev syntetiseret ved hjælp af enkeltemulsionsteknikkerne som påvist og afbildet ved hjælp af transmissions- og scanningselektronmikroskopi. Efter homogeniseringen viste mikropartiklerne en gennemsnitlig diameter på omkring tre mikrometer.De sfæriske mikropartikler havde en aspect ration på omkring en, mens 1D strakte prolate ellipsepartikler havde et større højde-bredde-forhold på omkring tre og en halv og 2D strakte oblate ellipseale partikler havde et højde-bredde-forhold på omkring 1,2, groft opretholde et forhold på en. Bøjning effektivitet resultater afslører de tilsvarende mængder af protein på overfladen af sfæriske og ellipseformet mikro-kunstige antigen præsenterer celler, eller AAPC og nano-AAPC, viser, at protein kobling under AAPC syntese forekommer i en koncentration afhængig måde. Prolate ellipsoide AAPC viste sig at fremkalde højere niveauer af T-celleproliferedning ved sub-mættende doser end sfærisk AAPC med den bedste adskillelse opnået ved en 01 milligram dosis.Efter syv dage viste manuel optælling af T-cellerne, at prolate ellipsoidal AAPC mere effektivt stimulerer T-celler sammenlignet med deres sfæriske modstykker på mikro- og nanoskalaen på en dosisafhængig måde. Efter denne procedure, AAPC kan administreres in vivo at måle deres terapeutiske effekt og farmakokinetik. Efter sin udvikling, denne teknik hjalp bane vejen for forskere inden for immun-engineering at udforske effekten af anisotropi på AAPC effektivitet.

Research

JoVE Journal

Environment

Mass Production of Genetically Modified Aedes aegypti for Field Releases in Brazil

Mass Production of Genetically Modified Aedes aegypti for Field Releases in Brazil

Masseproduktion af genetisk modificerede Aedes aegypti til feltudgivelser i Brasilien

New techniques and methods are being sought to try to win the battle against mosquitoes. Recent advances in molecular techniques have led to the ...

Measuring Fluxes of Mineral Nutrients and Toxicants in Plants with Radioactive Tracers

Måling Flusmidler af mineralske Næringsstoffer og giftstoffer i Planter med radioaktive sporstoffer

Unidirectional influx and efflux of nutrients and toxicants, and their resultant net fluxes, are central to the nutrition and toxicology of plants. ...

A Whole Cell Bioreporter Approach to Assess Transport and Bioavailability of Organic Contaminants in Water Unsaturated Systems

A Whole Cell Bioreporter tilgang til Vurdere Transport og biotilgængelighed organiske forureninger i vand Umættede Systems

Bioavailability of contaminants is a prerequisite for their effective biodegradation in soil. The average bulk concentration of a contaminant, however, is ...

Use of Chironomidae (Diptera) Surface-Floating Pupal Exuviae as a Rapid Bioassessment Protocol for Water Bodies

Use of Chironomidae Diptera Surface-Floating Pupal Exuviae as a Rapid Bioassessment Protocol for Water Bodies

Anvendelse af Chironomidae (Diptera) Overflade-Floating puppe Exuviae som Rapid Bioassessment protokol for vandområder

Rapid bioassessment protocols using benthic macroinvertebrate assemblages have been successfully used to assess human impacts on water quality. ...

Extraction of Structural Extracellular Polymeric Substances from Aerobic Granular Sludge

Udvinding af Structural Ekstracellulær Polymere stoffer fra Aerobic Kornet slam

To evaluate and develop methodologies for the extraction of gel-forming extracellular polymeric substances (EPS), EPS from aerobic granular sludge (AGS) ...

Functionalization and Dispersion of Carbon Nanomaterials Using an Environmentally Friendly Ultrasonicated Ozonolysis Process

Funktionalisering og dispersion af carbon nanomaterialer ved anvendelse af en miljøvenlig ultralydet ozonolyseproces

Functionalization of carbon nanomaterials is often a critical step that facilitates their integration into larger material systems and devices. In the ...

Ecosystem Fabrication (EcoFAB) Protocols for The Construction of Laboratory Ecosystems Designed to Study Plant-microbe Interactions

Ecosystem Fabrication EcoFAB Protocols for The Construction of Laboratory Ecosystems Designed to Study Plant-microbe Interactions

Økosystem fabrikation (EcoFAB) protokoller for byggeri Laboratory økosystemers designet til at studere plante-mikrobe interaktioner

Beneficial plant-microbe interactions offer a sustainable biological solution with the potential to boost low-input food and bioenergy production. A ...

A Strain Gauge Monitor (SGM) for Continuous Valve Gape Measurements in Bivalve Molluscs in Response to Laboratory Induced Diel-cycling Hypoxia and pH

A Strain Gauge Monitor SGM for Continuous Valve Gape Measurements in Bivalve Molluscs in Response to Laboratory Induced Diel-cycling Hypoxia and pH

En Strain Gauge skærm (sdb) for kontinuerlig ventil måbe målinger i toskallede bløddyr som svar på laboratoriet induceret Diel-cykling hypoxi og pH

An inexpensive, laboratory-based, strain gauge valve gape monitor (SGM) was developed to monitor the valve gape behavior of bivalve molluscs in response ...

Bioindication Testing of Stream Environment Suitability for Young Freshwater Pearl Mussels Using In Situ Exposure Methods

Bioindication Testing of Stream Environment Suitability for Young Freshwater Pearl Mussels Using In Situ Exposure Methods

Bioindication afprøvning af Stream miljø egnethed for unge ferskvands perle muslinger med In Situ eksponering metoder

Knowledge of habitat suitability for freshwater mussels is an important step in the conservation of this endangered species group. We describe a protocol ...

Cultivation of Green Microalgae in Bubble Column Photobioreactors and an Assay for Neutral Lipids

Dyrkning af grøn mikroalger i boble kolonne Photobioreactors og en analyse for Neutral lipider

There is significant interest in the study of microalgae for engineering applications such as the production of biofuels, high value products, and for the ...