Name: fabrication of anisotropic polymeric artificial antigen presenting cells for cd8+ t cell activation
Uploaded: 2018-10-12T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fabrication of Anisotropic Polymeric Artificial Antigen Presenting Cells for CD8+ T Cell Activation at JoVE.com

Ik dank de NSF Graduate Research Fellowship-programma voor steun EBA (DGE-1746891) en KRR (DGE-1232825). RAM bedankt de nationale onderzoek Service Award NIH NCI F31 (F31CA214147) en de Achievement beloningen voor College wetenschappers Fellowship voor steun. De auteurs bedanken de NIH (R01EB016721 en R01CA195503), het onderzoek te voorkomen blindheid James en Carole gratis katalysator Award, en de JHU Bloomberg-Kimmel Instituut voor kanker immunotherapie voor ondersteuning.

Alle methoden die hier worden beschreven zijn goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik Comité (IACUC) van de Johns Hopkins University.
1. fabricage van sferische PLGA deeltjes van afstembare grootte
<ol><li>Voorbereiding van materialen voor deeltje synthese<ol>
<li>Bereid 5% w/w polyvinylalcohol (PVA) oplossing.<ol>
<li>500 mL gedeïoniseerd water (DI) toevoegen aan een erlenmeyerkolf met een magnetische roer bar en plaats op de hete plaat roerder bij 500 rpm en monitor tem...

<ol>
	<li>Eggermont, L. J., Paulis, L. E., Tel, J., Figdor, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+efficient+cancer+immunotherapy:+Advances+in+developing+artificial+antigen-presenting+cells.">Towards efficient cancer immunotherapy: Advances in developing artificial antigen-presenting cells.</a> Trends in Biotechnology. 32 (9), 456-465 (2014).</li><li>Maus, M. V., Riley, J. L., Kwok, W. W., Nepom, G. T., June, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HLA+tetramer-based+artificial+antigen-presenting+cells+for+stimulation+of+CD4++T+cells.">HLA tetramer-based artificial antigen-presenting cells for stimulation of CD4+ T cells.</a> Clinical Immunology. 106 (1), 16-22 (2003).</li><li>Oelke, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+induction+and+expansion+of+antigen-specific+cytotoxic+T+cells+by+HLA-Ig-coated+artificial+antigen-presenting+cells.">Ex vivo induction and expansion of antigen-specific cytotoxic T cells by HLA-Ig-coated artificial antigen-presenting cells.</a> Nature Medicine. 9 (5), 619-624 (2003).</li><li>Rudolf, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potent+costimulation+of+human+CD8+T+cells+by+anti-4-1BB+and+anti-CD28+on+synthetic+artificial+antigen+presenting+cells.">Potent costimulation of human CD8 T cells by anti-4-1BB and anti-CD28 on synthetic artificial antigen presenting cells.</a> Cancer Immunology, Immunotherapy. 57 (2), 175-183 (2008).</li><li>Tham, E. L., Jensen, P. L., Mescher, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+antigen-specific+T+cells+by+artificial+cell+constructs+having+immobilized+multimeric+peptide-class+I+complexes+and+recombinant+B7-Fc+proteins.">Activation of antigen-specific T cells by artificial cell constructs having immobilized multimeric peptide-class I complexes and recombinant B7-Fc proteins.</a> Journal of Immunological Methods. 249 (1-2), 111-119 (2001).</li><li>Perica, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+field-induced+T+cell+receptor+clustering+by+nanoparticles+enhances+T+cell+activation+and+stimulates+antitumor+activity.">Magnetic field-induced T cell receptor clustering by nanoparticles enhances T cell activation and stimulates antitumor activity.</a> ACS Nano. 8 (3), 2252-2260 (2014).</li><li>Steenblock, E. R., Fadel, T., Labowsky, M., Pober, J. S., Fahmy, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+artificial+antigen-presenting+cell+with+paracrine+delivery+of+IL-2+impacts+the+magnitude+and+direction+of+the+T+cell+response.">An artificial antigen-presenting cell with paracrine delivery of IL-2 impacts the magnitude and direction of the T cell response.</a> The Journal of Biological Chemistry. 286 (40), 34883-34892 (2011).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paracrine+release+of+IL-2+and+anti-CTLA-4+enhances+the+ability+of+artificial+polymer+antigen-presenting+cells+to+expand+antigen-specific+T+cells+and+inhibit+tumor+growth+in+a+mouse+model.">Paracrine release of IL-2 and anti-CTLA-4 enhances the ability of artificial polymer antigen-presenting cells to expand antigen-specific T cells and inhibit tumor growth in a mouse model.</a> Cancer Immunology, Immunotherapy. 66 (9), 1229-1241 (2017).</li><li>Mescher, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+contact+requirements+for+activation+of+cytotoxic+T+lymphocytes.">Surface contact requirements for activation of cytotoxic T lymphocytes.</a> The Journal of Immunology. 149 (7), 2402-2405 (1992).</li><li>Steenblock, E. R., Fahmy, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+platform+for+ex+vivo+T-cell+expansion+based+on+biodegradable+polymeric+artificial+antigen-presenting+cells.">A comprehensive platform for ex vivo T-cell expansion based on biodegradable polymeric artificial antigen-presenting cells.</a> Molecular Therapy. 16 (4), 765-772 (2008).</li><li>Fifis, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size-dependent+immunogenicity:+therapeutic+and+protective+properties+of+nano-vaccines+against+tumors.">Size-dependent immunogenicity: therapeutic and protective properties of nano-vaccines against tumors.</a> The Journal of Immunology. 173 (5), 3148-3154 (2004).</li><li>Sunshine, J. C., Perica, K., Schneck, J. P., Green, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Particle+shape+dependence+of+CD8++T+cell+activation+by+artificial+antigen+presenting+cells.">Particle shape dependence of CD8+ T cell activation by artificial antigen presenting cells.</a> Biomaterials. 35 (1), 269-277 (2014).</li><li>Meyer, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biodegradable+nanoellipsoidal+artificial+antigen+presenting+cells+for+antigen+specific+T-cell+activation.">Biodegradable nanoellipsoidal artificial antigen presenting cells for antigen specific T-cell activation.</a> Small. 11 (13), 1519-1525 (2015).</li><li>Champion, J. A., Katare, Y. K., Mitragotri, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Particle+shape:+a+new+design+parameter+for+micro-+and+nanoscale+drug+delivery+carriers.">Particle shape: a new design parameter for micro- and nanoscale drug delivery carriers.</a> Journal of Controlled Release. 121 (1-2), 3-9 (2007).</li><li>Meyer, R. A., Meyer, R. S., Green, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+automated+multidimensional+thin+film+stretching+device+for+the+generation+of+anisotropic+polymeric+micro-+and+nanoparticles.">An automated multidimensional thin film stretching device for the generation of anisotropic polymeric micro- and nanoparticles.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 103 (8), 2747-2757 (2015).</li><li>Ho, C. C., Keller, A., Odell, J. A., Ottewill, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+monodisperse+ellipsoidal+polystyrene+particles.">Preparation of monodisperse ellipsoidal polystyrene particles.</a> Colloid and Polymer Science. 271 (5), 469-479 (1993).</li><li>Shum, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet+microfluidics+for+fabrication+of+non-spherical+particles.">Droplet microfluidics for fabrication of non-spherical particles.</a> Macromolecular Rapid Communications. 31 (2), 108-118 (2010).</li><li>Lan, W., Li, S., Xu, J., Luo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controllable+preparation+of+nanoparticle-coated+chitosan+microspheres+in+a+co-axial+microfluidic+device.">Controllable preparation of nanoparticle-coated chitosan microspheres in a co-axial microfluidic device.</a> Lab on a Chip. 11 (4), 652-657 (2011).</li><li>Yang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+synthesis+of+multifunctional+Janus+particles+for+biomedical+applications.">Microfluidic synthesis of multifunctional Janus particles for biomedical applications.</a> Lab on a Chip. 12 (12), 2097-2102 (2012).</li><li>Zhou, Z., Anselmo, A. C., Mitragotri, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+protein-based,+rod-shaped+particles+from+spherical+templates+using+layer-by-layer+assembly.">Synthesis of protein-based, rod-shaped particles from spherical templates using layer-by-layer assembly.</a> Advanced Materials. 25 (19), 2723-2727 (2013).</li><li>Jang, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Striped,+ellipsoidal+particles+by+controlled+assembly+of+diblock+copolymers.">Striped, ellipsoidal particles by controlled assembly of diblock copolymers.</a> Journal of the American Chemical Society. 135 (17), 6649-6657 (2013).</li><li>Petzetakis, N., Dove, A. P., O'Reilly, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cylindrical+micelles+from+the+living+crystallization-driven+self-assembly+of+poly(lactide)-containing+block+copolymers.">Cylindrical micelles from the living crystallization-driven self-assembly of poly(lactide)-containing block copolymers.</a> Chemical Science. 2 (5), 955-960 (2011).</li><li>Rolland, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+fabrication+and+harvesting+of+monodisperse,+shape-specific+nanobiomaterials.">Direct fabrication and harvesting of monodisperse, shape-specific nanobiomaterials.</a> Journal of the American Chemical Society. 127 (28), 10096-10100 (2005).</li><li>Meyer, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anisotropic+biodegradable+lipid+coated+particles+for+spatially+dynamic+protein+presentation.">Anisotropic biodegradable lipid coated particles for spatially dynamic protein presentation.</a> Acta Biomaterialia. 72, 228-238 (2018).</li></ol>

Dit protocol gegevens een veelzijdige methode voor de precieze generatie anisotrope polymere deeltjes. De dunne film techniek hier beschreven uitrekken is schaalbaar, zeer reproduceerbaar en goedkoop. Alternatieve technieken voor het genereren van anisotrope deeltjes lijden veel beperkingen, met inbegrip van de hoge kosten, lage doorvoersnelheid en beperkte deeltjesgrootte. De dunne film uitrekken aanpak is ook gunstig omdat de deeltjes zijn aangepast om anisotrope na synthese en, dientengevolge, is compatibel met een br...

Kunstmatige antigeen voorstellende cellen (aAPC) is gebleken belofte als immunomodulerende agenten omdat ze een robuuste antigeen-specifieke T cel-reactie kunnen genereren. Essentieel voor deze platforms zijn hun mogelijkheid om efficiënt cruciale signalen voor T-cel activatie. Acellulair aAPC zijn een aantrekkelijk alternatief voor cel-gebaseerde aAPC, omdat ze gemakkelijker en goedkoper te fabriceren, minder uitdagingen tijdens schaalvergroting en vertaling, en risico's van cel-gebaseerde therapieën te verlichten. Acellulair aAPC is ook voorzien van een hoge mate van controle over signaal presentatie parameters en fysieke eigenschappen van het oppervlak zal interfacecomponenten met T cellen1.
aAPC moet een minimum van twee signalen essentieel voor T-cel activatie recapituleren. Signaal 1 biedt antigeen erkenning en treedt op wanneer de T cel receptor (TCR) herkent en houdt zich bezig met een MHC klasse I of II, rekening houdend met zijn cognaat antigeen, culminerend in de signalering via de TCR complexe. Om te omzeilen het vereiste antigeen specificiteit, dragen aAPC systemen vaak een agonistic monoklonaal antilichaam tegen de CD3 receptor, dat nonspecifically de TCR-complex stimuleert. Recombinante vormen van MHC, met name MHC multimeren, hebben ook gebruikt op het oppervlak van aAPC antigeen specificiteit2,3. Signaal 2 is een costimulatory signaal dat T cel activiteit regisseert. Om de costimulatie die nodig zijn voor de T-cel activatie, wordt de CD28 receptor in het algemeen gestimuleerd met een agonistic antilichaam gepresenteerd op het oppervlak van de aAPC, hoewel andere costimulatory receptoren zoals 4-1BB met succes gerichte4 geweest. Signaal 1 en 2 eiwitten zijn meestal geïmmobiliseerd op het oppervlak van stijve deeltjes te synthetiseren van aAPC. Historisch gezien hebben aAPC is vervaardigd uit een verscheidenheid aan materialen, met inbegrip van polystyreen4,5 en ijzer dextran6. Nieuwere systemen gebruiken biologisch afbreekbare polymeren zoals poly (melkzuur-co-glycolic zuur) (PLGA) voor het genereren van aAPC die gemakkelijk kan worden gekoppeld om aan te geven van eiwitten, geschikt voor directe toediening in vivo, en kan vergemakkelijken de aanhoudende release van ingekapseld cytokines of oplosbare factoren om uit te breiden van T cel activatie7,8.
Naast de aanwezigheid van eiwitten van de nodige signaal is betrokkenheid van de receptor over een voldoende groot oppervlak tijdens de interactie die aAPC/T cel essentieel voor T-cel activatie. Fysieke parameters van de aAPC zoals grootte en vorm drastisch veranderen hun beschikbare contactpunten en dus invloed hebben op hun vermogen te stimuleren van T-cellen. Micron en middelgrote aAPC gebleken om meer effectief op stimulerende T-cellen dan hun nanoschaal tegenhangers9,10. Nano-aAPC kan echter superieur ook en betere afvoer naar de lymfeklieren die hun prestaties in vivo over micro-aAPC11 verbeteren kunnen. Vorm is een andere variabele van belang in aAPC deeltje gebaseerde systemen. Anisotrope aAPC hebben onlangs aangetoond dat effectiever dan isotrope deeltjes op stimulerende T-cellen, voornamelijk als gevolg van verbeterde interactie met de doelcellen in combinatie met verminderde aspecifieke cel opname. Cellen bij voorkeur binden aan de lange as van de ellipsvormige deeltjes, en de grotere straal van kromming en platter oppervlak zorgen voor meer contact tussen de aAPC en de T cel12. De lange as van de ellipsvormige deeltjes ook ontmoedigt fagocytose, wat resulteert in verhoogde omloop tijd in vergelijking met bolvormige deeltjes na in vivo administratie12,13. Vanwege deze voordelen bemiddelen ellipsvormige deeltjes grotere uitbreiding van antigeen-specifieke T cellen in vitro en in vivo in vergelijking met bolvormige deeltjes, een effect waargenomen bij zowel de micro- en nanoscales12, 13. Er zijn verschillende strategieën te fabriceren anisotrope deeltjes, maar dunne-film uitrekken zich is een eenvoudige, algemeen aanvaarde methode gebruikt voor het genereren van een aantal uiteenlopende particle vormen14. Na de synthese, zijn de deeltjes in films geworpen en uitgerekt in één of twee dimensies bij een temperatuur boven de temperatuur van de overgang glas van het deeltje materiaal. De film wordt dan opgelost om op te halen van de deeltjes. Ondanks de groeiende belangstelling voor anisotropische deeltjes, kunnen huidige benaderingen voor vervaardigen deeltje gebaseerde aAPC zijn meestal beperkt tot isotrope systemen en methoden voor het wijzigen van de particle shape moeilijk uit te voeren, onverenigbaar is met de synthese van bepaalde aAPC strategieën, en gebrek aan nauwkeurigheid en reproduceerbaarheid15. Onze uitrekkende techniek van dunne-film kan handmatig worden uitgevoerd of op een geautomatiseerde wijze snel genereren anisotrope deeltjes uit een verscheidenheid van biologisch afbreekbare polymeren gesynthetiseerd, uitgerekt tot een gewenste hoogte-breedteverhouding in één of twee afmetingen15.
Op basis van onze eerdere werk, ontwikkeld we een biologisch afbreekbaar deeltje gebaseerde aanpak in combinatie met schaalbare dunne-film uitrekkende technologie om snel genereren aAPC met regelbare grootte en vorm op een gestandaardiseerde manier voor T cel expansie ex vivo of in vivo. Onze eiwit-vervoeging-strategie kan worden gebruikt voor elke expressie gebrachte eiwitten van belang aan carboxylgroepen op het oppervlak van de deeltjes op een gewenste dichtheid, een hoge mate van flexibiliteit te geven aan dit aAPC-systeem koppelen. Ook beschrijven we methoden voor het karakteriseren van de grootte, morfologie en oppervlakte-proteïne inhoud van aAPC, en hun functionaliteit in vitrote evalueren. Dit protocol kan gemakkelijk aangepast worden aan immuuncellen ex vivo of in vivo voor allerlei immunotherapeutische toepassingen uit te breiden.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Poly(vinyl alcohol), MW 25000, 88% hydrolyzed</td>
			<td>Polysciences, Inc.</td>
			<td>02975-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Thermometer</td>
			<td>Fluke</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Model name: Fluke 52 II</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersion Temperature Probe</td>
			<td>Fluke</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Model name: Fluke 80PK 22</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Hotplate &#38; Stirrer</td>
			<td>Benchmark Scientific</td>
			<td>H3760-HS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multipoint stirrer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>50093538</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Resomer RG 504 H, Poly(D,L-lactide-co-glycolide)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>719900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichloromethane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D65100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homogenizer</td>
			<td>IKA</td>
			<td>&#160;0003725001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>Sonics &#38; Materials, Inc.</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Model number: VC 505</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator sound abating enclosure</td>
			<td>Sonics &#38; Materials, Inc.</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Part number: 630-0427</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator probe</td>
			<td>Sonics &#38; Materials, Inc.</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Part number: 630-0220</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator microtip</td>
			<td>Sonics &#38; Materials, Inc.</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Part number: 630-0423</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High speed centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Model number: J-20XP (discontinued), alternative model: J-26XP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High speed centrifuge rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>369691</td>
			<td>Model number: JA-17</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High speed polycarbonate centrifuge tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>3118-0050</td>
			<td>50 mL, screw cap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rectangular disposable petri dish</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>25384-322</td>
			<td>75 x 50 x 10 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Square disposable petri dish</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>10799-140</td>
			<td>100 mm x 100 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LEAF&#160;Purified anti-mouse CD3&#949; Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>InVivoMab anti-mouse CD28, clone 37.51</td>
			<td>Bio X Cell</td>
			<td>BE0015-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-(3-Dimethylaminopropyl)-N&#8242;-ethylcarbodiimide hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E6383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Hydroxysulfosuccinimide sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>56485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3671</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 anti-mouse CD3 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-mouse CD28 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>102109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning&#160;96 Well Solid Polystyrene Microplate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS3915</td>
			<td>flat bottom, black polystyrene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein LoBind Tubes, 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22431081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Medium (+ L-Glutamine)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11875093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F4135</td>
			<td>Heat Inactivated, sterile-filtered</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ciprofloxacin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>17850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human IL-2 (carrier-free)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>589102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate (100 mM)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11360070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Vitamin Solution (100X)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11120052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD8a+&#160;T Cell Isolation Kit, mouse</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-104-075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>C34554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS Columns</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MidiMACS Separator</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-042-302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS Multistand</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-042-303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Cytometer</td>
			<td>Accuri C6</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synergy 2 Multi-Detection Microplate Reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>autoMACS Running Buffer</td>
			<td>Miltenyi BIotech</td>
			<td>130-091-221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>22363548</td>
			<td>Sterile, 70 &#181;m nylon mesh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACK Lysing Buffer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A1049201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6J (Black 6) Mouse</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>000664</td>
			<td>Male, at least 7 weeks old</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-Bottom Tissue Culture Plates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>353227</td>
			<td>Sterile, 96-well tissue culture treated polystyrene plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 V DC Power Supply</td>
			<td>Probotix</td>
			<td>LPSK-4010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE Coated Wire</td>
			<td>Mouser</td>
			<td>602-5858-100-01</td>
			<td>This is for a 100 ft. spool but an equivalent wire will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stepper Motor Driver</td>
			<td>Probotix</td>
			<td>MondoStep5.6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IDC Connector Kit</td>
			<td>Probotix</td>
			<td>IDCM-10-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcontroller</td>
			<td>Probotix</td>
			<td>PBX-RF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4A Fuses</td>
			<td>Radio Shack</td>
			<td>2701026</td>
			<td>Equivalent fuses will work as well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DB25 Male to Male Cable</td>
			<td>Probotix</td>
			<td>DB25-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USB-A to USB-B Cable</td>
			<td>Staples</td>
			<td>2094915</td>
			<td>Equivalent cable will work as well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-Pin Amphenol Connectors Male and Female</td>
			<td>Mouser</td>
			<td>654-97-3100A-20-7P and 654-97-3106A20-7S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stepper Motor</td>
			<td>Probotix</td>
			<td>HT23-420-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Right Hand Lead Screw</td>
			<td>Roton</td>
			<td>60722</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Left Hand Lead Screw</td>
			<td>Roton</td>
			<td>60723</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screws</td>
			<td>McMaster Carr</td>
			<td>92196A151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neoprene Rubber</td>
			<td>McMaster Carr</td>
			<td>8698K51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Right Handed Flanged Lead Nut</td>
			<td>Roton</td>
			<td>91962</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Left Handed Flanged Lead Nut</td>
			<td>Roton</td>
			<td>91963</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Linux Control Computer</td>
			<td>Probotix</td>
			<td>LCNC-PC</td>
			<td>Any computer with matching specification and Linux operating system will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning bottle-top vacuum filter system</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS431097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution, 0.4 %</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fabrication of anisotropic polymeric artificial antigen presenting cells for cd8+ t cell activation

Kunstmatige antigeen voorstellende cellen (aAPC) zijn een veelbelovende platform voor immuun modulatie vanwege hun krachtige vermogen te stimuleren van T-cellen. Acellulair substraten bieden belangrijke voordelen ten opzichte van cel-gebaseerde aAPC, met inbegrip van nauwkeurige controle van signaal presentatie parameters en fysieke eigenschappen van het oppervlak van de aAPC om te differentiëren van de interacties met T-cellen. aAPC opgebouwd uit anisotrope deeltjes, met name ellipsvormige deeltjes, is gebleken dat effectiever dan hun sferische tegenhangers op stimulerende T cellen als gevolg van verhoogde bindende en grotere oppervlakte beschikbaar voor T cel contact, evenals opnemen verminderd als niet-specifieke opname- en verbeterde farmacokinetische eigenschappen. Ondanks de toegenomen belangstelling voor anisotropische deeltjes, zelfs geaccepteerd methoden voor het genereren van anisotrope deeltjes zoals dunne-film uitrekken kan lastig zijn te implementeren en te gebruiken reproducibly.
Te dien einde, we beschrijven een protocol voor de snelle en gestandaardiseerde fabrikatie van biologisch afbreekbare anisotrope deeltje gebaseerde aAPC met afstembare grootte, vorm, en signaal presentatie voor T cel expansie ex vivo of in vivo, samen met methoden om te karakteriseren van hun grootte, morfologie en oppervlakte-proteïne inhoud, en te beoordelen hun functionaliteit. Deze aanpak voor het fabriceren van anisotrope aAPC is schaalbaar en reproduceerbaar is, waardoor hij ideaal is voor het genereren van aAPC voor 'off-the-shelf' immuuntherapie.

Een schema voor de geautomatiseerde 2D dunne film stretching apparaat wordt gegeven in Figuur 1. Een schema en een beschrijving voor een 1D-dunne film stretching apparaat wordt gegeven in Ho et al.17 de brancard is opgebouwd uit aluminium onderdelen met behulp van standaard frezen en verspanen van technieken. Vergelijkbaar met de 1D-brancard, de 2D brancard bestaat uit metalen handgrepen en geleidingen. Bidirectionele lood schroeven wo...

Watch this Scientific Journal Video about Fabrication of Anisotropic Polymeric Artificial Antigen Presenting Cells for CD8+ T Cell Activation at JoVE.com

Fabrication of Anisotropic Polymeric Artificial Antigen Presenting Cells for CD8+ T Cell Activation

Hier presenteren we een protocol voor het snel en reproducibly genereren van biologisch geïnspireerde, biologisch afbreekbare articifical antigeen presentatie van cellen (aAPC) met afstembare grootte, vorm en oppervlakte-proteïne presentatie voor T cel expansie ex vivo of in vivo .

Fabricage van anisotrope polymere kunstmatige antigeen presentatie van cellen voor CD8 + T cel activatie

Artificial antigen presenting cells (aAPC) are a promising platform for immune modulation due to their potent ability to stimulate T cells. Acellular ...

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in het gebied van amino-engineering. Zoals, wat is de rol van deeltjes fysische eigenschappen op biomaterieel immuuncel interacties en activering. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een onafhankelijke controle van de grootte en de vorm van biomimetische deeltjes mogelijk maakt.De implicaties van deze techniek uit te breiden tot de therapie van kanker als het is een off the shelf deeltjestherapie die kan leiden tot in vivo cel gemedieerde immuunreacties. Hoewel deze methode inzicht kan geven in kanker aminotherapie, kan het ook worden toegepast op andere systemen. Zoals infectieziekten of type 1 diabetes.Voor microdeeltjessynthese, begin met het wegen van 100 milligram poly (melkzuur-co-glycolzuur) of PLGA, in een scintillatie flacon en het oplossen van de PLGA in vijf milliliter dichloormethaan door vortexing. Plaats een homogenisator in een bekerglas met 50 milliliter 1%polyvinylalcohol, of PVA-oplossing, zodat de homogenisator zo dicht mogelijk bij de bodem van het bekerglas ligt zonder het aan te raken. Zet de homogenisator op de juiste snelheid en voeg de PLGA-oplossing toe aan het bekerglas voor een minuut homogenisatie.Giet aan het einde van de homogenisatie de polyvinylalcohol PLGA microdeeltjesoplossing in een beker met 100 milliliter 5%PVA-oplossing op een roerplaat in een chemische kap en roer de oplossing gedurende ten minste vier uur. Wanneer het oplosmiddel is verdampt, giet de deeltjesoplossing in 50 milliliter conische buizen en verzamel de deeltjes door middel van centrifugatie. Vervang de supernatant in elke buis door 20 milliliter gedeïoniseerd water en schort de deeltjes opnieuw op door vortexing.Breng vervolgens het uiteindelijke volume in elke buis tot 50 milliliter met vers gedeïoniseerd water en was de deeltjes nog twee keer zoals net aangetoond. Los voor nanodeeltjessynthese 200 milligram PLGA op in vijf milliliter dichloormethaan en plaats een sonicatorsonde in een beker met 50 milliliter 1%PVA-oplossing op ijs zonder de onderkant van het bekerglas aan te raken. Begin met de sonicatie op 12 watt en voeg onmiddellijk de PLGA-oplossing toe aan het bekerglas voor een sonische soon van twee minuten om nanodeeltjes met een diameter van ongeveer 200 nanometer te genereren.Giet na sonicatie de PLGA nanodeeltjesoplossing van 1%polyvinylalcohol in een beker met 100 milliliter 5 PVA-oplossing op een roerplaat gedurende vier uur oplosmiddelverdamping in een chemische rookkap. Wanneer alle van het oplosmiddel is verdampt, giet de deeltjesoplossing in 50 milliliter conische buizen voor centrifugatie om alle micro-deeltjes te verwijderen en verwijder de supernatants. Breng vervolgens de nanodeeltjes over in hoge snelheid centrifugebuizen voor drie wasbeurten in gedeïoniseerd water, zoals aangetoond.Voor polymere deeltjesfabricage, na de laatste wasbeurt, opnieuw opschorten de deeltjes in ongeveer een milliliter vers gedeïoniseerd water en voeg film gieten oplossing aan de deeltjes aan een uiteindelijke concentratie van 2,5 milligram per milliliter deeltjes. Breng de deeltjessuspensie in 10 milliliter aliquots in 75 bij 50 millimeter rechthoekige petrischaaltjes voor een dimensionale stretching. Of in 15 milliliter aliquots in 100 bij 100 millimeter vierkante petrischaal voor tweedimensionale stretching.Na het drogen 's nachts in een chemische kap, gebruik pincet om de films te verwijderen en trim de randen met een schaar. Voor 1D stretching, plaats de twee korte randen van een film tussen twee stukken van neopreen rubber voor montage op de aluminium blokken van een as van een geautomatiseerde dunne film stretching apparaat. Gebruik vervolgens een Allen-moersleutel om de metalen grepen bovenop het rubber te schroeven om de film op zijn plaats te houden.Voor 2D stretching, monteren alle vier de randen op vier aluminium blokken om de film te rekken op beide assen meten en de lengte van de film tussen de aluminium blokken op een as voor een D stretching of beide assen voor 2D stretching en bereken de afstand die nodig is om de film te rekken in een of twee richtingen op basis van de gewenste vouw stretch. Plaats vervolgens de film geladen stretching apparaat in een oven op 90 graden Celsius naast een grotere beker van een kleine hoeveelheid water om de film op temperatuur te brengen meer dan 10 minuten. Wanneer het uitrekken is voltooid, laat de film afkoelen tot kamertemperatuur gedurende 20 minuten.Voor 1D-stretching snijdt u de folie uit het rekapparaat aan de randen. Voor 2D stretching, uitgesneden en sla het middelste vierkant van de film die gelijkmatig is uitgerekt op beide assen. Plaats de films in 50 milliliter conische buizen met niet meer dan twee films per buis en voeg ongeveer 25 milliliter gedeïoniseerd water aan elke buis voor vortexing.Wanneer de films zijn opgelost, was de deeltjes drie keer in gedeïoniseerd water zoals aangetoond. Het opnieuw opschorten van de deeltjes in ongeveer een milliliter vers gedeïoniseerd water per buis na de laatste wasbeurt. Bevries vervolgens de deeltjes bij min 80 graden Celsius gedurende een uur of 's nachts lyophilisatie.De volgende ochtend, opnieuw opschorten van de lyophilized micro-of nano-deeltjes op 20 milligram per milliliter in vers voorbereide MES buffer met vortexing. Voeg 100 microliter van de deeltjesoplossing toe aan een polypropyleen microcentrifugebuis met 900 microliter MES-buffer en voeg 100 microliter vers bereide EDC NHS-oplossing toe. Meng de deeltjes door vortexing en incubeer de deeltjes op een omvormer bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten.Verzamel aan het einde van de incubatie de deeltjes door centrifugatie en schort de microdeeltjespellets opnieuw op in één milliliter PBS door de nanodeeltjes in één milliliter PBS met vijf seconden sonicatie van twee tot drie watt te laten zweven of opnieuw op te schorten. Voeg vervolgens acht microgram van een geschikt signaal een eiwit en 10 microgram anti muis CD28 antilichaam aan de micro-deeltjes, of 16 microgram van het signaal een eiwit en 20 microgram anti muis CD28 aan de nano-deeltjes. Breng het uiteindelijke volume in elke buis op 1,1 milliliter met PBS en ontcubeer de deeltjes 's nachts op een omvormer bij vier graden Celsius.De volgende dag, was de deeltjes drie keer in gedeïoniseerd water zoals aangetoond. Deze PLGA nano en micro-deeltjes werden gesynthetiseerd met behulp van de enkele emulsie technieken zoals aangetoond en afgebeeld met behulp van transmissie en scanning elektronenmicroscopie. Na homogenisatie vertoonden de microdeeltjes een gemiddelde diameter van ongeveer drie micrometer.De bolvormige microdeeltjes hadden een aspect rantsoen van ongeveer een, terwijl de 1D uitgerekt prolaat ellipsoïdale deeltjes had een grotere aspect ratio van ongeveer drie en een half en de 2D uitgerekt oblate ellipsoïdale deeltjes had een aspect ratio van ongeveer 1,2, ruwweg behoud van een aspect ratio van een. Vervoeging efficiëntie resultaten onthullen de vergelijkbare hoeveelheden eiwit op het oppervlak van bolvormige en ellipsoïdale micro-kunstmatige antigeen presenteren cellen, of AAPC en nano-AAPC, waaruit blijkt dat eiwitkoppeling tijdens AAPC synthese optreedt in een concentratie afhankelijke manier. Prolaat ellipsoïdale AAPC bleken hogere niveaus van T-celproliferatie te veroorzaken bij subverzadigende doses dan sferische AAPC met de beste scheiding bereikt bij een dosis van 01 milligram.Na zeven dagen, handmatig tellen van de T-cellen bleek dat prolaat ellipsoïdale AAPC effectiever stimuleren T-cellen in vergelijking met hun bolvormige tegenhangers op de micro-en nano-schaal in een dosis afhankelijke manier. Na deze procedure kan AAPC in vivo worden beheerd om hun therapeutische werkzaamheid en farmacokinetiek te meten. Na de ontwikkeling heeft deze techniek de weg vrijgemaakt voor onderzoekers op het gebied van immuno-engineering om het effect van anisotropie op de werkzaamheid van het AAPC te onderzoeken.

Research

JoVE Journal

Environment

Mass Production of Genetically Modified Aedes aegypti for Field Releases in Brazil

Mass Production of Genetically Modified Aedes aegypti for Field Releases in Brazil

Massaproductie van genetisch gemodificeerde Aedes aegypti voor veldreleases in Brazilië

New techniques and methods are being sought to try to win the battle against mosquitoes. Recent advances in molecular techniques have led to the ...

Measuring Fluxes of Mineral Nutrients and Toxicants in Plants with Radioactive Tracers

Het meten van stromen van minerale nutriënten en toxische stoffen in planten met radioactieve tracers

Unidirectional influx and efflux of nutrients and toxicants, and their resultant net fluxes, are central to the nutrition and toxicology of plants. ...

A Whole Cell Bioreporter Approach to Assess Transport and Bioavailability of Organic Contaminants in Water Unsaturated Systems

A Whole Cell Bioreporter Aanpak Verkeer en biologische beschikbaarheid van organische stoffen te evalueren in Water Onverzadigde Systems

Bioavailability of contaminants is a prerequisite for their effective biodegradation in soil. The average bulk concentration of a contaminant, however, is ...

Use of Chironomidae (Diptera) Surface-Floating Pupal Exuviae as a Rapid Bioassessment Protocol for Water Bodies

Use of Chironomidae Diptera Surface-Floating Pupal Exuviae as a Rapid Bioassessment Protocol for Water Bodies

Gebruik van Chironomidae (Diptera)-Surface Drijvende Pupal Exuviae als Rapid Protocol Bioassessment voor Water Bodies

Rapid bioassessment protocols using benthic macroinvertebrate assemblages have been successfully used to assess human impacts on water quality. ...

Extraction of Structural Extracellular Polymeric Substances from Aerobic Granular Sludge

Extractie van structurele extracellulaire polymere stoffen van aërobe korrelslib

To evaluate and develop methodologies for the extraction of gel-forming extracellular polymeric substances (EPS), EPS from aerobic granular sludge (AGS) ...

Functionalization and Dispersion of Carbon Nanomaterials Using an Environmentally Friendly Ultrasonicated Ozonolysis Process

Functionalisatie en Dispersie van Koolstof Nanomaterialen Met behulp van een milieuvriendelijk Ultrasonicated Ozonolysis Proces

Functionalization of carbon nanomaterials is often a critical step that facilitates their integration into larger material systems and devices. In the ...

Ecosystem Fabrication (EcoFAB) Protocols for The Construction of Laboratory Ecosystems Designed to Study Plant-microbe Interactions

Ecosystem Fabrication EcoFAB Protocols for The Construction of Laboratory Ecosystems Designed to Study Plant-microbe Interactions

Ecosysteem fabricage (EcoFAB) protocollen voor de bouw van laboratorium ecosystemen ontworpen om te bestuderen van de Plant-microbe interacties

Beneficial plant-microbe interactions offer a sustainable biological solution with the potential to boost low-input food and bioenergy production. A ...

A Strain Gauge Monitor (SGM) for Continuous Valve Gape Measurements in Bivalve Molluscs in Response to Laboratory Induced Diel-cycling Hypoxia and pH

A Strain Gauge Monitor SGM for Continuous Valve Gape Measurements in Bivalve Molluscs in Response to Laboratory Induced Diel-cycling Hypoxia and pH

Een spanningsmeter Monitor (SGM) voor ventiel Gape continumetingen in tweekleppige weekdieren in reactie op laboratorium geïnduceerde Diel-Fiet &amp; Mountainbike hypoxie en pH

An inexpensive, laboratory-based, strain gauge valve gape monitor (SGM) was developed to monitor the valve gape behavior of bivalve molluscs in response ...

Bioindication Testing of Stream Environment Suitability for Young Freshwater Pearl Mussels Using In Situ Exposure Methods

Bioindication Testing of Stream Environment Suitability for Young Freshwater Pearl Mussels Using In Situ Exposure Methods

Bioindication testen van Stream milieu geschiktheid voor jonge zoetwater parel van mosselen met behulp van In Situ blootstelling methoden

Knowledge of habitat suitability for freshwater mussels is an important step in the conservation of this endangered species group. We describe a protocol ...

Cultivation of Green Microalgae in Bubble Column Photobioreactors and an Assay for Neutral Lipids

Teelt van groene microalgen in Bubble kolom Photobioreactors en een kwantitatieve analyse voor neutrale lipiden

There is significant interest in the study of microalgae for engineering applications such as the production of biofuels, high value products, and for the ...