Name: fabrication of anisotropic polymeric artificial antigen presenting cells for cd8+ t cell activation
Uploaded: 2018-10-12T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fabrication of Anisotropic Polymeric Artificial Antigen Presenting Cells for CD8+ T Cell Activation at JoVE.com

EBA (DGE-1746891) et KRR (DGE-1232825) remercie le programme de bourses de recherche diplômés NSF pour prise en charge. RAM Merci le National Research Service Award NIH NCI F31 (F31CA214147) et les récompenses de réalisation pour les bourses scientifiques College pour le soutien. Les auteurs remercient les NIH (R01EB016721 et R01CA195503), les recherches pour prévenir la cécité James et Carole Free Catalyst Award et l’Institut de Bloomberg-Kimmel JHU pour immunothérapie des cancers pour la prise en charge.

Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvés par l’animalier institutionnel et utilisation Comité (IACUC) de l’Université Johns Hopkins.
1. fabrication de particules PLGA sphériques de taille ajustable
<ol><li>Préparation des matériaux pour la synthèse de la particule<ol>
<li>Préparer la solution à 5 % p/p d’alcool polyvinylique (PVA).<ol>
<li>Ajouter 500 mL d’eau désionisée de (DI) dans un erlenmeyer avec une barre magnétique remuer et placer sur la plaque chau...

<ol>
	<li>Eggermont, L. J., Paulis, L. E., Tel, J., Figdor, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+efficient+cancer+immunotherapy:+Advances+in+developing+artificial+antigen-presenting+cells.">Towards efficient cancer immunotherapy: Advances in developing artificial antigen-presenting cells.</a> Trends in Biotechnology. 32 (9), 456-465 (2014).</li><li>Maus, M. V., Riley, J. L., Kwok, W. W., Nepom, G. T., June, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HLA+tetramer-based+artificial+antigen-presenting+cells+for+stimulation+of+CD4++T+cells.">HLA tetramer-based artificial antigen-presenting cells for stimulation of CD4+ T cells.</a> Clinical Immunology. 106 (1), 16-22 (2003).</li><li>Oelke, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+induction+and+expansion+of+antigen-specific+cytotoxic+T+cells+by+HLA-Ig-coated+artificial+antigen-presenting+cells.">Ex vivo induction and expansion of antigen-specific cytotoxic T cells by HLA-Ig-coated artificial antigen-presenting cells.</a> Nature Medicine. 9 (5), 619-624 (2003).</li><li>Rudolf, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potent+costimulation+of+human+CD8+T+cells+by+anti-4-1BB+and+anti-CD28+on+synthetic+artificial+antigen+presenting+cells.">Potent costimulation of human CD8 T cells by anti-4-1BB and anti-CD28 on synthetic artificial antigen presenting cells.</a> Cancer Immunology, Immunotherapy. 57 (2), 175-183 (2008).</li><li>Tham, E. L., Jensen, P. L., Mescher, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+antigen-specific+T+cells+by+artificial+cell+constructs+having+immobilized+multimeric+peptide-class+I+complexes+and+recombinant+B7-Fc+proteins.">Activation of antigen-specific T cells by artificial cell constructs having immobilized multimeric peptide-class I complexes and recombinant B7-Fc proteins.</a> Journal of Immunological Methods. 249 (1-2), 111-119 (2001).</li><li>Perica, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+field-induced+T+cell+receptor+clustering+by+nanoparticles+enhances+T+cell+activation+and+stimulates+antitumor+activity.">Magnetic field-induced T cell receptor clustering by nanoparticles enhances T cell activation and stimulates antitumor activity.</a> ACS Nano. 8 (3), 2252-2260 (2014).</li><li>Steenblock, E. R., Fadel, T., Labowsky, M., Pober, J. S., Fahmy, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+artificial+antigen-presenting+cell+with+paracrine+delivery+of+IL-2+impacts+the+magnitude+and+direction+of+the+T+cell+response.">An artificial antigen-presenting cell with paracrine delivery of IL-2 impacts the magnitude and direction of the T cell response.</a> The Journal of Biological Chemistry. 286 (40), 34883-34892 (2011).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paracrine+release+of+IL-2+and+anti-CTLA-4+enhances+the+ability+of+artificial+polymer+antigen-presenting+cells+to+expand+antigen-specific+T+cells+and+inhibit+tumor+growth+in+a+mouse+model.">Paracrine release of IL-2 and anti-CTLA-4 enhances the ability of artificial polymer antigen-presenting cells to expand antigen-specific T cells and inhibit tumor growth in a mouse model.</a> Cancer Immunology, Immunotherapy. 66 (9), 1229-1241 (2017).</li><li>Mescher, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+contact+requirements+for+activation+of+cytotoxic+T+lymphocytes.">Surface contact requirements for activation of cytotoxic T lymphocytes.</a> The Journal of Immunology. 149 (7), 2402-2405 (1992).</li><li>Steenblock, E. R., Fahmy, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+platform+for+ex+vivo+T-cell+expansion+based+on+biodegradable+polymeric+artificial+antigen-presenting+cells.">A comprehensive platform for ex vivo T-cell expansion based on biodegradable polymeric artificial antigen-presenting cells.</a> Molecular Therapy. 16 (4), 765-772 (2008).</li><li>Fifis, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size-dependent+immunogenicity:+therapeutic+and+protective+properties+of+nano-vaccines+against+tumors.">Size-dependent immunogenicity: therapeutic and protective properties of nano-vaccines against tumors.</a> The Journal of Immunology. 173 (5), 3148-3154 (2004).</li><li>Sunshine, J. C., Perica, K., Schneck, J. P., Green, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Particle+shape+dependence+of+CD8++T+cell+activation+by+artificial+antigen+presenting+cells.">Particle shape dependence of CD8+ T cell activation by artificial antigen presenting cells.</a> Biomaterials. 35 (1), 269-277 (2014).</li><li>Meyer, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biodegradable+nanoellipsoidal+artificial+antigen+presenting+cells+for+antigen+specific+T-cell+activation.">Biodegradable nanoellipsoidal artificial antigen presenting cells for antigen specific T-cell activation.</a> Small. 11 (13), 1519-1525 (2015).</li><li>Champion, J. A., Katare, Y. K., Mitragotri, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Particle+shape:+a+new+design+parameter+for+micro-+and+nanoscale+drug+delivery+carriers.">Particle shape: a new design parameter for micro- and nanoscale drug delivery carriers.</a> Journal of Controlled Release. 121 (1-2), 3-9 (2007).</li><li>Meyer, R. A., Meyer, R. S., Green, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+automated+multidimensional+thin+film+stretching+device+for+the+generation+of+anisotropic+polymeric+micro-+and+nanoparticles.">An automated multidimensional thin film stretching device for the generation of anisotropic polymeric micro- and nanoparticles.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 103 (8), 2747-2757 (2015).</li><li>Ho, C. C., Keller, A., Odell, J. A., Ottewill, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+monodisperse+ellipsoidal+polystyrene+particles.">Preparation of monodisperse ellipsoidal polystyrene particles.</a> Colloid and Polymer Science. 271 (5), 469-479 (1993).</li><li>Shum, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet+microfluidics+for+fabrication+of+non-spherical+particles.">Droplet microfluidics for fabrication of non-spherical particles.</a> Macromolecular Rapid Communications. 31 (2), 108-118 (2010).</li><li>Lan, W., Li, S., Xu, J., Luo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controllable+preparation+of+nanoparticle-coated+chitosan+microspheres+in+a+co-axial+microfluidic+device.">Controllable preparation of nanoparticle-coated chitosan microspheres in a co-axial microfluidic device.</a> Lab on a Chip. 11 (4), 652-657 (2011).</li><li>Yang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+synthesis+of+multifunctional+Janus+particles+for+biomedical+applications.">Microfluidic synthesis of multifunctional Janus particles for biomedical applications.</a> Lab on a Chip. 12 (12), 2097-2102 (2012).</li><li>Zhou, Z., Anselmo, A. C., Mitragotri, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+protein-based,+rod-shaped+particles+from+spherical+templates+using+layer-by-layer+assembly.">Synthesis of protein-based, rod-shaped particles from spherical templates using layer-by-layer assembly.</a> Advanced Materials. 25 (19), 2723-2727 (2013).</li><li>Jang, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Striped,+ellipsoidal+particles+by+controlled+assembly+of+diblock+copolymers.">Striped, ellipsoidal particles by controlled assembly of diblock copolymers.</a> Journal of the American Chemical Society. 135 (17), 6649-6657 (2013).</li><li>Petzetakis, N., Dove, A. P., O'Reilly, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cylindrical+micelles+from+the+living+crystallization-driven+self-assembly+of+poly(lactide)-containing+block+copolymers.">Cylindrical micelles from the living crystallization-driven self-assembly of poly(lactide)-containing block copolymers.</a> Chemical Science. 2 (5), 955-960 (2011).</li><li>Rolland, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+fabrication+and+harvesting+of+monodisperse,+shape-specific+nanobiomaterials.">Direct fabrication and harvesting of monodisperse, shape-specific nanobiomaterials.</a> Journal of the American Chemical Society. 127 (28), 10096-10100 (2005).</li><li>Meyer, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anisotropic+biodegradable+lipid+coated+particles+for+spatially+dynamic+protein+presentation.">Anisotropic biodegradable lipid coated particles for spatially dynamic protein presentation.</a> Acta Biomaterialia. 72, 228-238 (2018).</li></ol>

Ce protocole décrit une méthode polyvalente pour la génération précise des particules de polymères anisotropes. La couche mince qui s’étend de la technique décrite ici est évolutif, hautement reproductible et peu coûteux. Des techniques alternatives pour générer des particules anisotropes souffrent de nombreuses limites, y compris le coût élevé, un débit faible et limitée de granulométrie. La couche mince qui s’étend de la démarche est également avantageuse car les particules sont modifiées afin...

Cellules présentatrices d’antigène artificiel (VAMP) ont montré prometteur comme agents immunomodulateurs, parce qu’ils peuvent générer une réponse des lymphocytes T spécifiques de l’antigène robuste. Essentielles à ces plates-formes sont leur capacité à présenter efficacement les signaux cruciaux pour l’activation des cellules T. Vamp acellulaire sont une alternative intéressante aux cellulaires vamp parce qu’ils sont plus facile et moins coûteux à fabriquer, relever des défis moins pendant l’intensification et de la traduction et atténuer les risques associés à des thérapies à base cellulaire. Vamp acellulaire permettent également un degré élevé de contrôle sur les paramètres de présentation de signal et les propriétés physiques de la surface qui sera en interface avec les cellules de T1.
Vamp doit récapituler un minimum de deux signaux essentiels pour l’activation des cellules T. Signal 1 prévoit la reconnaissance de l’antigène et se produit lorsque le récepteur des cellules T (TCR) reconnaît et s’engage avec un CMH de classe I ou II portant son antigène apparenté, culminant dans la signalisation à travers le complex TCR. Afin de contourner l’exigence de spécificité d’antigène, vamp systèmes portent souvent un agoniste monoclonal dirigé contre le récepteur CD3, qui stimule non spécifique du complexe TCR. Des formes recombinantes du CMH, particulièrement des multimères de MHC, ont également servis à la surface de vamp d’antigène spécificité2,3. Signal 2 est un signal de costimulation qui dirige l’activité des cellules T. Pour fournir la costimulation nécessaire pour l’activation des cellules T, le récepteur CD28 est généralement stimulé avec un anticorps agoniste présenté sur la surface de Vamp, bien que les autres récepteurs de costimulation telles que 4-1BB ont été correctement ciblée4. Protéines de signal 1 et 2 sont généralement immobilisées sur la surface des particules rigides pour synthétiser la vamp. Historiquement, vamp ont été fabriquées à partir d’une variété de matériaux, y compris en polystyrène4,5 et fer dextran6. Les systèmes plus récents utilisent des polymères biodégradables comme poly (acide lactique-co-glycolique) (PLGA) pour générer la VAMP qui peut être facilement couplé pour signaler des protéines, est destinés à l’administration directe en vivoet peut faciliter la libération de Résumé des cytokines ou des facteurs solubles pour augmenter l’activation de lymphocytes T7,8.
En plus de la présence de protéines de signal nécessaire, l’engagement du récepteur sur une surface suffisamment grande au cours de l’interaction de cellule de vamp/T est indispensable pour l’activation des cellules T. Ainsi, les paramètres physiques de la VAMP tels que la taille et la forme radicalement modifient leurs surfaces de contact disponible et influer sur leur capacité à stimuler les lymphocytes T. Vamp taille micron ont démontré d’être plus efficace à la stimulation des cellules T à leur échelle nanométrique homologues9,10. Toutefois, les nano-vamp peut avoir biodistribution supérieure et meilleur drainage vers les ganglions lymphatiques qui peuvent améliorer leur performance en vivo sur micro-vamp11. La forme est une autre variable d’intérêt pour les systèmes axés sur les particules de vamp. Vamp anisotrope ont récemment démontré pour être plus efficace que les particules isotropes à stimulation des cellules T, principalement en raison de l’interaction améliorée avec les cellules cibles couplé avec l’absorption réduite des cellules non spécifiques. Cellules fixent de préférence à l’axe long de particules ellipsoïdales, et le plus grand rayon de courbure et plus plat surface permettent plus de contact entre la vamp et les lymphocytes T12. L’axe long de particules ellipsoïdales décourage également la phagocytose, résultant en temps de circulation accrue par rapport aux particules sphériques suit en vivo administration12,,13. En raison de ces avantages, les particules ellipsoïdales véhiculent une plus grande expansion de spécifiques à l’antigène T cellules in vitro et in vivo par rapport aux particules sphériques, un effet observé à la micro et nanoscales12, 13. Il existe différentes stratégies pour fabriquer des particules anisotropes, mais minces stretching est une méthode simple et largement acceptée, utilisée pour générer un ensemble de particules diverses formes14. Suite à la synthèse, les particules sont jetés dans les films et étirés dans une ou deux dimensions à une température supérieure à la température de transition vitreuse du matériau particulaire. Le film est ensuite dissous pour récupérer les particules. Malgré l’intérêt croissant pour les particules anisotropes, les approches actuelles de fabrication axée sur les particules vamp se limitent principalement aux systèmes isotropes et méthodes de modifier la forme des particules peuvent être difficiles à mettre en œuvre, incompatible avec la synthèse de certains vamp stratégies et manque de précision et reproductibilité15. Notre technique d’étirement minces peut être effectuée manuellement ou de manière automatisée pour générer rapidement des particules anisotropes synthétisées dans une variété de polymères biodégradables, s’étendait à un format d’image désiré dans une ou deux dimensions15.
Issu de nos travaux antérieurs, nous avons développé une approche axée sur les particules biodégradable combinée avec scalable minces étirement technologie pour générer rapidement des vamp avec taille ajustable et la forme de manière standardisée pour les lymphocytes T expansion ex vivo ou en vivo. Notre stratégie de conjugaison de protéines permet de coupler les protéines d’intérêt aux groupes carboxyle sur la surface de la particule à une densité désirée, ce qui donne à ce système de vamp un haut degré de flexibilité. Nous décrivons également des méthodes pour caractériser la taille, la morphologie et la protéine de surface contenue de Vamp et d’évaluer leur fonctionnalité in vitro. Ce protocole peut être facilement adapté pour développer des cellules immunitaires ex vivo ou in vivo pour une variété d’applications immunothérapeutiques.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Poly(vinyl alcohol), MW 25000, 88% hydrolyzed</td>
			<td>Polysciences, Inc.</td>
			<td>02975-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Thermometer</td>
			<td>Fluke</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Model name: Fluke 52 II</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersion Temperature Probe</td>
			<td>Fluke</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Model name: Fluke 80PK 22</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Hotplate &#38; Stirrer</td>
			<td>Benchmark Scientific</td>
			<td>H3760-HS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multipoint stirrer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>50093538</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Resomer RG 504 H, Poly(D,L-lactide-co-glycolide)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>719900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichloromethane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D65100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homogenizer</td>
			<td>IKA</td>
			<td>&#160;0003725001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>Sonics &#38; Materials, Inc.</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Model number: VC 505</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator sound abating enclosure</td>
			<td>Sonics &#38; Materials, Inc.</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Part number: 630-0427</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator probe</td>
			<td>Sonics &#38; Materials, Inc.</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Part number: 630-0220</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator microtip</td>
			<td>Sonics &#38; Materials, Inc.</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Part number: 630-0423</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High speed centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Model number: J-20XP (discontinued), alternative model: J-26XP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High speed centrifuge rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>369691</td>
			<td>Model number: JA-17</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High speed polycarbonate centrifuge tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>3118-0050</td>
			<td>50 mL, screw cap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rectangular disposable petri dish</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>25384-322</td>
			<td>75 x 50 x 10 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Square disposable petri dish</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>10799-140</td>
			<td>100 mm x 100 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LEAF&#160;Purified anti-mouse CD3&#949; Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>InVivoMab anti-mouse CD28, clone 37.51</td>
			<td>Bio X Cell</td>
			<td>BE0015-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-(3-Dimethylaminopropyl)-N&#8242;-ethylcarbodiimide hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E6383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Hydroxysulfosuccinimide sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>56485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3671</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 anti-mouse CD3 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-mouse CD28 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>102109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning&#160;96 Well Solid Polystyrene Microplate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS3915</td>
			<td>flat bottom, black polystyrene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein LoBind Tubes, 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22431081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Medium (+ L-Glutamine)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11875093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F4135</td>
			<td>Heat Inactivated, sterile-filtered</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ciprofloxacin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>17850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human IL-2 (carrier-free)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>589102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate (100 mM)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11360070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Vitamin Solution (100X)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11120052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD8a+&#160;T Cell Isolation Kit, mouse</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-104-075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>C34554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS Columns</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MidiMACS Separator</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-042-302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS Multistand</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-042-303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Cytometer</td>
			<td>Accuri C6</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synergy 2 Multi-Detection Microplate Reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>autoMACS Running Buffer</td>
			<td>Miltenyi BIotech</td>
			<td>130-091-221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>22363548</td>
			<td>Sterile, 70 &#181;m nylon mesh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACK Lysing Buffer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A1049201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6J (Black 6) Mouse</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>000664</td>
			<td>Male, at least 7 weeks old</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-Bottom Tissue Culture Plates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>353227</td>
			<td>Sterile, 96-well tissue culture treated polystyrene plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 V DC Power Supply</td>
			<td>Probotix</td>
			<td>LPSK-4010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE Coated Wire</td>
			<td>Mouser</td>
			<td>602-5858-100-01</td>
			<td>This is for a 100 ft. spool but an equivalent wire will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stepper Motor Driver</td>
			<td>Probotix</td>
			<td>MondoStep5.6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IDC Connector Kit</td>
			<td>Probotix</td>
			<td>IDCM-10-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcontroller</td>
			<td>Probotix</td>
			<td>PBX-RF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4A Fuses</td>
			<td>Radio Shack</td>
			<td>2701026</td>
			<td>Equivalent fuses will work as well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DB25 Male to Male Cable</td>
			<td>Probotix</td>
			<td>DB25-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USB-A to USB-B Cable</td>
			<td>Staples</td>
			<td>2094915</td>
			<td>Equivalent cable will work as well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-Pin Amphenol Connectors Male and Female</td>
			<td>Mouser</td>
			<td>654-97-3100A-20-7P and 654-97-3106A20-7S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stepper Motor</td>
			<td>Probotix</td>
			<td>HT23-420-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Right Hand Lead Screw</td>
			<td>Roton</td>
			<td>60722</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Left Hand Lead Screw</td>
			<td>Roton</td>
			<td>60723</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screws</td>
			<td>McMaster Carr</td>
			<td>92196A151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neoprene Rubber</td>
			<td>McMaster Carr</td>
			<td>8698K51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Right Handed Flanged Lead Nut</td>
			<td>Roton</td>
			<td>91962</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Left Handed Flanged Lead Nut</td>
			<td>Roton</td>
			<td>91963</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Linux Control Computer</td>
			<td>Probotix</td>
			<td>LCNC-PC</td>
			<td>Any computer with matching specification and Linux operating system will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning bottle-top vacuum filter system</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS431097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution, 0.4 %</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fabrication of anisotropic polymeric artificial antigen presenting cells for cd8+ t cell activation

Cellules présentatrices d’antigène artificiel (VAMP) sont une plate-forme prometteuse pour la modulation du système immunitaire en raison de leur capacité puissante pour stimuler les lymphocytes T. Substrats acellulaires offrent des avantages clés sur vamp basés sur les cellules, y compris un contrôle précis des paramètres de présentation de signal et les propriétés physiques de la surface de VAMP pour moduler ses interactions avec les lymphocytes T. Vamp, construit à partir de particules anisotropes, particules particulièrement ellipsoïdales, auraient dû être divulgués plus efficaces que leurs homologues sphériques de stimulation des cellules T en raison de la liaison accrue et de plus grande surface disponible pour les lymphocytes T contact, aussi bien réduit l’absorption non spécifique et des propriétés pharmacocinétiques améliorées. Malgré un intérêt accru dans les particules anisotropes, encore largement acceptée méthodes de génération de particules anisotropes comme minces étirement peut être difficile à implémenter et utiliser de façon reproductible.
À cette fin, nous décrivons un protocole pour la fabrication rapide et standardisé de vamp d’axée sur les particules anisotrope biodégradable avec taille ajustable, forme et signal de présentation pour les lymphocytes T expansion ex vivo ou in vivo, ainsi que les méthodes de caractériser leur taille, la morphologie et la protéine de surface contenue et d’évaluer leur fonctionnalité. Cette approche à la fabrication de vamp anisotrope est évolutive et reproductible, idéale pour générer VAMP pour immunothérapies « sur étagère ».

Une représentation schématique du film mince 2D automatisé, qui s’étend de dispositif est donnée à la Figure 1. Un schéma et une description pour un film mince de 1D qui s’étend du dispositif est donné en Ho et al.17 la civière est construite à partir de pièces d’aluminium à l’aide de techniques d’usinage et de fraisage standard. Semblable à la civière 1D, la civière 2D se compose de poignées métalliques et ...

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Fabrication of Anisotropic Polymeric Artificial Antigen Presenting Cells for CD8+ T Cell Activation

Nous présentons ici un protocole pour générer rapidement et de façon reproductible des inspirée, biodégradable articifical cellules présentatrices (VAMP) avec taille ajustable, forme et présentation de la protéine de surface des lymphocytes T expansion ex vivo ou in vivo .

Fabrication d’anisotrope polymères artificiels cellules présentatrices d’Activation des cellules T CD8 +

Artificial antigen presenting cells (aAPC) are a promising platform for immune modulation due to their potent ability to stimulate T cells. Acellular ...

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l’ingénierie aminé. Par exemple, quel est le rôle des propriétés physiques des particules sur les interactions et l’activation des cellules immunitaires biomatériaux. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet un contrôle indépendant de la taille et de la forme des particules biomimétiques.Les implications de cette technique s’étendent vers la thérapie du cancer car il s’agit d’une thérapie par particule disponible sur le marché qui peut causer des réponses immunitaires à base de cellules in vivo. Bien que cette méthode puisse fournir un aperçu de l’aminothérapie contre le cancer, elle peut également être appliquée à d’autres systèmes. Comme les maladies infectieuses ou le diabète de type 1.Pour la synthèse des microparticules, commencez par peser 100 milligrammes d’acide poly(lactique-co-glycolique) ou PLGA, dans un flacon de scintillation et en dissolvant le PLGA en cinq millilitres de dichloromethane par vortex. Placez un homogénéiseur dans un bécher contenant 50 millilitres d’alcool polyvinyle à 1 %, ou solution PVA, de sorte que l’homogénéiseur soit le plus près possible du fond du bécher sans le toucher. Allumez l’homogénéiseur à la vitesse appropriée et ajoutez la solution PLGA au bécher pour une minute d’homogénéisation.À la fin de l’homogénéisation, verser la solution polyvinyle de microparticules PLGA dans un bécher contenant 100 millilitres de solution PVA à 5% sur une plaque de remue-tout dans une hotte chimique et remuer la solution pendant au moins quatre heures. Lorsque le solvant s’est évaporé, versez la solution de particules dans des tubes coniques de 50 millilitres et recueillez les particules par centrifugation. Remplacer le supernatant dans chaque tube par 20 millilitres d’eau déionisée et suspendre à nouveau les particules par vortex.Ensuite, apportez le volume final dans chaque tube jusqu’à 50 millilitres avec de l’eau fraîche déionisée et lavez les particules deux fois de plus comme nous venons de le démontrer. Pour la synthèse des nanoparticules, dissoudre 200 milligrammes de PLGA en cinq millilitres de dichloromethane et placer une sonde sonicator dans un bécher contenant 50 millilitres de solution PVA de 1% sur la glace sans toucher le fond du bécher. Commencez la sonication à 12 watts et ajoutez immédiatement la solution PLGA au bécher pour une sonication de deux minutes pour générer des nanoparticules d’un diamètre d’environ 200 nanomètres.Après la sonication, versez la solution nanoparticule PLGA de 1 % d’alcool polyvinyle dans un bécher contenant 100 millilitres de solution 5 PVA sur une plaque de remue-remuer pendant quatre heures d’évaporation du solvant dans une hotte chimique. Lorsque tout le solvant est évaporé, versez la solution de particules dans des tubes coniques de 50 millilitres pour centrifugation afin d’éliminer les microparticules et d’enlever les supernatants. Ensuite, transférez les nanoparticules dans des tubes de centrifugeuse à grande vitesse pour trois lavages dans de l’eau déionisée comme démontré.Pour la fabrication de particules polymériques, après le dernier lavage, suspendre à nouveau les particules dans environ un millilitre d’eau désionisée fraîche et ajouter une solution de coulée de film aux particules à une concentration finale de 2,5 milligrammes par millilitre de particules. Transférer la suspension de particules en aliquots de 10 millilitres dans des boîtes de Pétri rectangulaires de 75 par 50 millimètres pour un étirement unidimensionnel. Ou en aliquots de 15 millilitres en boîtes de Pétri carrées de 100 par 100 millimètres pour des étirements bidimensionnels.Après séchage pendant la nuit dans une hotte chimique, utiliser des pinces à épiler pour enlever les films et couper les bords avec des ciseaux. Pour les étirements 1D, placez les deux bords courts d’un film entre deux morceaux de caoutchouc néoprène pour monter sur les blocs d’aluminium d’un axe d’un dispositif automatisé d’étirement à couches minces. Ensuite, utilisez une clé Allen pour visser les poignées métalliques sur le dessus du caoutchouc pour maintenir le film en place.Pour les étirements 2D, monter les quatre bords sur quatre blocs d’aluminium pour étirer le film sur les deux axes mesurer et enregistrer la longueur du film entre les blocs d’aluminium sur un axe pour un étirement D ou les deux axes pour l’étirement 2D et calculer la distance nécessaire pour étirer le film dans une ou deux directions en fonction de l’étirement du pli désiré. Placez ensuite le dispositif d’étirement chargé de film dans un four à 90 degrés Celsius à côté d’un plus grand bécher d’une petite quantité d’eau pour amener le film à la température plus de 10 minutes. Lorsque l’étirement est terminé, laisser refroidir le film à température ambiante pendant 20 minutes.Pour les étirements 1D, découpez le film du dispositif d’étirement sur les bords. Pour les étirements 2D, découpez et sauvez le carré central du film qui est uniformément étiré sur les deux axes. Placez les films dans des tubes coniques de 50 millilitres avec pas plus de deux films par tube et ajoutez environ 25 millilitres d’eau déionisée à chaque tube pour le vortex.Lorsque les films se sont dissous, lavez les particules trois fois dans de l’eau déionisée comme démontré. Re-suspendre les particules dans environ un millilitre d’eau fraîche déionisée par tube après le dernier lavage. Puis congeler les particules à moins 80 degrés Celsius pendant une heure ou la nuit lyophilisation.Le lendemain matin, suspendez à nouveau les micro ou nanoparticules lyophilisées à 20 milligrammes par millilitre dans un tampon MES fraîchement préparé avec vortex. Ajouter 100 microlitres de la solution de particules à un tube de micro centrifugeuse en polypropylène contenant 900 microlitres de tampon MES et ajouter 100 microlitres de solution EDC NHS fraîchement préparée. Mélanger les particules en vortexant et incuber les particules sur un onduleur à température ambiante pendant 30 minutes.À la fin de l’incubation, recueillir les particules par centrifugation et suspendre à nouveau les granulés de microparticules dans un millilitre de PBS en vortexant ou en suspendant à nouveau les nanoparticules en un millilitre de PBS par cinq secondes de sonication à deux à trois watts. Ensuite, ajoutez huit microgrammes d’un signal approprié une protéine et 10 microgrammes d’anticorps ANTI souris CD28 aux microparticules, ou 16 microgrammes du signal une protéine et 20 microgrammes d’anti souris CD28 aux nanoparticules. Porter le volume final de chaque tube à 1,1 millilitre avec PBS et incuber les particules pendant la nuit sur un onduleur à quatre degrés Celsius.Le lendemain, lavez les particules trois fois dans de l’eau désionisée comme démontré. Ces nano et microparticules PLGA ont été synthétisées à l’aide des techniques d’émulsion unique telles que démontrées et photographiées à l’aide de la microscopie électronique de transmission et de balayage. Après homogénéisation, les microparticules ont démontré un diamètre moyen d’environ trois micromètres.Les microparticules sphériques ont eu une ration d’aspect d’environ un, alors que les particules ellipsoidal étirées de 1D ont eu un rapport d’aspect plus grand d’environ trois et demi et les particules ellipsoidal oblat étirées 2D ont eu un rapport d’aspect d’environ 1.2, maintenant approximativement un rapport d’aspect d’un. Les résultats d’efficacité de conjugaison révèlent les quantités semblables de protéine à la surface de l’antigène micro-artificiel sphérique et ellipsoidal présentant des cellules, ou AAPC et nano-AAPC, démontrant que le couplage de protéine pendant la synthèse d’AAPC se produit d’une manière dépendante de concentration. L’AAPC ellipsoidal prolate s’est trouvé pour induire des niveaux plus élevés de prolifération de cellules T aux doses sous-saturantes que l’AAPC sphérique avec la meilleure séparation réalisée à une dose de milligramme de 01.Après sept jours, le comptage manuel des lymphocytes T a révélé que l’AAPC ellipsoidal prolate stimule plus efficacement les lymphocytes T par rapport à leurs homologues sphériques à l’échelle micro et nano d’une manière dépendante de la dose. Après cette procédure, l’AAPC peut être administré in vivo pour évaluer leur efficacité thérapeutique et leur pharmacocinétique. Après son développement, cette technique a permis aux chercheurs du domaine de l’immuno-ingénierie d’explorer l’effet de l’anisotropie sur l’efficacité de l’AAPC.

Research

JoVE Journal

Environment

Mass Production of Genetically Modified Aedes aegypti for Field Releases in Brazil

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Production en masse d’Aedes aegypti génétiquement modifié pour les disséminations sur le terrain au Brésil

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Recherche

Environnement

Measuring Fluxes of Mineral Nutrients and Toxicants in Plants with Radioactive Tracers

Mesurer les flux d&#39;éléments nutritifs et des substances toxiques minéraux dans les usines avec Traceurs radioactifs

Unidirectional influx and efflux of nutrients and toxicants, and their resultant net fluxes, are central to the nutrition and toxicology of plants. ...

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Use of Chironomidae (Diptera) Surface-Floating Pupal Exuviae as a Rapid Bioassessment Protocol for Water Bodies

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L&#39;utilisation de Chironomidae (Diptera) Surface-Flottant nymphose exuvies comme un protocole Rapid Bioassessment des plans d&#39;eau

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A Strain Gauge Monitor (SGM) for Continuous Valve Gape Measurements in Bivalve Molluscs in Response to Laboratory Induced Diel-cycling Hypoxia and pH

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Un moniteur de jauge de contrainte (SGM) pour les mesures continues Gape Valve dans les mollusques bivalves en réponse à l’hypoxie de laboratoire induite par Diel-cyclisme et pH

An inexpensive, laboratory-based, strain gauge valve gape monitor (SGM) was developed to monitor the valve gape behavior of bivalve molluscs in response ...

Bioindication Testing of Stream Environment Suitability for Young Freshwater Pearl Mussels Using In Situ Exposure Methods

Bioindication Testing of Stream Environment Suitability for Young Freshwater Pearl Mussels Using In Situ Exposure Methods

Bioindication de vérification des flux environnement qualités pour jeunes d’eau douce perles de moules à l’aide de méthodes In Situ de l’exposition

Knowledge of habitat suitability for freshwater mussels is an important step in the conservation of this endangered species group. We describe a protocol ...

Cultivation of Green Microalgae in Bubble Column Photobioreactors and an Assay for Neutral Lipids

Culture de microalgues vertes en bulle colonne photobioréacteurs et un dosage des lipides neutres

There is significant interest in the study of microalgae for engineering applications such as the production of biofuels, high value products, and for the ...