Name: fabrication of anisotropic polymeric artificial antigen presenting cells for cd8+ t cell activation
Uploaded: 2018-10-12T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fabrication of Anisotropic Polymeric Artificial Antigen Presenting Cells for CD8+ T Cell Activation at JoVE.com

Die NSF Graduate Research Fellowship-Programm für die Unterstützung danken EBA (DGE-1746891) und KRR (DGE-1232825). RAM Dank der nationalen Forschung Service Award NIH NCI F31 (F31CA214147) und die Belohnungen für deine Leistungen für College-Wissenschaftler-Stipendium für Unterstützung. Die Autoren danken den NIH (R01EB016721 und R01CA195503), die Forschung zu verhindern, dass Blindheit James und Carole kostenlose Catalyst Award, und der JHU Bloomberg-Kimmel Institut für Krebs-Immuntherapie für Unterstützung.

Alle hier beschriebene Methoden wurden von den institutionellen Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) der Johns Hopkins University genehmigt.
1. Herstellung von sphärischen PLGA Partikel einstellbaren Größe
<ol><li>Vorbereitung der Materialien für Partikelsynthese<ol>
<li>5 % w/w Polyvinylalkohol (PVA) Lösung ansetzen.<ol>
<li>Ein Erlenmeyerkolben mit magnetischen Stir Bar 500 mL entionisiertem Wasser (DI) hinzu, und legen Sie auf Heizplatte Rührer bei 500 u/min und Monitor Tempera...

<ol>
	<li>Eggermont, L. J., Paulis, L. E., Tel, J., Figdor, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+efficient+cancer+immunotherapy:+Advances+in+developing+artificial+antigen-presenting+cells.">Towards efficient cancer immunotherapy: Advances in developing artificial antigen-presenting cells.</a> Trends in Biotechnology. 32 (9), 456-465 (2014).</li><li>Maus, M. V., Riley, J. L., Kwok, W. W., Nepom, G. T., June, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HLA+tetramer-based+artificial+antigen-presenting+cells+for+stimulation+of+CD4++T+cells.">HLA tetramer-based artificial antigen-presenting cells for stimulation of CD4+ T cells.</a> Clinical Immunology. 106 (1), 16-22 (2003).</li><li>Oelke, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+induction+and+expansion+of+antigen-specific+cytotoxic+T+cells+by+HLA-Ig-coated+artificial+antigen-presenting+cells.">Ex vivo induction and expansion of antigen-specific cytotoxic T cells by HLA-Ig-coated artificial antigen-presenting cells.</a> Nature Medicine. 9 (5), 619-624 (2003).</li><li>Rudolf, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potent+costimulation+of+human+CD8+T+cells+by+anti-4-1BB+and+anti-CD28+on+synthetic+artificial+antigen+presenting+cells.">Potent costimulation of human CD8 T cells by anti-4-1BB and anti-CD28 on synthetic artificial antigen presenting cells.</a> Cancer Immunology, Immunotherapy. 57 (2), 175-183 (2008).</li><li>Tham, E. 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R., Fadel, T., Labowsky, M., Pober, J. S., Fahmy, T. 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F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+contact+requirements+for+activation+of+cytotoxic+T+lymphocytes.">Surface contact requirements for activation of cytotoxic T lymphocytes.</a> The Journal of Immunology. 149 (7), 2402-2405 (1992).</li><li>Steenblock, E. R., Fahmy, T. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Particle+shape+dependence+of+CD8++T+cell+activation+by+artificial+antigen+presenting+cells.">Particle shape dependence of CD8+ T cell activation by artificial antigen presenting cells.</a> Biomaterials. 35 (1), 269-277 (2014).</li><li>Meyer, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biodegradable+nanoellipsoidal+artificial+antigen+presenting+cells+for+antigen+specific+T-cell+activation.">Biodegradable nanoellipsoidal artificial antigen presenting cells for antigen specific T-cell activation.</a> Small. 11 (13), 1519-1525 (2015).</li><li>Champion, J. A., Katare, Y. K., Mitragotri, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Particle+shape:+a+new+design+parameter+for+micro-+and+nanoscale+drug+delivery+carriers.">Particle shape: a new design parameter for micro- and nanoscale drug delivery carriers.</a> Journal of Controlled Release. 121 (1-2), 3-9 (2007).</li><li>Meyer, R. A., Meyer, R. S., Green, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+automated+multidimensional+thin+film+stretching+device+for+the+generation+of+anisotropic+polymeric+micro-+and+nanoparticles.">An automated multidimensional thin film stretching device for the generation of anisotropic polymeric micro- and nanoparticles.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 103 (8), 2747-2757 (2015).</li><li>Ho, C. C., Keller, A., Odell, J. A., Ottewill, R. 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C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet+microfluidics+for+fabrication+of+non-spherical+particles.">Droplet microfluidics for fabrication of non-spherical particles.</a> Macromolecular Rapid Communications. 31 (2), 108-118 (2010).</li><li>Lan, W., Li, S., Xu, J., Luo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controllable+preparation+of+nanoparticle-coated+chitosan+microspheres+in+a+co-axial+microfluidic+device.">Controllable preparation of nanoparticle-coated chitosan microspheres in a co-axial microfluidic device.</a> Lab on a Chip. 11 (4), 652-657 (2011).</li><li>Yang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+synthesis+of+multifunctional+Janus+particles+for+biomedical+applications.">Microfluidic synthesis of multifunctional Janus particles for biomedical applications.</a> Lab on a Chip. 12 (12), 2097-2102 (2012).</li><li>Zhou, Z., Anselmo, A. C., Mitragotri, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+protein-based,+rod-shaped+particles+from+spherical+templates+using+layer-by-layer+assembly.">Synthesis of protein-based, rod-shaped particles from spherical templates using layer-by-layer assembly.</a> Advanced Materials. 25 (19), 2723-2727 (2013).</li><li>Jang, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Striped,+ellipsoidal+particles+by+controlled+assembly+of+diblock+copolymers.">Striped, ellipsoidal particles by controlled assembly of diblock copolymers.</a> Journal of the American Chemical Society. 135 (17), 6649-6657 (2013).</li><li>Petzetakis, N., Dove, A. P., O'Reilly, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cylindrical+micelles+from+the+living+crystallization-driven+self-assembly+of+poly(lactide)-containing+block+copolymers.">Cylindrical micelles from the living crystallization-driven self-assembly of poly(lactide)-containing block copolymers.</a> Chemical Science. 2 (5), 955-960 (2011).</li><li>Rolland, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+fabrication+and+harvesting+of+monodisperse,+shape-specific+nanobiomaterials.">Direct fabrication and harvesting of monodisperse, shape-specific nanobiomaterials.</a> Journal of the American Chemical Society. 127 (28), 10096-10100 (2005).</li><li>Meyer, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anisotropic+biodegradable+lipid+coated+particles+for+spatially+dynamic+protein+presentation.">Anisotropic biodegradable lipid coated particles for spatially dynamic protein presentation.</a> Acta Biomaterialia. 72, 228-238 (2018).</li></ol>

Dieses Protokoll beschreibt eine vielseitige Methode für die genaue teilchenerzeugung anisotropen Polymeren. Die dünne Folie dehnen hier beschriebene Technik ist skalierbar, reproduzierbare und preiswert. Alternative Techniken zur Erzeugung von anisotropen Partikel leiden viele Einschränkungen, einschließlich hohe Kosten, niedrige Durchsatz und begrenzte Partikelgröße. Die dünne Folie dehnen Ansatz ist auch vorteilhaft, weil die Partikel geändert werden, um nach der Synthese anisotrop sein, und infolgedessen ist ...

Künstliche antigenpräsentierende Zellen (aAPC) haben als immunmodulatorische Mittel Versprechen gezeigt, weil sie eine robuste antigenspezifischen T-Zell-Antwort generieren können. Wesentlich für diese Plattformen sind ihre Fähigkeit, entscheidende Signale für die T-Zellaktivierung effizient zu präsentieren. Azelluläre aAPC sind eine attraktive Alternative zur Zell-basierte aAPC, weil sie sind einfacher und kostengünstiger herzustellen, weniger Herausforderungen während der Scale-Up und Übersetzung und Risiken im Zusammenhang mit zellbasierten Therapien zu lindern. Azelluläre aAPC ermöglichen auch ein hohes Maß an Kontrolle über die Präsentation Signalparameter und physikalische Eigenschaften der Oberfläche, die mit T-Zellen-1-Schnittstelle wird.
aAPC muss ein Minimum von zwei Signalen für T-Zellaktivierung rekapitulieren. Signal 1 sorgt für Antigen-Erkennung und tritt auf, wenn die T-Zell-Rezeptor (TCR) erkennt und setzt sich mit einem MHC-Klasse I oder II trägt seine cognate Antigen ihren Höhepunkt bei der Signalisierung durch die TCR Komplex. Um die Antigen-Spezifität-Anforderung umgehen, tragen aAPC Systeme oft einen agonistischen monoklonale Antikörper gegen CD3-Rezeptor, der nonspecifically den TCR-Komplex stimuliert. Rekombinante Formen der MHC, besonders MHC Multimere wurden auch auf der Oberfläche des aAPC zur Antigen-Spezifität2,3liefern. Signal 2 ist ein costimulatory Signal, das T-Zell-Aktivität leitet. Um die Costimulation für die T-Zell-Aktivierung notwendig zu gewährleisten, wird der CD28-Rezeptor in der Regel mit einem agonistische Antikörper auf der Oberfläche aAPC präsentiert angeregt, obwohl andere costimulatory Rezeptoren wie 4-1BB erfolgreich gezielte4gewesen. Signalproteinen 1 und 2 sind in der Regel auf der Oberfläche der festen Partikel aAPC synthetisieren immobilisiert. In der Vergangenheit wurden aus einer Vielzahl von Materialien, einschließlich Polystyrol4,5 und Eisen Dextran6aAPC hergestellt. Bei neueren Systemen nutzen, biologisch abbaubaren Polymeren wie Poly (Milchsäure-co-glykolische Säure) (PLGA) aAPC zu generieren, die können einfach gekoppelt werden, um Proteine zu signalisieren, eignen sich für direkte Verwaltung in Vivound verzögerter Freisetzung von erleichtern kann gekapselt, Zytokine oder lösliche Faktoren, die T-Zell-Aktivierung7,8ergänzen.
Neben der Präsenz von signalproteinen notwendig unbedingt Rezeptor Engagement über eine ausreichend große Fläche während der aAPC/T Zelle Interaktion T-Zell-Aktivierung. So physikalischen Parameter der aAPC wie Größe und Form drastisch verändern ihre verfügbaren Kontaktfläche und Einfluss auf ihre Fähigkeit, T-Zellen zu stimulieren. Mikron mittelständische aAPC haben nachweislich effektiver auf anregende T-Zellen als ihre nanoskaligen Pendants9,10. Nano-aAPC haben jedoch überlegene Bioverteilung und bessere Entwässerung in die Lymphknoten, die ihre Leistung in Vivo über Mikro-aAPC11verbessern kann. Form ist eine weitere Variable des Interesses an partikelbasierte aAPC Systeme. Anisotrope aAPC vor kurzem nachweislich wirksamer als isotrop Partikel an anregenden T-Zellen, vor allem durch verbesserte Interaktion mit Zielzellen gepaart mit reduzierten unspezifische Zelle Aufnahme. Zellen bevorzugt an der Längsachse der Ellipsoid Partikel binden, und der größere Radius der Krümmung und flacher Oberfläche ermöglichen mehr Kontakt zwischen den aAPC und T-Zell-12. Die Längsachse der Ellipsoid Partikel schreckt auch Phagozytose, wodurch erhöhte Zirkulation Zeit im Vergleich zu sphärischen Partikel folgen in Vivo Verwaltung12,13. Aufgrund dieser Vorteile vermitteln Ellipsoid Teilchen größere Expansion der antigenspezifischen T Zellen in Vitro und in Vivo im Vergleich zu sphärischen Partikel, ein Effekt zu beobachten, bei der Mikro- und Nanoscales12, 13. Es gibt verschiedene Strategien, anisotrope Partikel zu fabrizieren, aber Dünnschicht-stretching ist eine einfache, allgemein anerkannten Methode verwendet, um eine Reihe von unterschiedlichen Teilchen Formen14zu generieren. Nach Synthese Partikel sind warfen in Filme und in einer oder zwei Dimensionen auf einer Temperatur oberhalb der Glasübergangstemperatur der partikelmaterial gestreckt. Der Film wird dann aufgelöst, um die Partikel abzurufen. Trotz wachsendem Interesse an anisotropen Partikel, aktuelle Ansätze zur Herstellung partikelbasierte aAPC beschränken sich meist auf isotrope Systeme und Methoden ändern, Kornform kann schwierig zu implementieren, nicht kompatibel mit bestimmten aAPC-Synthese Strategien und Mangel an Präzision und Reproduzierbarkeit15. Unsere Dünnschicht-Technik kann manuell durchgeführt werden oder in einer automatisierten Weise schnell anisotropen Partikel, die aus einer Vielzahl von biologisch abbaubaren Polymeren synthetisiert erzeugt, gestreckt, um eine gewünschte Seitenverhältnis in ein oder zwei Dimensionen15.
Basierend auf unserer bisherigen Arbeit, entwickelten wir einen biologisch abbaubaren Teilchen basierender Ansatz kombiniert mit skalierbaren Dünnschicht-stretching Technik rasch aAPC mit einstellbaren Größe und Form in einer standardisierten Weise für T-Zell Erweiterung ex Vivo oder erzeugen in Vivo. Unsere Protein Konjugation Strategie lässt sich jede benutzt von Interesse an Carboxylgruppen an der Partikeloberfläche in einer gewünschten Dichte geben diesem aAPC-System ein hohes Maß an Flexibilität zu koppeln. Wir beschreiben auch Methoden zur Größe, Morphologie und Oberfläche Eiweißgehalt von aAPC zu charakterisieren und ihre Funktionalität in Vitrozu bewerten. Dieses Protokoll kann immunen Zellen ex Vivo oder in Vivo für eine Vielzahl von immuntherapeutischen Anwendungen erweitern leicht angepasst werden.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Poly(vinyl alcohol), MW 25000, 88% hydrolyzed</td>
			<td>Polysciences, Inc.</td>
			<td>02975-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Thermometer</td>
			<td>Fluke</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Model name: Fluke 52 II</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersion Temperature Probe</td>
			<td>Fluke</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Model name: Fluke 80PK 22</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Hotplate &#38; Stirrer</td>
			<td>Benchmark Scientific</td>
			<td>H3760-HS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multipoint stirrer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>50093538</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Resomer RG 504 H, Poly(D,L-lactide-co-glycolide)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>719900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichloromethane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D65100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homogenizer</td>
			<td>IKA</td>
			<td>&#160;0003725001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>Sonics &#38; Materials, Inc.</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Model number: VC 505</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator sound abating enclosure</td>
			<td>Sonics &#38; Materials, Inc.</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Part number: 630-0427</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator probe</td>
			<td>Sonics &#38; Materials, Inc.</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Part number: 630-0220</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator microtip</td>
			<td>Sonics &#38; Materials, Inc.</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Part number: 630-0423</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High speed centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Model number: J-20XP (discontinued), alternative model: J-26XP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High speed centrifuge rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>369691</td>
			<td>Model number: JA-17</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High speed polycarbonate centrifuge tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>3118-0050</td>
			<td>50 mL, screw cap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rectangular disposable petri dish</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>25384-322</td>
			<td>75 x 50 x 10 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Square disposable petri dish</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>10799-140</td>
			<td>100 mm x 100 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LEAF&#160;Purified anti-mouse CD3&#949; Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>InVivoMab anti-mouse CD28, clone 37.51</td>
			<td>Bio X Cell</td>
			<td>BE0015-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-(3-Dimethylaminopropyl)-N&#8242;-ethylcarbodiimide hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E6383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Hydroxysulfosuccinimide sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>56485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3671</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 anti-mouse CD3 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-mouse CD28 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>102109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning&#160;96 Well Solid Polystyrene Microplate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS3915</td>
			<td>flat bottom, black polystyrene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein LoBind Tubes, 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22431081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Medium (+ L-Glutamine)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11875093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F4135</td>
			<td>Heat Inactivated, sterile-filtered</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ciprofloxacin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>17850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human IL-2 (carrier-free)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>589102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate (100 mM)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11360070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Vitamin Solution (100X)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11120052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD8a+&#160;T Cell Isolation Kit, mouse</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-104-075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>C34554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS Columns</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MidiMACS Separator</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-042-302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS Multistand</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-042-303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Cytometer</td>
			<td>Accuri C6</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synergy 2 Multi-Detection Microplate Reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>autoMACS Running Buffer</td>
			<td>Miltenyi BIotech</td>
			<td>130-091-221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>22363548</td>
			<td>Sterile, 70 &#181;m nylon mesh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACK Lysing Buffer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A1049201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6J (Black 6) Mouse</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>000664</td>
			<td>Male, at least 7 weeks old</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-Bottom Tissue Culture Plates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>353227</td>
			<td>Sterile, 96-well tissue culture treated polystyrene plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 V DC Power Supply</td>
			<td>Probotix</td>
			<td>LPSK-4010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE Coated Wire</td>
			<td>Mouser</td>
			<td>602-5858-100-01</td>
			<td>This is for a 100 ft. spool but an equivalent wire will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stepper Motor Driver</td>
			<td>Probotix</td>
			<td>MondoStep5.6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IDC Connector Kit</td>
			<td>Probotix</td>
			<td>IDCM-10-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcontroller</td>
			<td>Probotix</td>
			<td>PBX-RF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4A Fuses</td>
			<td>Radio Shack</td>
			<td>2701026</td>
			<td>Equivalent fuses will work as well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DB25 Male to Male Cable</td>
			<td>Probotix</td>
			<td>DB25-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USB-A to USB-B Cable</td>
			<td>Staples</td>
			<td>2094915</td>
			<td>Equivalent cable will work as well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-Pin Amphenol Connectors Male and Female</td>
			<td>Mouser</td>
			<td>654-97-3100A-20-7P and 654-97-3106A20-7S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stepper Motor</td>
			<td>Probotix</td>
			<td>HT23-420-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Right Hand Lead Screw</td>
			<td>Roton</td>
			<td>60722</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Left Hand Lead Screw</td>
			<td>Roton</td>
			<td>60723</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screws</td>
			<td>McMaster Carr</td>
			<td>92196A151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neoprene Rubber</td>
			<td>McMaster Carr</td>
			<td>8698K51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Right Handed Flanged Lead Nut</td>
			<td>Roton</td>
			<td>91962</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Left Handed Flanged Lead Nut</td>
			<td>Roton</td>
			<td>91963</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Linux Control Computer</td>
			<td>Probotix</td>
			<td>LCNC-PC</td>
			<td>Any computer with matching specification and Linux operating system will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning bottle-top vacuum filter system</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS431097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution, 0.4 %</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fabrication of anisotropic polymeric artificial antigen presenting cells for cd8+ t cell activation

Künstliche antigenpräsentierende Zellen (aAPC) sind eine vielversprechende Plattform für Immunmodulation durch ihre starke Fähigkeit, T-Zellen zu stimulieren. Azelluläre Substrate bieten wichtige Vorteile gegenüber zellbasierte aAPC, einschließlich präzise Steuerung der Präsentation Signalparameter und physikalische Eigenschaften der Oberfläche aAPC zu modulieren, die Interaktion mit T-Zellen. aAPC konstruiert aus anisotropen Partikel besonders Ellipsoid Partikel haben gezeigt, dass effektiver als kugelförmige Gegenstücke an anregenden T-Zellen durch erhöhte Bindung und größere Fläche zur T-Zell, sowie kontaktieren als unspezifische Aufnahme und verbesserten pharmakokinetischen Eigenschaften reduziert. Trotz gestiegenen Interesse an anisotropen Partikel akzeptiert auch weithin Methoden zur Generierung der anisotropen Partikel wie Dünnschicht-Dehnung schwierig sein kann, zu implementieren und verwenden Sie reproduzierbar.
Zu diesem Zweck wir beschreiben ein Protokoll für die schnelle, standardisierte Herstellung von biologisch abbaubaren anisotropen partikelbasierte aAPC mit einstellbaren Größe, Form und Präsentation für T-Zell Erweiterung ex Vivo oder in Vivozusammen mit Methoden, um zu signalisieren Ihre Größe, Morphologie und Oberfläche Eiweißgehalt zu charakterisieren und ihre Funktionalität zu bewerten. Dieser Ansatz zur Herstellung von anisotropen aAPC ist skalierbar und reproduzierbar, ideal für die Erzeugung von aAPC für "handelsübliche" Immuntherapien.

Ein Schaltplan für die automatisierte 2D Dünnschicht streckvorrichtung ist in Abbildung 1angegeben. Ein Schaltplan und Beschreibung für eine 1D Dünnschicht streckvorrichtung erhält in Ho Et Al.17 , die der Spannrahmen aus Aluminium-Teile mit standard Fräsen und Bearbeitung Techniken aufgebaut ist. Ähnlich wie bei der 1D trage, bestehend aus die 2D Bahre metallische Griffe und Führungsschienen. Bidirektionale Gewindespindeln wer...

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Fabrication of Anisotropic Polymeric Artificial Antigen Presenting Cells for CD8+ T Cell Activation

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll, um schnell und reproduzierbar generieren biologisch inspirierten, biologisch abbaubaren künstlichen antigenpräsentierende Zellen (aAPC) mit einstellbaren Größe, Form und Oberfläche Protein Präsentation für T-Zell Erweiterung ex Vivo oder in-vivo .

Herstellung von anisotropen Polymeren künstliche antigenpräsentierende Zellen für CD8 + T-Zell-Aktivierung

Artificial antigen presenting cells (aAPC) are a promising platform for immune modulation due to their potent ability to stimulate T cells. Acellular ...

Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im Bereich der Amino-Engineering zu beantworten. Wie ist, was ist die Rolle der partikelphysikalischen Eigenschaften auf Biomaterial Immunzell-Wechselwirkungen und Aktivierung. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass sie eine unabhängige Kontrolle der Größe und Form von biomimetischen Partikeln ermöglicht.Die Implikationen dieser Technik reichen auf die Therapie von Krebs, da es sich um eine off-the-shelf Partikeltherapie, die in vivo Zell vermittelte Immunantworten verursachen kann. Obwohl diese Methode Einblick in Krebs-Aminotherapie bieten kann, Kann es auch auf andere Systeme angewendet werden. Wie Infektionskrankheiten oder Typ-1-Diabetes.Für die Mikropartikelsynthese beginnen sie mit dem Auswägen von 100 Milligramm Poly(Milch-Co-Glykolsäure) oder PLGA, in eine Szintillationsdurchstechflasche und lösen Sie die PLGA in fünf Milliliter Dichlormethan durch Wirbeln auf. Legen Sie einen Homogenisator in ein Becherglas, das 50 Milliliter 1%Polyvinylalkohol oder PVA-Lösung enthält, so dass der Homogenisator so nah wie möglich am Boden des Becherkers ist, ohne ihn zu berühren. Schalten Sie den Homogenisator auf die entsprechende Geschwindigkeit ein und fügen Sie die PLGA-Lösung für eine Minute Homogenisierung in das Becherglas ein.Am Ende der Homogenisierung den Polyvinylalkohol PLGA Mikropartikellösung in ein Becherglas gießen, das 100 Milliliter 5%PVA-Lösung auf einer Rührplatte in einer chemischen Haube enthält, und die Lösung mindestens vier Stunden rühren. Wenn das Lösungsmittel verdampft ist, gießen Sie die Partikellösung in 50 Milliliter konische Rohre und sammeln Sie die Partikel durch Zentrifugation. Ersetzen Sie den Überstand in jedem Rohr durch 20 Milliliter entionisiertes Wasser und setzen Sie die Partikel durch Wirbel wieder auf.Dann bringen Sie das Endvolumen in jede Röhre bis zu 50 Milliliter mit frischem enionisiertem Wasser und waschen Sie die Partikel noch zwei Mal, wie gerade gezeigt. Für die Nanopartikelsynthese 200 Milligramm PLGA in fünf Milliliter Dichlormethan auflösen und eine Beschallungssonde in ein Becherglas legen, das 50 Milliliter 1%PVA-Lösung enthält, ohne den Boden des Becherglases zu berühren. Beginnen Sie die Beschallung mit 12 Watt und fügen Sie sofort die PLGA-Lösung für eine zweiminütige Beschallung in das Becherglas ein, um Nanopartikel mit einem Durchmesser von ca. 200 Nanometern zu erzeugen.Nach der Beschallung die 1%Polyvinylalkohol PLGA Nano-Partikellösung in ein Becherglas gießen, das 100 Milliliter 5 PVA-Lösung auf einer Rührplatte für vier Stunden Lösungsmittelverdampfung in einer chemischen Rauchhaube enthält. Wenn das gesamte Lösungsmittel verdampft ist, gießen Sie die Partikellösung in 50 Milliliter konische Rohre für die Zentrifugation, um Mikropartikel zu entfernen und die Überräube zu entfernen. Übertragen Sie dann die Nanopartikel in Hochgeschwindigkeitszentrifugenrohre für drei Wälwass in entionisiertem Wasser, wie gezeigt.Für die Polymerpartikelherstellung nach der letzten Wäsche die Partikel in etwa einem Milliliter frischem enionisiertem Wasser wieder aufhängen und den Partikeln eine Filmgießlösung zu einer Endkonzentration von 2,5 Milligramm pro Milliliter Hinzufügen geben. Übertragen Sie die Partikelsuspension in 10 Milliliter-Aliquots in 75 mal 50 Millimeter rechteckige Petrischalen für eindimensionale Dehnung. Oder in 15 Milliliter-Aliquots in 100 mal 100 Millimeter quadratische Petrischalen für zweidimensionale Dehnung.Nach dem überNacht trocknen in einer chemischen Haube, verwenden Pinzette, um die Folien zu entfernen und die Kanten mit einer Schere zu trimmen. Für 1D-Stretching legen Sie die beiden kurzen Kanten eines Films zwischen zwei Stücken Neoprenkautschuk zur Montage auf die Aluminiumblöcke einer Achse einer automatisierten Dünnschicht-Dehnvorrichtung. Dann verwenden Sie einen Allen-Schraubenschlüssel, um die Metallgriffe auf den Gummi zu schrauben, um die Folie an Ort und Stelle zu halten.Für 2D-Stretching, montieren Sie alle vier Kanten auf vier Aluminiumblöcke, um die Folie auf beiden Achsen zu dehnen messen und die Länge der Folie zwischen den Aluminiumblöcken zwischen den Aluminiumblöcken auf einer Achse für eine D-Stretching oder beide Achsen für 2D-Stretching zu erfassen und berechnen Sie den Abstand erforderlich, um den Film in ein oder zwei Richtungen basierend auf der gewünschten Faltdehnung zu dehnen. Dann legen Sie die Film geladen Stretching-Gerät in einem Ofen bei 90 Grad Celsius neben einem größeren Becher von einer kleinen Menge Wasser, um den Film auf Temperatur über 10 Minuten zu bringen. Wenn die Dehnung abgeschlossen ist, lassen Sie den Film 20 Minuten auf Raumtemperatur abkühlen.Für 1D-Stretching den Film an den Rändern aus der Dehnvorrichtung herausschneiden. Für 2D-Stretching, ausschneiden und speichern Sie das mittlere Quadrat der Folie, die gleichmäßig auf beiden Achsen gestreckt ist. Legen Sie die Filme in 50 Milliliter konische Röhren mit nicht mehr als zwei Folien pro Tube und fügen Sie etwa 25 Milliliter entionisiertes Wasser zu jedem Rohr für Wirbel.Wenn sich die Filme gelöst haben, waschen Sie die Partikel dreimal in enionisiertem Wasser, wie gezeigt. Nach der letzten Wäsche werden die Partikel in etwa einem Milliliter frischem enionisiertem Wasser pro Rohr wieder aufgehängt. Dann frieren die Partikel bei minus 80 Grad Celsius für eine Stunde oder über Nacht Lyophilisierung.Am nächsten Morgen setzen Sie die lyophilisierten Mikro- oder Nanopartikel mit 20 Milligramm pro Milliliter in einem frisch zubereiteten MES-Puffer mit Wirbel wieder auf. Fügen Sie 100 Mikroliter der Partikellösung in ein Polypropylen-Mikrozentrifugenrohr mit 900 Mikroliter MES-Puffer hinzu und fügen Sie 100 Mikroliter frisch zubereitete EDC NHS-Lösung hinzu. Mischen Sie die Partikel durch Wirbeln und inkubieren Sie die Partikel auf einem Wechselrichter bei Raumtemperatur für 30 Minuten.Am Ende der Inkubation die Partikel durch Zentrifugation sammeln und die Mikropartikelpellets in einem Milliliter PBS wieder aufhängen, indem sie die Nanopartikel in einem Milliliter PBS um fünf Sekunden Beschallung bei zwei bis drei Watt wirbeln oder wieder aufhängen. Als nächstes fügen Sie den Mikropartikeln acht Mikrogramm eines geeigneten Signals ein Protein und 10 Mikrogramm Anti-Maus-CD28-Antikörper zu den Mikropartikeln hinzu, oder 16 Mikrogramm des Signals ein Protein und 20 Mikrogramm Anti-Maus-CD28 zu den Nanopartikeln. Bringen Sie das Endvolumen in jeder Röhre mit PBS auf 1,1 Milliliter und inkubieren Sie die Partikel über Nacht auf einem Wechselrichter bei vier Grad Celsius.Am nächsten Tag die Partikel dreimal in entionisiertem Wasser waschen, wie gezeigt. Diese PLGA-Nano- und Mikropartikel wurden mit den einzelnen Emulsionstechniken synthetisiert, wie sie mit Dertransmissions- und Rasterelektronenmikroskopie demonstriert und abgebildet wurden. Nach der Homogenisierung zeigten die Mikropartikel einen durchschnittlichen Durchmesser von etwa drei Mikrometern.Die kugelförmigen Mikropartikel hatten eine Seitenration von etwa einem, während die 1D-gestreckten ellipsoidalen Teilchen ein größeres Seitenverhältnis von etwa dreieinhalb hatten und die 2D-gestreckten oblaten ellipsoidalen Teilchen ein Seitenverhältnis von etwa 1,2 hatten, was ungefähr ein Seitenverhältnis von einem beihielt. Die Ergebnisse der Konjugationseffizienz zeigen die ähnlichen Proteinmengen auf der Oberfläche sphärischer und ellipsoidaler mikrokünstlicher Antigen-Präsentierender Zellen oder AAPC und Nano-AAPC, was zeigt, dass die Proteinkopplung während der AAPC-Synthese in einer konzentrationsabhängigen Weise erfolgt. Prolate ellipsoidale AAPC wurden gefunden, um höhere Konzentrationen der T-Zell-Proliferation in sub-sättigenden Dosen als sphärische AAPC mit der besten Trennung bei einer 01 Milligramm-Dosis erreicht induzieren.Nach sieben Tagen ergab die manuelle Zählung der T-Zellen, dass ellipsoidales AAPC-Zellen im Vergleich zu ihren sphärischen Gegenstücken im Mikro- und Nanomaßstab dosisabhängiger besser stimulieren. Nach diesem Verfahren kann AAPC in vivo verwaltet werden, um ihre therapeutische Wirksamkeit und Pharmakokinetik zu messen. Nach ihrer Entwicklung half diese Technik, den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Immun-Engineering zu ebnen, um die Wirkung der Anisotropie auf die AAPC-Wirksamkeit zu erforschen.

Research

JoVE Journal

Environment

Mass Production of Genetically Modified Aedes aegypti for Field Releases in Brazil

Mass Production of Genetically Modified Aedes aegypti for Field Releases in Brazil

Massenproduktion von gentechnisch veränderten Aedes aegypti für Feldfreisetzungen in Brasilien

New techniques and methods are being sought to try to win the battle against mosquitoes. Recent advances in molecular techniques have led to the ...

Forschung

Umwelt

Measuring Fluxes of Mineral Nutrients and Toxicants in Plants with Radioactive Tracers

Mess Flüsse von Mineralstoffen und Giftstoffe in Pflanzen, die mit radioaktiver Tracer

Unidirectional influx and efflux of nutrients and toxicants, and their resultant net fluxes, are central to the nutrition and toxicology of plants. ...

A Whole Cell Bioreporter Approach to Assess Transport and Bioavailability of Organic Contaminants in Water Unsaturated Systems

Eine ganze Zelle Bioreporter Ansatz für Transport und Bioverfügbarkeit von organischen Schadstoffen in Wasser Ungesättigte Systeme Bewerten

Bioavailability of contaminants is a prerequisite for their effective biodegradation in soil. The average bulk concentration of a contaminant, however, is ...

Use of Chironomidae (Diptera) Surface-Floating Pupal Exuviae as a Rapid Bioassessment Protocol for Water Bodies

Use of Chironomidae Diptera Surface-Floating Pupal Exuviae as a Rapid Bioassessment Protocol for Water Bodies

Die Nutzung Chironomidae (Diptera) Oberflächenschwimm Pupal Exuviae als schnelle Bioassessment Protokoll für die Wasserkörper

Rapid bioassessment protocols using benthic macroinvertebrate assemblages have been successfully used to assess human impacts on water quality. ...

Extraction of Structural Extracellular Polymeric Substances from Aerobic Granular Sludge

Die Extraktion von Strukturextrazellulären polymeren Substanzen aus Aerobic Granular Sludge

To evaluate and develop methodologies for the extraction of gel-forming extracellular polymeric substances (EPS), EPS from aerobic granular sludge (AGS) ...

Functionalization and Dispersion of Carbon Nanomaterials Using an Environmentally Friendly Ultrasonicated Ozonolysis Process

Funktionalisierung und Dispersion von Kohlenstoff-Nanomaterialien mit einem umweltfreundlichen Ultraschall-Ozonolyse-Prozess

Functionalization of carbon nanomaterials is often a critical step that facilitates their integration into larger material systems and devices. In the ...

Ecosystem Fabrication (EcoFAB) Protocols for The Construction of Laboratory Ecosystems Designed to Study Plant-microbe Interactions

Ecosystem Fabrication EcoFAB Protocols for The Construction of Laboratory Ecosystems Designed to Study Plant-microbe Interactions

Ökosystem-Herstellung (EcoFAB)-Protokolle für den Bau von Labor Ökosysteme entwickelt, um die Pflanze-Mikroben Interaktionen zu untersuchen

Beneficial plant-microbe interactions offer a sustainable biological solution with the potential to boost low-input food and bioenergy production. A ...

A Strain Gauge Monitor (SGM) for Continuous Valve Gape Measurements in Bivalve Molluscs in Response to Laboratory Induced Diel-cycling Hypoxia and pH

A Strain Gauge Monitor SGM for Continuous Valve Gape Measurements in Bivalve Molluscs in Response to Laboratory Induced Diel-cycling Hypoxia and pH

Ein DMS-Monitor (SGM) für Ventil klaffen Dauermessungen in Muscheln Muscheln als Reaktion auf Hypoxie Labor induzierte Diel-Radfahren und pH-Wert

An inexpensive, laboratory-based, strain gauge valve gape monitor (SGM) was developed to monitor the valve gape behavior of bivalve molluscs in response ...

Bioindication Testing of Stream Environment Suitability for Young Freshwater Pearl Mussels Using In Situ Exposure Methods

Bioindication Testing of Stream Environment Suitability for Young Freshwater Pearl Mussels Using In Situ Exposure Methods

Bioindikation Prüfung von Stream Umwelt Eignung für junge Süßwasser Perle Miesmuscheln mit In Situ Belichtungsmethoden

Knowledge of habitat suitability for freshwater mussels is an important step in the conservation of this endangered species group. We describe a protocol ...

Cultivation of Green Microalgae in Bubble Column Photobioreactors and an Assay for Neutral Lipids

Anbau von grünen Mikroalgen in Bubble Spalte Photobioreaktoren und ein Test für neutrale Lipide

There is significant interest in the study of microalgae for engineering applications such as the production of biofuels, high value products, and for the ...