Name: fabrication of anisotropic polymeric artificial antigen presenting cells for cd8+ t cell activation
Uploaded: 2018-10-12T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fabrication of Anisotropic Polymeric Artificial Antigen Presenting Cells for CD8+ T Cell Activation at JoVE.com

EBA (DGE-1746891) e KRR (DGE-1232825) grazie al programma NSF Graduate Research Fellowship per supporto. Grazie RAM nazionali di ricerca servizio premio NIH NCI F31 (F31CA214147) e le ricompense di successo per College scienziati Fellowship per supporto. Gli autori ringraziano il NIH (R01EB016721 e R01CA195503), la ricerca per prevenire la cecità James e Carole gratis Catalyst Award e l'Istituto di Bloomberg-Kimmel JHU per immunoterapia del cancro per il supporto.

Tutti i metodi descritti qui sono stati approvati dal istituzionale Animal Care e uso Committee (IACUC) della Johns Hopkins University.
1. fabbricazione di particelle PLGA sferica di dimensioni sintonizzabile
<ol><li>Preparazione di materiali per la sintesi delle particelle<ol>
<li>Preparare la soluzione al 5% p/p di alcol polivinilico (PVA).<ol>
<li>Aggiungere 500 mL di acqua deionizzata (DI) in un matraccio di Erlenmeyer con un'ancoretta magnetica e collocare su piastra riscaldante agitato...

<ol>
	<li>Eggermont, L. J., Paulis, L. E., Tel, J., Figdor, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+efficient+cancer+immunotherapy:+Advances+in+developing+artificial+antigen-presenting+cells.">Towards efficient cancer immunotherapy: Advances in developing artificial antigen-presenting cells.</a> Trends in Biotechnology. 32 (9), 456-465 (2014).</li><li>Maus, M. V., Riley, J. L., Kwok, W. W., Nepom, G. T., June, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HLA+tetramer-based+artificial+antigen-presenting+cells+for+stimulation+of+CD4++T+cells.">HLA tetramer-based artificial antigen-presenting cells for stimulation of CD4+ T cells.</a> Clinical Immunology. 106 (1), 16-22 (2003).</li><li>Oelke, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+induction+and+expansion+of+antigen-specific+cytotoxic+T+cells+by+HLA-Ig-coated+artificial+antigen-presenting+cells.">Ex vivo induction and expansion of antigen-specific cytotoxic T cells by HLA-Ig-coated artificial antigen-presenting cells.</a> Nature Medicine. 9 (5), 619-624 (2003).</li><li>Rudolf, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potent+costimulation+of+human+CD8+T+cells+by+anti-4-1BB+and+anti-CD28+on+synthetic+artificial+antigen+presenting+cells.">Potent costimulation of human CD8 T cells by anti-4-1BB and anti-CD28 on synthetic artificial antigen presenting cells.</a> Cancer Immunology, Immunotherapy. 57 (2), 175-183 (2008).</li><li>Tham, E. L., Jensen, P. L., Mescher, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+antigen-specific+T+cells+by+artificial+cell+constructs+having+immobilized+multimeric+peptide-class+I+complexes+and+recombinant+B7-Fc+proteins.">Activation of antigen-specific T cells by artificial cell constructs having immobilized multimeric peptide-class I complexes and recombinant B7-Fc proteins.</a> Journal of Immunological Methods. 249 (1-2), 111-119 (2001).</li><li>Perica, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+field-induced+T+cell+receptor+clustering+by+nanoparticles+enhances+T+cell+activation+and+stimulates+antitumor+activity.">Magnetic field-induced T cell receptor clustering by nanoparticles enhances T cell activation and stimulates antitumor activity.</a> ACS Nano. 8 (3), 2252-2260 (2014).</li><li>Steenblock, E. R., Fadel, T., Labowsky, M., Pober, J. S., Fahmy, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+artificial+antigen-presenting+cell+with+paracrine+delivery+of+IL-2+impacts+the+magnitude+and+direction+of+the+T+cell+response.">An artificial antigen-presenting cell with paracrine delivery of IL-2 impacts the magnitude and direction of the T cell response.</a> The Journal of Biological Chemistry. 286 (40), 34883-34892 (2011).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paracrine+release+of+IL-2+and+anti-CTLA-4+enhances+the+ability+of+artificial+polymer+antigen-presenting+cells+to+expand+antigen-specific+T+cells+and+inhibit+tumor+growth+in+a+mouse+model.">Paracrine release of IL-2 and anti-CTLA-4 enhances the ability of artificial polymer antigen-presenting cells to expand antigen-specific T cells and inhibit tumor growth in a mouse model.</a> Cancer Immunology, Immunotherapy. 66 (9), 1229-1241 (2017).</li><li>Mescher, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+contact+requirements+for+activation+of+cytotoxic+T+lymphocytes.">Surface contact requirements for activation of cytotoxic T lymphocytes.</a> The Journal of Immunology. 149 (7), 2402-2405 (1992).</li><li>Steenblock, E. R., Fahmy, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+platform+for+ex+vivo+T-cell+expansion+based+on+biodegradable+polymeric+artificial+antigen-presenting+cells.">A comprehensive platform for ex vivo T-cell expansion based on biodegradable polymeric artificial antigen-presenting cells.</a> Molecular Therapy. 16 (4), 765-772 (2008).</li><li>Fifis, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size-dependent+immunogenicity:+therapeutic+and+protective+properties+of+nano-vaccines+against+tumors.">Size-dependent immunogenicity: therapeutic and protective properties of nano-vaccines against tumors.</a> The Journal of Immunology. 173 (5), 3148-3154 (2004).</li><li>Sunshine, J. C., Perica, K., Schneck, J. P., Green, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Particle+shape+dependence+of+CD8++T+cell+activation+by+artificial+antigen+presenting+cells.">Particle shape dependence of CD8+ T cell activation by artificial antigen presenting cells.</a> Biomaterials. 35 (1), 269-277 (2014).</li><li>Meyer, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biodegradable+nanoellipsoidal+artificial+antigen+presenting+cells+for+antigen+specific+T-cell+activation.">Biodegradable nanoellipsoidal artificial antigen presenting cells for antigen specific T-cell activation.</a> Small. 11 (13), 1519-1525 (2015).</li><li>Champion, J. A., Katare, Y. K., Mitragotri, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Particle+shape:+a+new+design+parameter+for+micro-+and+nanoscale+drug+delivery+carriers.">Particle shape: a new design parameter for micro- and nanoscale drug delivery carriers.</a> Journal of Controlled Release. 121 (1-2), 3-9 (2007).</li><li>Meyer, R. A., Meyer, R. S., Green, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+automated+multidimensional+thin+film+stretching+device+for+the+generation+of+anisotropic+polymeric+micro-+and+nanoparticles.">An automated multidimensional thin film stretching device for the generation of anisotropic polymeric micro- and nanoparticles.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 103 (8), 2747-2757 (2015).</li><li>Ho, C. C., Keller, A., Odell, J. A., Ottewill, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+monodisperse+ellipsoidal+polystyrene+particles.">Preparation of monodisperse ellipsoidal polystyrene particles.</a> Colloid and Polymer Science. 271 (5), 469-479 (1993).</li><li>Shum, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet+microfluidics+for+fabrication+of+non-spherical+particles.">Droplet microfluidics for fabrication of non-spherical particles.</a> Macromolecular Rapid Communications. 31 (2), 108-118 (2010).</li><li>Lan, W., Li, S., Xu, J., Luo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controllable+preparation+of+nanoparticle-coated+chitosan+microspheres+in+a+co-axial+microfluidic+device.">Controllable preparation of nanoparticle-coated chitosan microspheres in a co-axial microfluidic device.</a> Lab on a Chip. 11 (4), 652-657 (2011).</li><li>Yang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+synthesis+of+multifunctional+Janus+particles+for+biomedical+applications.">Microfluidic synthesis of multifunctional Janus particles for biomedical applications.</a> Lab on a Chip. 12 (12), 2097-2102 (2012).</li><li>Zhou, Z., Anselmo, A. C., Mitragotri, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+protein-based,+rod-shaped+particles+from+spherical+templates+using+layer-by-layer+assembly.">Synthesis of protein-based, rod-shaped particles from spherical templates using layer-by-layer assembly.</a> Advanced Materials. 25 (19), 2723-2727 (2013).</li><li>Jang, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Striped,+ellipsoidal+particles+by+controlled+assembly+of+diblock+copolymers.">Striped, ellipsoidal particles by controlled assembly of diblock copolymers.</a> Journal of the American Chemical Society. 135 (17), 6649-6657 (2013).</li><li>Petzetakis, N., Dove, A. P., O'Reilly, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cylindrical+micelles+from+the+living+crystallization-driven+self-assembly+of+poly(lactide)-containing+block+copolymers.">Cylindrical micelles from the living crystallization-driven self-assembly of poly(lactide)-containing block copolymers.</a> Chemical Science. 2 (5), 955-960 (2011).</li><li>Rolland, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+fabrication+and+harvesting+of+monodisperse,+shape-specific+nanobiomaterials.">Direct fabrication and harvesting of monodisperse, shape-specific nanobiomaterials.</a> Journal of the American Chemical Society. 127 (28), 10096-10100 (2005).</li><li>Meyer, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anisotropic+biodegradable+lipid+coated+particles+for+spatially+dynamic+protein+presentation.">Anisotropic biodegradable lipid coated particles for spatially dynamic protein presentation.</a> Acta Biomaterialia. 72, 228-238 (2018).</li></ol>

Questo protocollo in dettaglio un metodo versatile per la precisa generazione di particelle polimeriche anisotropiche. Il film sottile che allunga la tecnica qui descritta è scalabile, altamente riproducibile e poco costoso. Tecniche alternative per la generazione di particelle anisotropiche soffrono di molte limitazioni, tra cui il costo elevato, bassa velocità effettiva e granulometria limitata. Il film sottile stretching approccio è anche vantaggioso perché le particelle sono modificate per essere anisotropo dopo ...

Cellule presentanti l'antigene artificiale (aAPC) hanno indicato la promessa come agenti immunomodulatori perché possono generare una risposta robusta cellula di T antigene-specifiche. Essenziale per queste piattaforme sono la loro capacità di presentare in modo efficiente i segnali cruciali per l'attivazione delle cellule T. AAPC acellular sono un'alternativa attraente ai aAPC basati su cellule perché sono più facili e meno costoso da fabbricare, affrontare sfide meno durante scale-up e traduzione e alleviare i rischi connessi con le terapie basate sulle cellule. AAPC acellulare consentono anche di un elevato grado di controllo sui parametri di presentazione di segnale e le proprietà fisiche della superficie che si interfaccia con le cellule di T1.
aAPC deve ricapitolare un minimo di due segnali essenziali per l'attivazione delle cellule T. Segnale 1 fornisce il riconoscimento dell'antigene e si verifica quando il recettore delle cellule T (TCR) riconosce e si impegna con un MHC di classe I o II cuscinetto suo antigene cognata, che culmina nella segnalazione attraverso il complesso TCR. Per ignorare il requisito di specificità dell'antigene, aAPC sistemi spesso sopportano un agonistica dell'anticorpo monoclonale contro il recettore CD3, che non specifico stimola il complesso TCR. Forme ricombinanti di MHC, particolarmente dei multimeri MHC, sono state utilizzate anche sulla superficie della aAPC per fornire la specificità dell'antigene2,3. 2 è un segnale di costimolazione che indirizza l'attività delle cellule T. Per fornire la costimolazione necessari per l'attivazione delle cellule T, il recettore CD28 generalmente viene stimolato con un anticorpo agonista presentato sulla superficie aAPC, sebbene altri recettori costimolazione quali 4-1BB siano stati correttamente mirate4. Proteine di segnale 1 e 2 sono in genere immobilizzati sulla superficie delle particelle rigide di sintetizzare aAPC. Storicamente, aAPC sono stati fabbricati da una varietà di materiali, tra cui polistirolo4,5 e ferro destrano6. Sistemi più recenti utilizzano polimeri biodegradabili come poli (acido lattico-co-glicolico) (PLGA) per generare aAPC che può essere facilmente accoppiato per proteine di segnale, sono adatti per amministrazione diretta in vivoe può facilitare il rilascio prolungato di incapsulato citochine o fattori solubili per aumentare l'attivazione delle cellule T7,8.
Oltre alla presenza di proteine di segnale necessario, impegno del ricevitore su una superficie sufficientemente grande durante l'interazione aAPC/T è essenziale per l'attivazione delle cellule T. Così, parametri fisici di aAPC quali dimensioni e forma drasticamente alterano la loro area di contatto disponibile e influenzano la loro capacità di stimolare le cellule T. AAPC micron imprese hanno dimostrato di essere più efficace a stimolando le cellule di T di loro su scala nanometrica controparti9,10. Tuttavia, nano-aAPC possono avere biodistribuzione superiore e migliore drenaggio ai linfonodi che possono migliorare la loro prestazione in vivo sopra micro-aAPC11. Forma è un'altra variabile di interesse in sistemi basati su particelle aAPC. Anisotropo aAPC hanno recentemente dimostrato di essere più efficace di particelle isotropiche a stimolando le cellule di T, principalmente a causa di interazione avanzata con cellule bersaglio accoppiato con l'assorbimento riduttore delle cellule aspecifiche. Le cellule legano preferenzialmente all'asse lungo del ellissoidale particelle, e il più grande raggio di curvatura e la superficie più piatta consentono più contatto tra la aAPC e la cellula T12. L'asse lungo di particelle ellissoidali inoltre scoraggia la fagocitosi, con conseguente tempo di circolazione aumentata rispetto a particelle sferiche seguendo in vivo amministrazione12,13. A causa di questi vantaggi, ellissoidale particelle mediano una maggiore espansione di antigene-specifiche cellule T in vitro e in vivo rispetto a particelle sferiche, un effetto osservato al micro e nanoscales12, 13. Ci sono varie strategie per fabbricare particelle anisotropiche, ma film sottile lo stretching è un metodo ampiamente accettato semplice utilizzato per generare una gamma di particelle diverse forme14. A seguito di sintesi, particelle sono gettate nel film e allungate in una o due dimensioni ad una temperatura sopra la temperatura di transizione vetrosa del materiale della particella. Il film è poi sciolto per recuperare le particelle. Nonostante la crescente interesse in particelle anisotropiche, approcci attuali per fabbricazione aAPC basati su particelle sono per lo più limitati ai sistemi isotropi e metodi di alterare la forma delle particelle possono essere difficile da implementare, incompatibile con alcune sintesi aAPC strategie e mancanza di precisione e riproducibilità15. La nostra tecnica di allungamento del film sottile può essere eseguita manualmente o in modo automatico per generare velocemente anisotropiche particelle sintetizzate da una varietà di polimeri biodegradabili, estesa per un rapporto di aspetto desiderato in una o due dimensioni15.
Basato sul nostro lavoro precedente, abbiamo sviluppato un approccio basato su particelle biodegradabile combinato con scalabile tecnologia a film sottile che si estende per generare velocemente aAPC con forma e dimensioni sintonizzabile ad un modo standardizzato per cellula T espansione ex vivo o in vivo. La nostra strategia di coniugazione di proteina può essere utilizzato per accoppiare qualsiasi proteina di interesse per i gruppi carbossilici sulla superficie della particella ad una densità desiderata, dando questo sistema aAPC un elevato grado di flessibilità. Descriviamo anche metodi per caratterizzare la dimensione, la morfologia e la proteina di superficie contenuta di aAPC e per valutare la loro funzionalità in vitro. Questo protocollo può essere facilmente adattato per espandere le cellule immunitarie ex vivo o in vivo per una varietà di applicazioni di immunoterapia.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Poly(vinyl alcohol), MW 25000, 88% hydrolyzed</td>
			<td>Polysciences, Inc.</td>
			<td>02975-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Thermometer</td>
			<td>Fluke</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Model name: Fluke 52 II</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersion Temperature Probe</td>
			<td>Fluke</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Model name: Fluke 80PK 22</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Hotplate &#38; Stirrer</td>
			<td>Benchmark Scientific</td>
			<td>H3760-HS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multipoint stirrer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>50093538</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Resomer RG 504 H, Poly(D,L-lactide-co-glycolide)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>719900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichloromethane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D65100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homogenizer</td>
			<td>IKA</td>
			<td>&#160;0003725001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>Sonics &#38; Materials, Inc.</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Model number: VC 505</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator sound abating enclosure</td>
			<td>Sonics &#38; Materials, Inc.</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Part number: 630-0427</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator probe</td>
			<td>Sonics &#38; Materials, Inc.</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Part number: 630-0220</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator microtip</td>
			<td>Sonics &#38; Materials, Inc.</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Part number: 630-0423</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High speed centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Model number: J-20XP (discontinued), alternative model: J-26XP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High speed centrifuge rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>369691</td>
			<td>Model number: JA-17</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High speed polycarbonate centrifuge tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>3118-0050</td>
			<td>50 mL, screw cap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rectangular disposable petri dish</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>25384-322</td>
			<td>75 x 50 x 10 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Square disposable petri dish</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>10799-140</td>
			<td>100 mm x 100 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LEAF&#160;Purified anti-mouse CD3&#949; Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>InVivoMab anti-mouse CD28, clone 37.51</td>
			<td>Bio X Cell</td>
			<td>BE0015-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-(3-Dimethylaminopropyl)-N&#8242;-ethylcarbodiimide hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E6383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Hydroxysulfosuccinimide sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>56485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3671</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 anti-mouse CD3 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-mouse CD28 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>102109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning&#160;96 Well Solid Polystyrene Microplate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS3915</td>
			<td>flat bottom, black polystyrene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein LoBind Tubes, 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22431081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Medium (+ L-Glutamine)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11875093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F4135</td>
			<td>Heat Inactivated, sterile-filtered</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ciprofloxacin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>17850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human IL-2 (carrier-free)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>589102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate (100 mM)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11360070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Vitamin Solution (100X)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11120052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD8a+&#160;T Cell Isolation Kit, mouse</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-104-075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>C34554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS Columns</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MidiMACS Separator</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-042-302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS Multistand</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-042-303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Cytometer</td>
			<td>Accuri C6</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synergy 2 Multi-Detection Microplate Reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>autoMACS Running Buffer</td>
			<td>Miltenyi BIotech</td>
			<td>130-091-221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>22363548</td>
			<td>Sterile, 70 &#181;m nylon mesh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACK Lysing Buffer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A1049201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6J (Black 6) Mouse</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>000664</td>
			<td>Male, at least 7 weeks old</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-Bottom Tissue Culture Plates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>353227</td>
			<td>Sterile, 96-well tissue culture treated polystyrene plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 V DC Power Supply</td>
			<td>Probotix</td>
			<td>LPSK-4010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE Coated Wire</td>
			<td>Mouser</td>
			<td>602-5858-100-01</td>
			<td>This is for a 100 ft. spool but an equivalent wire will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stepper Motor Driver</td>
			<td>Probotix</td>
			<td>MondoStep5.6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IDC Connector Kit</td>
			<td>Probotix</td>
			<td>IDCM-10-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcontroller</td>
			<td>Probotix</td>
			<td>PBX-RF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4A Fuses</td>
			<td>Radio Shack</td>
			<td>2701026</td>
			<td>Equivalent fuses will work as well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DB25 Male to Male Cable</td>
			<td>Probotix</td>
			<td>DB25-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USB-A to USB-B Cable</td>
			<td>Staples</td>
			<td>2094915</td>
			<td>Equivalent cable will work as well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-Pin Amphenol Connectors Male and Female</td>
			<td>Mouser</td>
			<td>654-97-3100A-20-7P and 654-97-3106A20-7S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stepper Motor</td>
			<td>Probotix</td>
			<td>HT23-420-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Right Hand Lead Screw</td>
			<td>Roton</td>
			<td>60722</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Left Hand Lead Screw</td>
			<td>Roton</td>
			<td>60723</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screws</td>
			<td>McMaster Carr</td>
			<td>92196A151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neoprene Rubber</td>
			<td>McMaster Carr</td>
			<td>8698K51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Right Handed Flanged Lead Nut</td>
			<td>Roton</td>
			<td>91962</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Left Handed Flanged Lead Nut</td>
			<td>Roton</td>
			<td>91963</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Linux Control Computer</td>
			<td>Probotix</td>
			<td>LCNC-PC</td>
			<td>Any computer with matching specification and Linux operating system will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning bottle-top vacuum filter system</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS431097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution, 0.4 %</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fabrication of anisotropic polymeric artificial antigen presenting cells for cd8+ t cell activation

Cellule presentanti l'antigene artificiale (aAPC) sono una promettente piattaforma per modulazione immune dovuto la loro capacità potente per stimolare le cellule T. Substrati acellulare offrono vantaggi chiave sopra basati su cellule aAPC, compreso un controllo preciso dei parametri di presentazione di segnale e le proprietà fisiche della superficie aAPC per modulare le interazioni con le cellule T. aAPC costruito da particelle anisotropiche, particelle particolarmente ellissoidali, hanno dimostrato di essere più efficace di contattare loro controparti sferiche a stimolando le cellule di T a causa di grippaggio aumentato e maggiore superficie disponibile per la cellula T, anche come ha ridotto l'assorbimento non specifico e migliorate proprietà farmacocinetiche. Nonostante il crescente interesse anisotropiche particelle, anche ampiamente accettato metodi di generazione di particelle anisotropiche come allungamento del film sottile può essere difficile da implementare e utilizzare in modo riproducibile.
A tal fine, descriviamo un protocollo per la fabbricazione rapida, standardizzato di biodegradabile aAPC anisotropo basati su particelle con dimensioni regolabili, forma e segnale presentazione per cellula T espansione ex vivo o in vivo, insieme ai metodi di caratterizzano la loro dimensione, morfologia e superficie contenuto proteico e per valutare la loro funzionalità. Questo approccio a fabbricare aAPC anisotropico è scalabile e riproducibile, che lo rende ideale per la generazione di aAPC per immunoterapie "standard".

Uno schema per il film sottile 2D automatico dispositivo di allungamento è dato in Figura 1. Un disegno schematico e una descrizione per un film sottile di 1D stretching dispositivo è dato Ho et al.17 la barella viene costruita dalle parti di alluminio mediante fresatura standard e tecniche di lavorazione. Simile alla barella 1D, 2D barella è costituito da manopole metalliche e rotaie di guida. Viti di trasmissione bidirezionale ven...

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Fabrication of Anisotropic Polymeric Artificial Antigen Presenting Cells for CD8+ T Cell Activation

Qui, presentiamo un protocollo per in modo rapido e riproducibile generare articifical biologicamente ispirato, biodegradabile antigene che presenta le cellule (aAPC) con sintonizzabile dimensione, forma e presentazione di proteina di superficie per cellula T espansione ex vivo o in vivo .

Fabbricazione di anisotropo polimerici artificiali Antigen Presenting Cells per l'attivazione delle cellule T CD8 +

Artificial antigen presenting cells (aAPC) are a promising platform for immune modulation due to their potent ability to stimulate T cells. Acellular ...

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'ammino-ingegneria. Ad esempio, qual è il ruolo delle proprietà fisiche delle particelle sulle interazioni e l'attivazione delle cellule immunitarie dei biomateriali. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente un controllo indipendente delle dimensioni e della forma delle particelle biomimetiche.Le implicazioni di questa tecnica si estendono verso la terapia del cancro in quanto è una terapia con particelle fuori dallo scaffale che può causare risposte immunitarie mediate in cellule in vivo. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sull'amminoterapia del cancro, può anche essere applicato ad altri sistemi. Come, malattie infettive o diabete di tipo Uno.Per la sintesi di microschede, iniziare pesando 100 milligrammi di poli (acido lattico-co-glicolico) o PLGA, in una fiala a scintillazione e sciogliendo il PLGA in cinque millilitri di diclorometano mediante vortice. Posizionare un omogeneizzatore in un bicchiere contenente 50 millilitri di alcol polivinilico all'1% o soluzione di PVA, in modo che l'omogeneizzatore sia il più vicino possibile al fondo del becher senza toccarlo. Accendere l'omogeneizzatore alla velocità appropriata e aggiungere la soluzione PLGA al becher per un minuto di omogeneizzazione.Al termine dell'omogeneizzazione, versare la soluzione di micro-particelle PLGA alcoliche polivinilici in un bicchiere contenente 100 millilitri di soluzione di 5%PVA su una piastra di agitazione in una cappa chimica e mescolare la soluzione per almeno quattro ore. Quando il solvente è evaporato, versare la soluzione di particelle in tubi conici da 50 millilitri e raccogliere le particelle mediante centrifugazione. Sostituire il supernatante in ogni tubo con 20 millilitri di acqua deionizzata e sospendere di nuovo le particelle con vortice.Quindi portare il volume finale in ogni tubo fino a 50 millilitri con acqua deionizzata fresca e lavare le particelle altre due volte come appena dimostrato. Per la sintesi di nanoparticelle, sciogliere 200 milligrammi di PLGA in cinque millilitri di diclorometano e posizionare una sonda sonicatore in un bicchiere contenente 50 millilitri di soluzione di 1%PVA sul ghiaccio senza toccare il fondo del becher. Iniziare la sonicazione a 12 watt e aggiungere immediatamente la soluzione PLGA al becher per una sonicazione di due minuti per generare nanoparticelle con un diametro approssimativo di 200 nanometri.Dopo la sonicazione, versare la soluzione di nanoparticelle PLGA al 1% di alcol polivinile in un bicchiere contenente 100 millilitri di soluzione di 5 PVA su una piastra di agitazione per quattro ore di evaporazione del solvente in una cappa chimica dei fumi. Quando tutto il solvente viene evaporato, versare la soluzione di particelle in tubi conici da 50 millilitri per la centrifugazione per rimuovere eventuali micro-particelle e rimuovere i supernatanti. Quindi trasferire le nanoparticelle in tubi di centrifuga ad alta velocità per tre lavaggi in acqua deionizzata come dimostrato.Per la fabbricazione di particelle polimeriche, dopo l'ultimo lavaggio, sospendere di nuovo le particelle in circa un millilitro di acqua deionizzata fresca e aggiungere la soluzione di fusione del film alle particelle ad una concentrazione finale di 2,5 milligrammi per particelle millilitre. Trasferire la sospensione delle particelle in aliquote da 10 millilitri in piastre di Petri rettangolari da 75 per 50 millimetri per uno stiramento unidimensionale. O in aliquote da 15 millilitri in piastre di Petri quadrate da 100 per 100 millimetri per lo stretching bidimensionale.Dopo l'asciugatura notturna in una cappa chimica, utilizzare una pinzetta per rimuovere le pellicole e tagliare i bordi con le forbici. Per lo stretching 1D, posizionare i due bordi corti di una pellicola tra due pezzi di gomma neoprene per il montaggio sui blocchi di alluminio di un asse di un dispositivo di stiramento automatico a film sottile. Quindi utilizzare una chiave inglese Allen per avvitare le impugnature metalliche sopra la gomma per tenere il film in posizione.Per lo stiramento 2D, montare tutti e quattro i bordi su quattro blocchi di alluminio per allungare la pellicola su entrambi gli assi misurare e registrare la lunghezza della pellicola tra i blocchi di alluminio su un asse per uno stiramento D o entrambi gli assi per lo stiramento 2D e calcolare la distanza necessaria per allungare la pellicola in una o due direzioni in base all'allungamento della piega desiderato. Quindi posizionare il dispositivo di stiramento caricato in pellicola in un forno a 90 gradi Celsius accanto a un becher più grande di una piccola quantità di acqua per portare il film a temperatura superiore a 10 minuti. Al termine dello stiramento, lasciare raffreddare il film a temperatura ambiente per 20 minuti.Per lo stretching 1D, tagliare il film dal dispositivo di allungamento ai bordi. Per lo stiramento 2D, ritagliare e salvare il quadrato centrale della pellicola che è uniformemente allungato su entrambi gli assi. Posizionare le pellicole in tubi conici da 50 millilitri con non più di due pellicole per tubo e aggiungere circa 25 millilitri di acqua deionizzata a ciascun tubo per il vortice.Quando le pellicole si sono sciolte, lavare le particelle tre volte in acqua deionizzata come dimostrato. Sospensione delle particelle in circa un millilitro di acqua deionizzata fresca per tubo dopo l'ultimo lavaggio. Quindi congelare le particelle a meno 80 gradi Celsius per un'ora o la liofilizzazione notturna.La mattina seguente, sospendere di nuovo le micro o nanoparticelle lyophilizzate a 20 milligrammi per millilitro in tampone MES appena preparato con vortice. Aggiungere 100 microlitri della soluzione particellare a un tubo di micro centrifuga in polipropilene contenente 900 microlitri di buffer MES e aggiungere 100 microlitri di soluzione EDC NHS appena preparata. Mescolare le particelle vortice e incubare le particelle su un inverter a temperatura ambiente per 30 minuti.Alla fine dell'incubazione, raccogliere le particelle per centrifugazione e sospendere di nuovo i pellet di microparticelle in un millilitro di PBS vortice o ri-sospendere le nanoparticelle in un millilitro di PBS di cinque secondi di sonicazione a due o tre watt. Successivamente, aggiungere otto microgrammi di un segnale adatto una proteina e 10 microgrammi di anticorpo CD28 anti topo alle microparticelle, o 16 microgrammi del segnale una proteina e 20 microgrammi di CD28 anti topo alle nanoparticelle. Portare il volume finale in ogni tubo a 1,1 millilitro con PBS e incubare le particelle durante la notte su un inverter a quattro gradi Celsius.Il giorno dopo, lavare le particelle tre volte in acqua deionizzata come dimostrato. Queste nano e microparticelle PLGA sono state sintetizzati utilizzando le singole tecniche di emulsione come dimostrato e immaginato usando la microscopia elettronica a trasmissione e scansione. Dopo l'omogeneizzazione, le micro-particelle hanno dimostrato un diametro medio di circa tre micrometri.Le micro-particelle sferiche avevano una razione di aspetto di circa una, mentre le particelle ellissoidali prolate 1D avevano un rapporto di aspetto più grande di circa tre anni e mezzo e le particelle ellissoidali oblate allungate 2D avevano un rapporto di aspetto di circa 1,2, mantenendo approssimativamente un rapporto di aspetto di uno. I risultati dell'efficienza coniugazione rivelano le quantità simili di proteine sulla superficie delle cellule di presentazione dell'antigene micro-artificiale sferico ed ellissoidale, o AAPC e nano-AAPC, dimostrando che l'accoppiamento proteico durante la sintesi AAPC avviene in modo dipendente dalla concentrazione. Si è scoperto che l'AAPC ellissoidale prolato induce livelli più elevati di proliferazione cellulare T a dosi sub-sature rispetto all'AAPC sferico con la migliore separazione raggiunta a una dose di 01 milligrammi.Dopo sette giorni, il conteggio manuale delle cellule T ha rivelato che l'AAPC ellissoidale prolato stimola più efficacemente le cellule T rispetto alle loro controparti sferiche su scala micro e nano in modo dipendente dalla dose. Seguendo questa procedura, AAPC può essere amministrato in vivo per misurarne l'efficacia terapeutica e la farmacocinetica. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha contribuito a spianare la strada ai ricercatori nel campo dell'immuno-ingegneria per esplorare l'effetto dell'anisotropia sull'efficacia AAPC.

Research

JoVE Journal

Environment

Mass Production of Genetically Modified Aedes aegypti for Field Releases in Brazil

Mass Production of Genetically Modified Aedes aegypti for Field Releases in Brazil

Produzione di massa di Aedes aegypti geneticamente modificati per rilasci sul campo in Brasile

New techniques and methods are being sought to try to win the battle against mosquitoes. Recent advances in molecular techniques have led to the ...

Ricerca

Ambiente

Measuring Fluxes of Mineral Nutrients and Toxicants in Plants with Radioactive Tracers

Flussi di minerali nutrienti e sostanze tossiche in misura Piante con traccianti radioattivi

Unidirectional influx and efflux of nutrients and toxicants, and their resultant net fluxes, are central to the nutrition and toxicology of plants. ...

A Whole Cell Bioreporter Approach to Assess Transport and Bioavailability of Organic Contaminants in Water Unsaturated Systems

A Whole marcatura già cellulare approccio per valutare i trasporti e la biodisponibilità di contaminanti organici in acqua insaturi Sistemi

Bioavailability of contaminants is a prerequisite for their effective biodegradation in soil. The average bulk concentration of a contaminant, however, is ...

Use of Chironomidae (Diptera) Surface-Floating Pupal Exuviae as a Rapid Bioassessment Protocol for Water Bodies

Use of Chironomidae Diptera Surface-Floating Pupal Exuviae as a Rapid Bioassessment Protocol for Water Bodies

Uso di Chironomidae (Ditteri) pupa esuvie come Rapid Bioassessment protocollo per i corpi idrici-galleggiante Surface

Rapid bioassessment protocols using benthic macroinvertebrate assemblages have been successfully used to assess human impacts on water quality. ...

Extraction of Structural Extracellular Polymeric Substances from Aerobic Granular Sludge

Estrazione di sostanze strutturale extracellulare polimerici da aerobico granulare fanghi

To evaluate and develop methodologies for the extraction of gel-forming extracellular polymeric substances (EPS), EPS from aerobic granular sludge (AGS) ...

Functionalization and Dispersion of Carbon Nanomaterials Using an Environmentally Friendly Ultrasonicated Ozonolysis Process

Funzionalizzazione e dispersione dei nanomateriali del carbonio utilizzando un processo di ozonolisi ecologico ecologico

Functionalization of carbon nanomaterials is often a critical step that facilitates their integration into larger material systems and devices. In the ...

Ecosystem Fabrication (EcoFAB) Protocols for The Construction of Laboratory Ecosystems Designed to Study Plant-microbe Interactions

Ecosystem Fabrication EcoFAB Protocols for The Construction of Laboratory Ecosystems Designed to Study Plant-microbe Interactions

Protocolli di fabbricazione (EcoFAB) di ecosistema per la costruzione degli ecosistemi di laboratorio progettato per studiare le interazioni piante-microrganismi

Beneficial plant-microbe interactions offer a sustainable biological solution with the potential to boost low-input food and bioenergy production. A ...

A Strain Gauge Monitor (SGM) for Continuous Valve Gape Measurements in Bivalve Molluscs in Response to Laboratory Induced Diel-cycling Hypoxia and pH

A Strain Gauge Monitor SGM for Continuous Valve Gape Measurements in Bivalve Molluscs in Response to Laboratory Induced Diel-cycling Hypoxia and pH

Un Monitor di Strain Gauge (SGM) per misurazioni continue di Gape valvola nei molluschi bivalvi in risposta all'ipossia laboratorio indotto Diel-ciclismo e pH

An inexpensive, laboratory-based, strain gauge valve gape monitor (SGM) was developed to monitor the valve gape behavior of bivalve molluscs in response ...

Bioindication Testing of Stream Environment Suitability for Young Freshwater Pearl Mussels Using In Situ Exposure Methods

Bioindication Testing of Stream Environment Suitability for Young Freshwater Pearl Mussels Using In Situ Exposure Methods

Bioindicazione test di idoneità ambiente Stream per giovani d'acqua dolce perla cozze utilizzando metodi di esposizione In Situ

Knowledge of habitat suitability for freshwater mussels is an important step in the conservation of this endangered species group. We describe a protocol ...

Cultivation of Green Microalgae in Bubble Column Photobioreactors and an Assay for Neutral Lipids

Coltivazione di microalghe verdi in bolla colonna fotobioreattori e un saggio di lipidi neutri

There is significant interest in the study of microalgae for engineering applications such as the production of biofuels, high value products, and for the ...