Name: fabrication of anisotropic polymeric artificial antigen presenting cells for cd8+ t cell activation
Uploaded: 2018-10-12T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fabrication of Anisotropic Polymeric Artificial Antigen Presenting Cells for CD8+ T Cell Activation at JoVE.com

EBA (DGE-1746891)와 KRR (DGE-1232825) NSF 대학원 연구 친교 프로그램을 지원 위한 감사합니다. RAM 국가 연구 서비스 상 NIH NCI F31 감사 (F31CA214147)와 지원을 위해 대학 과학자 들은 친목을 위한 성과 보상. 저자 감사 NIH (R01EB016721 및 R01CA195503), 방지 실명 제임스와 캐롤 무료 카 탈 수상, 연구 및 지원에 대 한 암 Immunotherapy JHU 블룸버그 Kimmel 연구소.

여기에 설명 된 모든 메서드는 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)의 존스 홉킨스 대학에 의해 승인 되었습니다.
1. 가변 크기의 구형 PLGA 입자의 제조
<ol><li>입자 합성에 대 한 자료의 준비<ol>
<li>5 %w / w 폴 리 비닐 알코올 (PVA) 솔루션을 준비 합니다.<ol>
<li>마그네틱 볶음 바 삼각 플라스 크에 이온된 (DI) 수의 500 mL를 추가 하 고 온도계로 핫 플레이트 활동가 500 rpm 및 모니터 ?...

<ol>
	<li>Eggermont, L. J., Paulis, L. E., Tel, J., Figdor, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+efficient+cancer+immunotherapy:+Advances+in+developing+artificial+antigen-presenting+cells.">Towards efficient cancer immunotherapy: Advances in developing artificial antigen-presenting cells.</a> Trends in Biotechnology. 32 (9), 456-465 (2014).</li><li>Maus, M. V., Riley, J. L., Kwok, W. W., Nepom, G. T., June, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HLA+tetramer-based+artificial+antigen-presenting+cells+for+stimulation+of+CD4++T+cells.">HLA tetramer-based artificial antigen-presenting cells for stimulation of CD4+ T cells.</a> Clinical Immunology. 106 (1), 16-22 (2003).</li><li>Oelke, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+induction+and+expansion+of+antigen-specific+cytotoxic+T+cells+by+HLA-Ig-coated+artificial+antigen-presenting+cells.">Ex vivo induction and expansion of antigen-specific cytotoxic T cells by HLA-Ig-coated artificial antigen-presenting cells.</a> Nature Medicine. 9 (5), 619-624 (2003).</li><li>Rudolf, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potent+costimulation+of+human+CD8+T+cells+by+anti-4-1BB+and+anti-CD28+on+synthetic+artificial+antigen+presenting+cells.">Potent costimulation of human CD8 T cells by anti-4-1BB and anti-CD28 on synthetic artificial antigen presenting cells.</a> Cancer Immunology, Immunotherapy. 57 (2), 175-183 (2008).</li><li>Tham, E. L., Jensen, P. L., Mescher, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+antigen-specific+T+cells+by+artificial+cell+constructs+having+immobilized+multimeric+peptide-class+I+complexes+and+recombinant+B7-Fc+proteins.">Activation of antigen-specific T cells by artificial cell constructs having immobilized multimeric peptide-class I complexes and recombinant B7-Fc proteins.</a> Journal of Immunological Methods. 249 (1-2), 111-119 (2001).</li><li>Perica, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+field-induced+T+cell+receptor+clustering+by+nanoparticles+enhances+T+cell+activation+and+stimulates+antitumor+activity.">Magnetic field-induced T cell receptor clustering by nanoparticles enhances T cell activation and stimulates antitumor activity.</a> ACS Nano. 8 (3), 2252-2260 (2014).</li><li>Steenblock, E. R., Fadel, T., Labowsky, M., Pober, J. S., Fahmy, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+artificial+antigen-presenting+cell+with+paracrine+delivery+of+IL-2+impacts+the+magnitude+and+direction+of+the+T+cell+response.">An artificial antigen-presenting cell with paracrine delivery of IL-2 impacts the magnitude and direction of the T cell response.</a> The Journal of Biological Chemistry. 286 (40), 34883-34892 (2011).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paracrine+release+of+IL-2+and+anti-CTLA-4+enhances+the+ability+of+artificial+polymer+antigen-presenting+cells+to+expand+antigen-specific+T+cells+and+inhibit+tumor+growth+in+a+mouse+model.">Paracrine release of IL-2 and anti-CTLA-4 enhances the ability of artificial polymer antigen-presenting cells to expand antigen-specific T cells and inhibit tumor growth in a mouse model.</a> Cancer Immunology, Immunotherapy. 66 (9), 1229-1241 (2017).</li><li>Mescher, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+contact+requirements+for+activation+of+cytotoxic+T+lymphocytes.">Surface contact requirements for activation of cytotoxic T lymphocytes.</a> The Journal of Immunology. 149 (7), 2402-2405 (1992).</li><li>Steenblock, E. R., Fahmy, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+platform+for+ex+vivo+T-cell+expansion+based+on+biodegradable+polymeric+artificial+antigen-presenting+cells.">A comprehensive platform for ex vivo T-cell expansion based on biodegradable polymeric artificial antigen-presenting cells.</a> Molecular Therapy. 16 (4), 765-772 (2008).</li><li>Fifis, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size-dependent+immunogenicity:+therapeutic+and+protective+properties+of+nano-vaccines+against+tumors.">Size-dependent immunogenicity: therapeutic and protective properties of nano-vaccines against tumors.</a> The Journal of Immunology. 173 (5), 3148-3154 (2004).</li><li>Sunshine, J. C., Perica, K., Schneck, J. P., Green, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Particle+shape+dependence+of+CD8++T+cell+activation+by+artificial+antigen+presenting+cells.">Particle shape dependence of CD8+ T cell activation by artificial antigen presenting cells.</a> Biomaterials. 35 (1), 269-277 (2014).</li><li>Meyer, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biodegradable+nanoellipsoidal+artificial+antigen+presenting+cells+for+antigen+specific+T-cell+activation.">Biodegradable nanoellipsoidal artificial antigen presenting cells for antigen specific T-cell activation.</a> Small. 11 (13), 1519-1525 (2015).</li><li>Champion, J. A., Katare, Y. K., Mitragotri, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Particle+shape:+a+new+design+parameter+for+micro-+and+nanoscale+drug+delivery+carriers.">Particle shape: a new design parameter for micro- and nanoscale drug delivery carriers.</a> Journal of Controlled Release. 121 (1-2), 3-9 (2007).</li><li>Meyer, R. A., Meyer, R. S., Green, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+automated+multidimensional+thin+film+stretching+device+for+the+generation+of+anisotropic+polymeric+micro-+and+nanoparticles.">An automated multidimensional thin film stretching device for the generation of anisotropic polymeric micro- and nanoparticles.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 103 (8), 2747-2757 (2015).</li><li>Ho, C. C., Keller, A., Odell, J. A., Ottewill, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+monodisperse+ellipsoidal+polystyrene+particles.">Preparation of monodisperse ellipsoidal polystyrene particles.</a> Colloid and Polymer Science. 271 (5), 469-479 (1993).</li><li>Shum, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet+microfluidics+for+fabrication+of+non-spherical+particles.">Droplet microfluidics for fabrication of non-spherical particles.</a> Macromolecular Rapid Communications. 31 (2), 108-118 (2010).</li><li>Lan, W., Li, S., Xu, J., Luo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controllable+preparation+of+nanoparticle-coated+chitosan+microspheres+in+a+co-axial+microfluidic+device.">Controllable preparation of nanoparticle-coated chitosan microspheres in a co-axial microfluidic device.</a> Lab on a Chip. 11 (4), 652-657 (2011).</li><li>Yang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+synthesis+of+multifunctional+Janus+particles+for+biomedical+applications.">Microfluidic synthesis of multifunctional Janus particles for biomedical applications.</a> Lab on a Chip. 12 (12), 2097-2102 (2012).</li><li>Zhou, Z., Anselmo, A. C., Mitragotri, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+protein-based,+rod-shaped+particles+from+spherical+templates+using+layer-by-layer+assembly.">Synthesis of protein-based, rod-shaped particles from spherical templates using layer-by-layer assembly.</a> Advanced Materials. 25 (19), 2723-2727 (2013).</li><li>Jang, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Striped,+ellipsoidal+particles+by+controlled+assembly+of+diblock+copolymers.">Striped, ellipsoidal particles by controlled assembly of diblock copolymers.</a> Journal of the American Chemical Society. 135 (17), 6649-6657 (2013).</li><li>Petzetakis, N., Dove, A. P., O'Reilly, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cylindrical+micelles+from+the+living+crystallization-driven+self-assembly+of+poly(lactide)-containing+block+copolymers.">Cylindrical micelles from the living crystallization-driven self-assembly of poly(lactide)-containing block copolymers.</a> Chemical Science. 2 (5), 955-960 (2011).</li><li>Rolland, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+fabrication+and+harvesting+of+monodisperse,+shape-specific+nanobiomaterials.">Direct fabrication and harvesting of monodisperse, shape-specific nanobiomaterials.</a> Journal of the American Chemical Society. 127 (28), 10096-10100 (2005).</li><li>Meyer, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anisotropic+biodegradable+lipid+coated+particles+for+spatially+dynamic+protein+presentation.">Anisotropic biodegradable lipid coated particles for spatially dynamic protein presentation.</a> Acta Biomaterialia. 72, 228-238 (2018).</li></ol>

이 프로토콜 이방성 고분자 입자의 정확한 세대에 대 한 다양 한 방법을 자세히 설명합니다. 여기서 설명 하는 기술 스트레칭 박막 확장성, 높은 재현성 및 저렴 한입니다. 비 등방성 입자를 생성 하기 위한 대체 기술 높은 비용, 낮은 처리량, 그리고 제한 된 입자 크기를 포함 하 여 많은 한계에서 고통. 박막 접근 스트레칭 또한 유리 입자 합성, 후 이방성 되도록 수정 때문에 이며, 결과적으로 다?...

그들은 강력한 항 원 특정 T 세포 응답을 생성할 수 있기 때문에 인공 항 원 제시 세포 (aAPC) immunomodulatory 대리인으로 약속으로 나타났습니다. 이러한 플랫폼에 필수적인 그들의 능력을 효율적으로 T 세포 활성화에 대 한 중요 한 신호를 제시 있습니다. 그들은 쉽게 하 고 적은 비용이 많이 드는 조작, 스케일 업 및 번역, 중 적은 직면 및 세포 기반 치료와 관련 된 위험을 완화 하기 때문에 acellular aAPC 셀 기반 aAPC에 매력적인 대안 있습니다. Acellular aAPC는 또한 높은 정도의 제어 신호 프레 젠 테이 션 매개 변수 및 T 세포1인터페이스 표면의 물리적 특성에 대 한 수 있습니다.
aAPC는 2 개의 신호 T 세포 활성화에 대 한 필수 최소를 정리 해야 합니다. 신호 1 항 원 인식 하며 T 세포 수용 체 (TCR)를 인식 하 고 I 또는 II 베어링의 동족 항 원 TCR 복잡 통해 신호에 culminating MHC 클래스와 함께 종사 하는 경우에 발생 합니다. 항 원 특이성 요구 하지 않아도, aAPC 시스템은 종종 agonistic 단일 클론 항 체를 nonspecifically TCR 복잡 한 자극 CD3 수용 체에 대 한 부담. MHC, 특히 MHC multimers의 재조합 형태도 제공 하는 항 원 특이성2,3를 aAPC의 표면에 사용 되었습니다. 신호 2는 T 세포의 활동을 지휘 한 costimulatory 신호가 이다. T 세포 활성화에 필요한 costimulation를 하려면 CD28 수용 체는 일반적으로 자극 agonistic aAPC 표면에 항 체와 다른 costimulatory 수용 체 4-1BB 등 성공적으로 대상된4있다 지만. 1 및 2 신호 단백질은 일반적으로 합성 aAPC 엄밀한 입자의 표면에 움직일 수 있습니다. 역사적으로, aAPC 폴리스 티 렌4,5 와 철 dextran6을 포함 하 여 물자의 다양 한에서 조작 되어 있다. 폴 리 유산 공동 glycolic acid ()와 같은 생 분해성 고분자를 활용 하는 새로운 시스템 (PLGA)을 단백질 신호를 쉽게 결합 될 수 있다, 직접 관리에서 vivo에서, 적합의 지속적인된 출시를 촉진할 수 있다 aAPC 생성 하 cytokines 또는 T 세포 활성화7,8을 증가 시키기 위해 수용 성 요소를 캡슐화.
필요한 신호 단백질의 존재 뿐만 아니라 aAPC/T 세포 상호 작용 하는 동안 충분히 큰 표면 영역 수용 체 참여 T 세포 활성화를 위해 필수적 이다. 따라서, 크기와 모양이 같은 aAPC의 물리적 매개 변수 크게 사용할 수 있는 그들의 접촉 영역을 변경 하 고 T 세포를 자극 하는 그들의 기능에 영향을 미칠. 미크론 크기 aAPC 그들의 nanoscale 대응9,10보다 T 세포 자극에 더 효과적인 것으로 표시 되었습니다. 그러나, 나노 aAPC 우수한 biodistribution와 마이크로 aAPC11에 그들의 성능에서을 vivo에서 향상 시킬 수 있습니다 림프절에 더 나은 배수 장치를 가질 수 있습니다. 모양은은 aAPC 입자 기반 시스템에 대 한 관심의 또 다른 변수 이다. 이방성 aAPC 최근 대상 세포 감소 일반적인 셀 글귀와 결합 하 여 향상 된 상호 작용 때문에 주로 자극 T 세포에서 등방성 입자 보다 더 효과적인 것으로 표시 되었습니다. 셀 우선적으로 타원 입자의 긴 축에 바인딩할 고 큰 반지름 곡률 및 아첨 표면 aAPC T 셀12사이의 더 많은 접촉. 타원 입자의 긴 축에는 먹어서를, 증가 순환 시간 관리12,13 vivo에서 다음 구형 입자에 비해 결과 또한 낙담 한다. 이러한 이점 때문에 타원 입자는 효과 관찰 마이크로 및 nanoscales12, 항 원 특정 T 세포에서 생체 외에서 그리고 vivo에서 , 구형 입자에 비해의 큰 확장 중재 13. 비 등방성 입자를 조작 하는 다양 한 전략이 있다 하지만 박막 스트레칭 방법은 간단 하 고 널리 허용 다양 한 입자 모양14의 범위를 생성 하는 데 사용. 합성, 다음 입자 영화에 캐스팅 되며 입자 물자의 유리 전이 온도 이상의 온도에서 하나 또는 두 개의 크기에 기지개. 영화는 입자를 검색 하려면 다음 해산 된다. 비 등방성 입자에 대 한 관심 증가도 불구 하 고 조작 입자 기반 aAPC에 대 한 현재 접근은 주로 등방성 시스템 및 입자 모양 변경 방법 구현 하기 어려운, 호환 되지 않는 특정 aAPC 합성 수 전략, 그리고 부족 정밀도 재현성15. 우리의 박막 스트레칭 기법 수동으로 수행 하거나 빠르게 다양 한 생 분해성 고분자 합성 비 등방성 입자 생성을 자동화 된 방식에서 하나 또는 두 개의 크기15에서 원하는 종횡비를 뻗어 될 수 있습니다.
우리의 이전 작품을 바탕으로, 우리는 생 분해성 입자 기반 접근 방식을 개발 결합 기술로 확장 가능한 박막 스트레칭 빠르게 T 셀 확장 비보 전 또는 에 대 한 표준화 된 방식 aAPC 가변 크기와 형태를 생성 하 vivo. 주는이 aAPC 시스템 유연성의 높은 수준의 원하는 밀도, 입자 표면에 carboxyl 그룹에 관심의 모든 protein(s) 하 우리의 단백질 활용 전략을 사용할 수 있습니다. 우리는 또한 크기, 형태, 및 표면 단백질, aAPC의 콘텐츠를 특성화 하 고 그들의 기능에서 생체 외에서평가 하는 방법을 설명 합니다. 이 프로토콜은 면역 세포 vivo 전 또는 vivo에서 immunotherapeutic 응용 프로그램의 다양 한 확장을 쉽게 적용할 수 있습니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Poly(vinyl alcohol), MW 25000, 88% hydrolyzed</td>
			<td>Polysciences, Inc.</td>
			<td>02975-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Thermometer</td>
			<td>Fluke</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Model name: Fluke 52 II</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersion Temperature Probe</td>
			<td>Fluke</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Model name: Fluke 80PK 22</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Hotplate &#38; Stirrer</td>
			<td>Benchmark Scientific</td>
			<td>H3760-HS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multipoint stirrer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>50093538</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Resomer RG 504 H, Poly(D,L-lactide-co-glycolide)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>719900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichloromethane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D65100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homogenizer</td>
			<td>IKA</td>
			<td>&#160;0003725001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>Sonics &#38; Materials, Inc.</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Model number: VC 505</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator sound abating enclosure</td>
			<td>Sonics &#38; Materials, Inc.</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Part number: 630-0427</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator probe</td>
			<td>Sonics &#38; Materials, Inc.</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Part number: 630-0220</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator microtip</td>
			<td>Sonics &#38; Materials, Inc.</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Part number: 630-0423</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High speed centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Model number: J-20XP (discontinued), alternative model: J-26XP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High speed centrifuge rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>369691</td>
			<td>Model number: JA-17</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High speed polycarbonate centrifuge tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>3118-0050</td>
			<td>50 mL, screw cap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rectangular disposable petri dish</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>25384-322</td>
			<td>75 x 50 x 10 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Square disposable petri dish</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>10799-140</td>
			<td>100 mm x 100 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LEAF&#160;Purified anti-mouse CD3&#949; Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>InVivoMab anti-mouse CD28, clone 37.51</td>
			<td>Bio X Cell</td>
			<td>BE0015-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-(3-Dimethylaminopropyl)-N&#8242;-ethylcarbodiimide hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E6383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Hydroxysulfosuccinimide sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>56485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3671</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 anti-mouse CD3 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-mouse CD28 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>102109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning&#160;96 Well Solid Polystyrene Microplate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS3915</td>
			<td>flat bottom, black polystyrene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein LoBind Tubes, 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22431081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Medium (+ L-Glutamine)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11875093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F4135</td>
			<td>Heat Inactivated, sterile-filtered</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ciprofloxacin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>17850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human IL-2 (carrier-free)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>589102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate (100 mM)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11360070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Vitamin Solution (100X)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11120052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD8a+&#160;T Cell Isolation Kit, mouse</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-104-075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>C34554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS Columns</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MidiMACS Separator</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-042-302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS Multistand</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-042-303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Cytometer</td>
			<td>Accuri C6</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synergy 2 Multi-Detection Microplate Reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>autoMACS Running Buffer</td>
			<td>Miltenyi BIotech</td>
			<td>130-091-221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>22363548</td>
			<td>Sterile, 70 &#181;m nylon mesh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACK Lysing Buffer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A1049201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6J (Black 6) Mouse</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>000664</td>
			<td>Male, at least 7 weeks old</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-Bottom Tissue Culture Plates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>353227</td>
			<td>Sterile, 96-well tissue culture treated polystyrene plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 V DC Power Supply</td>
			<td>Probotix</td>
			<td>LPSK-4010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE Coated Wire</td>
			<td>Mouser</td>
			<td>602-5858-100-01</td>
			<td>This is for a 100 ft. spool but an equivalent wire will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stepper Motor Driver</td>
			<td>Probotix</td>
			<td>MondoStep5.6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IDC Connector Kit</td>
			<td>Probotix</td>
			<td>IDCM-10-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcontroller</td>
			<td>Probotix</td>
			<td>PBX-RF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4A Fuses</td>
			<td>Radio Shack</td>
			<td>2701026</td>
			<td>Equivalent fuses will work as well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DB25 Male to Male Cable</td>
			<td>Probotix</td>
			<td>DB25-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USB-A to USB-B Cable</td>
			<td>Staples</td>
			<td>2094915</td>
			<td>Equivalent cable will work as well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-Pin Amphenol Connectors Male and Female</td>
			<td>Mouser</td>
			<td>654-97-3100A-20-7P and 654-97-3106A20-7S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stepper Motor</td>
			<td>Probotix</td>
			<td>HT23-420-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Right Hand Lead Screw</td>
			<td>Roton</td>
			<td>60722</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Left Hand Lead Screw</td>
			<td>Roton</td>
			<td>60723</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screws</td>
			<td>McMaster Carr</td>
			<td>92196A151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neoprene Rubber</td>
			<td>McMaster Carr</td>
			<td>8698K51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Right Handed Flanged Lead Nut</td>
			<td>Roton</td>
			<td>91962</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Left Handed Flanged Lead Nut</td>
			<td>Roton</td>
			<td>91963</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Linux Control Computer</td>
			<td>Probotix</td>
			<td>LCNC-PC</td>
			<td>Any computer with matching specification and Linux operating system will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning bottle-top vacuum filter system</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS431097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution, 0.4 %</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fabrication of anisotropic polymeric artificial antigen presenting cells for cd8+ t cell activation

인공 항 원 제시 세포 (aAPC)는 T 세포를 자극 하는 강력한 능력으로 인해 면역 변조에 대 한 유망한 플랫폼입니다. Acellular 기판 신호 프레 젠 테이 션 매개 변수 정밀 제어 및 aAPC 표면 조절 T 세포와의 상호 작용의 물리적 속성을 포함 하는 셀 기반 aAPC에 비해 주요 장점을 제공 합니다. 비 등방성 입자에서 건설 aAPC 특히 타원 입자 자극 T 세포 증가 바인딩 및 T 세포에 사용할 수 있는 더 큰 표면 영역에 구형 들 문의 또한 보다 더 효과적인 것으로 표시 되었습니다 로 일반적인 이해 및 향상 된 pharmacokinetic 속성 감소. 비 등방성 입자에 대 한 관심 증가도 불구 하 고도 광범위 하 게 구현 하 고 사용할 reproducibly 도전적 일 수 있다 박막 스트레칭과 같은 비 등방성 입자를 생성의 방법 허용.
이 위해, 우리는 가변 크기, 모양, 생 분해성 비 등방성 입자 기반 aAPC의 급속 하 고, 표준화 된 제조에 대 한 프로토콜을 설명 하 고 T 세포 확장 비보 전 또는 vivo에서함께 하는 방법에 대 한 프레 젠 테이 션을 신호 그들의 크기, 형태, 및 표면 단백질 콘텐츠, 특성 및 그들의 기능을 평가 하기 위해. 이방성 aAPC 날조에이 접근은 확장 가능 하 고 재현성, 이상적 aAPC "상용" immunotherapies에 대 한 생성.

자동화 된 2D 박막 장치를 스트레칭 위한 회로도 그림 1에서 주어진 다. 회로도 및 장치를 스트레칭 1 D 박막에 대 한 설명을 들 것은 알루미늄 부품 표준 밀링 및 가공 기술을 사용 하 여에서 건설 하는 호 외.17 에 부여 됩니다. 1 D 들 것와 마찬가지로, 2D 들 것 금속 그립 및 가이드 레일의 구성 되어 있습니다. 양방향 리드 나사 선형 ?...

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Fabrication of Anisotropic Polymeric Artificial Antigen Presenting Cells for CD8+ T Cell Activation

여기, 우리는 빨리 그리고 reproducibly 생물학적 영감, 생 분해성 유일 항 원 제시 세포 (aAPC) 가변 크기, 모양, 및 T 셀 확장 비보 전 또는 vivo에서 표면 단백질 프레 젠 테이 션을 생성 하는 프로토콜을 제시 .

이방성 고분자 인공 항 원 제시 세포 CD8 + T 세포 활성화의 제조

Artificial antigen presenting cells (aAPC) are a promising platform for immune modulation due to their potent ability to stimulate T cells. Acellular ...

이 방법은 아미노 엔지니어링 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이러한, 생물 물질 면역 세포 상호 작용 및 활성화에 입자 물리적 특성의 역할은 무엇입니까. 이 기술의 주요 장점은 생체 모방 입자의 크기와 모양의 독립적 인 제어를 가능하게한다는 것입니다.이 기술의 의미는 생체 내 세포 중재 면역 반응을 일으킬 수있는 선반 입자 치료이기 때문에 암 의 치료로 확장됩니다. 이 방법은 암 아미노 치료에 대한 통찰력을 제공 할 수 있지만, 그것은 또한 다른 시스템에 적용 할 수 있습니다. 감염증 이나 타입-1 당뇨병과 같은.마이크로 입자 합성의 경우, 100 밀리그램의 폴리(젖산 공동 글리콜산) 또는 PLGA를 계량하여 신자극 유리병으로 계량하고 과류를 통해 5밀리리터의 디클로로메탄을 용해시킵니다. 균질화제는 1% 폴리비닐 알코올 또는 PVA 용액의 50 밀리리터를 포함하는 비커에 균질화제를 배치하여 균질화제는 그것을 건드리지 않고 가능한 한 비커의 바닥에 가깝습니다. 균질화기를 적절한 속도로 켜고 PLGA 솔루션을 비커에 1분간 균질화하십시오.균질화의 끝에서, 폴리 비닐 알코올 PLGA 마이크로 입자 용액을 화학 후드의 교반 판에 5% PVA 용액 의 100 밀리리터를 포함하는 비커에 부어 적어도 4 시간 동안 용액을 저어. 용매가 증발하면 입자 용액을 50 밀리리터 원원튜브에 붓고 원심분리에 의해 입자를 수집합니다. 각 튜브의 상체를 이온화 된 물의 20 밀리리터로 교체하고 소용돌이에 의해 입자를 다시 중단하십시오.그런 다음 각 튜브의 최종 부피를 신선한 이온화 물로 최대 50 밀리리터까지 가져와서 방금 설명한 대로 입자를 두 번 더 씻습니다. 나노 입자 합성의 경우, 디클로로메탄의 5 밀리리터에 PLGA의 200 밀리그램을 용해하고 비커의 바닥을 만지지 않고 얼음에 1 %의 PVA 용액의 50 밀리리터를 포함하는 비커에 초음파 프로브를 배치합니다. 12와트로 초음파 처리를 시작하고 즉시 약 200 나노미터 직경의 나노 입자를 생성하기 위해 2 분 초음파 처리에 대한 비커에 PLGA 솔루션을 추가합니다.초음파 처리 후, 화학 연기 후드에서 용매 증발의 4 시간 동안 교반 플레이트에 5 PVA 용액의 100 밀리리터를 포함하는 비커에 1 % 폴리 비닐 알코올 PLGA 나노 입자 용액을 부어. 모든 용매가 증발되면 입자 용액을 50밀리리터 원심 튜브에 부어 원심분리를 통해 미세입자를 제거하고 초월제를 제거합니다. 그런 다음 나노 입자를 고속 원심분리기 튜브로 이송하여 이온화 된 물에 세 개의 세 가지 를 입증하였다.폴리머 입자 제조의 경우, 마지막 세척 후, 입자를 신선한 이온화 물의 약 1 밀리리터로 다시 중단하고 밀리리터 입자당 2.5 밀리그램의 최종 농도로 입자에 필름 주조 용액을 추가합니다. 입자 현탁액을 10 밀리리터 알리쿼트에 넣고 75x 50mm 직사각형 페트리 접시로 옮기면 1차원 스트레칭을 합니다. 또는 15 밀리리터 알리쿼트에서 100- 100 밀리미터 평방 페트리 요리로 2차원 스트레칭.화학 후드에서 하룻밤 건조 후, 필름을 제거하고 가위로 가장자리를 손질 하는 핀셋을 사용 하 여. 1D 스트레칭의 경우, 자동화 된 박막 스트레칭 장치의 한 축의 알루미늄 블록에 장착하기 위해 네오프렌 고무의 두 조각 사이에 하나의 필름의 두 개의 짧은 가장자리를 배치합니다. 그런 다음 알렌 렌치를 사용하여 고무 위에 금속 그립을 나사로 고정하여 필름을 제자리에 고정시하십시오.2D 스트레칭의 경우 4개의 알루미늄 블록에 네 개의 가장자리를 모두 장착하여 두 축에 필름을 스트레칭하고 한 축의 알루미늄 블록 사이에 필름 길이를 기록하여 1D 스트레칭또는 2D 스트레칭을 위한 두 축을 모두 기록하고 원하는 접이식 스트레치에 따라 필름을 하나 또는 두 방향으로 스트레칭하는 데 필요한 거리를 계산합니다. 그런 다음 필름로드 스트레칭 장치를 소량의 물 위에 90도의 오븐에 놓아 필름을 10 분 이상 온도로 가져 갑니다. 스트레칭이 완료되면 필름을 실온으로 20분 간 식힙니다.1D 스트레칭의 경우 가장자리의 스트레칭 장치에서 필름을 잘라냅니다. 2D 스트레칭의 경우 두 축에 균일하게 뻗어있는 필름의 중앙 사각형을 잘라 내어 저장합니다. 튜브당 2개 이하의 필름이 없는 50밀리리터 원모형 튜브에 필름을 넣고, 소용돌이를 위해 각 튜브에 약 25밀리리터의 이온화 물을 추가합니다.필름이 용해되면, 입증 된 바와 같이 분해 된 물에 입자를 세 번 세척합니다. 마지막 세척 후 튜브 당 신선한 이온화 물의 약 1 밀리리터에서 입자를 다시 중단합니다. 그런 다음 입자를 영하 80도에서 1시간 또는 하룻밤 동안 동결합니다.다음 날 아침, 류필립이 준비된 MES 버퍼에서 밀리리터당 20밀리그램의 소닉 또는 나노 입자를 다시 중단합니다. 900 마이크로리터의 MES 버퍼를 포함하는 폴리프로필렌 마이크로 원심분리기 튜브에 100마이크로리터의 입자 용액을 추가하고 새로 준비된 EDC NHS 솔루션 100마이크로리터를 추가합니다. 입자를 소용돌이로 섞고 실온에서 인버터의 입자를 30분 동안 배양합니다.인큐베이션의 끝에서, 원심분리에 의해 입자를 수집하고 2~3와트에서 5초 간 초음파 처리로 PBS의 1밀리리터에서 나노 입자를 소용돌이 또는 다시 중단시킴으로써 PBS의 1밀리리터에서 마이크로 입자 펠릿을 다시 중단한다. 다음으로, 적당한 신호 1단백질과 10마이크로그램의 항체를 마이크로 입자에 추가하거나, 16마이크로그램의 알디알1 단백질과 20 마이크로그램의 항체 CD28을 나노 입자에 첨가한다. PBS로 각 튜브의 최종 부피를 1.1 밀리리터로 가져와 서인버터에서 하룻밤 사이에 입자를 섭씨 4도에서 배양합니다.다음 날, 입증 된 바와 같이, 이온화 된 물에 입자를 세 번 세척. 이러한 PLGA 나노 및 마이크로 입자는 전송 및 스캐닝 전자 현미경을 사용하여 입증및 이미지화된 단일 에멀젼 기술을 사용하여 합성되었다. 균질화 후, 마이크로 입자는 약 3 마이크로미터의 평균 직경을 보였다.구형 미세 입자는 약 1개의 양상 배급을 가졌고, 1D 뻗어있는 상골 탄성 입자는 약 3 반의 더 큰 종횡비를 가지었고 2D 뻗어 있는 타원 입자는 약 1.2의 종횡비를 가지며, 대략 1의 종횡비를 유지했다. 컨쥬게이션 효율 결과는 구형 및 타원 마이크로 인공 항원 제시 세포, 또는 AAPC 및 나노 AAPC의 표면에 유사한 양의 단백질을 드러내며, AAPC 합성 시 단백질 커플링이 농도 의존방식으로 발생한다는 것을 입증한다. Prolate 타원 AAPC는 01 밀리그램 용량에서 달성 된 최고의 분리와 구형 AAPC보다 하위 포화 용량에서 T 세포 증식의 높은 수준을 유도하는 것으로 나타났다.7 일 후, T 세포의 수동 계산은 탈장 AAPC가 용량 의존방식으로 마이크로 및 나노 척도에서 구형 대응에 비해 T 세포를 보다 효과적으로 자극한다는 것을 밝혔다. 이 절차에 따라, AAPC는 그들의 치료 효능 및 약동학을 측정 하기 위해 생체 내에서 관리 될 수 있습니다. 개발 후, 이 기술은 면역 공학 분야의 연구원들이 AAPC 효능에 대한 이색성 부호의 효과를 탐구하는 데 도움이되었습니다.

Research

JoVE Journal

Environment

Mass Production of Genetically Modified Aedes aegypti for Field Releases in Brazil

Mass Production of Genetically Modified Aedes aegypti for Field Releases in Brazil

브라질에서 필드 릴리스에 대 한 유전자 변형 Aedes aegypti의 대량 생산

New techniques and methods are being sought to try to win the battle against mosquitoes. Recent advances in molecular techniques have led to the ...

연구

환경과학

Measuring Fluxes of Mineral Nutrients and Toxicants in Plants with Radioactive Tracers

방사성 트레이서와 식물에 미네랄 영양 성분 및 독성 물질의 플럭스를 측정

Unidirectional influx and efflux of nutrients and toxicants, and their resultant net fluxes, are central to the nutrition and toxicology of plants. ...

A Whole Cell Bioreporter Approach to Assess Transport and Bioavailability of Organic Contaminants in Water Unsaturated Systems

전체 셀 Bioreporter 접근 물 불포화 시스템에서 유기 오염 물질의 운송과 생체 이용률을 평가하기 위해

Bioavailability of contaminants is a prerequisite for their effective biodegradation in soil. The average bulk concentration of a contaminant, however, is ...

Use of Chironomidae (Diptera) Surface-Floating Pupal Exuviae as a Rapid Bioassessment Protocol for Water Bodies

Use of Chironomidae Diptera Surface-Floating Pupal Exuviae as a Rapid Bioassessment Protocol for Water Bodies

Chironomidae (파리목)의 사용 표면 부동 물 기관에 대한 신속한 생물학적 평가 프로토콜로 번데기 Exuviae을

Rapid bioassessment protocols using benthic macroinvertebrate assemblages have been successfully used to assess human impacts on water quality. ...

Extraction of Structural Extracellular Polymeric Substances from Aerobic Granular Sludge

에어로빅 세분화 된 슬러지에서 구조 세포 외 고분자 물질의 추출

To evaluate and develop methodologies for the extraction of gel-forming extracellular polymeric substances (EPS), EPS from aerobic granular sludge (AGS) ...

Functionalization and Dispersion of Carbon Nanomaterials Using an Environmentally Friendly Ultrasonicated Ozonolysis Process

친환경 Ultrasonicated 오존 분해 공정을 이용한 탄소 나노 물질의 기능화 및 분산

Functionalization of carbon nanomaterials is often a critical step that facilitates their integration into larger material systems and devices. In the ...

Ecosystem Fabrication (EcoFAB) Protocols for The Construction of Laboratory Ecosystems Designed to Study Plant-microbe Interactions

Ecosystem Fabrication EcoFAB Protocols for The Construction of Laboratory Ecosystems Designed to Study Plant-microbe Interactions

식물-미생물 상호작용 연구 위한 실험실 생태계의 건설에 대 한 생태계 제조 (EcoFAB) 프로토콜

Beneficial plant-microbe interactions offer a sustainable biological solution with the potential to boost low-input food and bioenergy production. A ...

A Strain Gauge Monitor (SGM) for Continuous Valve Gape Measurements in Bivalve Molluscs in Response to Laboratory Induced Diel-cycling Hypoxia and pH

A Strain Gauge Monitor SGM for Continuous Valve Gape Measurements in Bivalve Molluscs in Response to Laboratory Induced Diel-cycling Hypoxia and pH

스트레인 게이지 모니터 (SGM) 쌍 각 조개 연체 동물 실험실 유도 Diel 순환 산소와 pH에에서 연속 밸브 품 측정에 대 한

An inexpensive, laboratory-based, strain gauge valve gape monitor (SGM) was developed to monitor the valve gape behavior of bivalve molluscs in response ...

Bioindication Testing of Stream Environment Suitability for Young Freshwater Pearl Mussels Using In Situ Exposure Methods

Bioindication Testing of Stream Environment Suitability for Young Freshwater Pearl Mussels Using In Situ Exposure Methods

Bioindication 영 민물 진주 홍합에 현장 노출 방법을 사용 하 여에 대 한 스트림 환경 적합성의 테스트

Knowledge of habitat suitability for freshwater mussels is an important step in the conservation of this endangered species group. We describe a protocol ...

Cultivation of Green Microalgae in Bubble Column Photobioreactors and an Assay for Neutral Lipids

중립 지질에 대 한 녹색 미세 거품 열 Photobioreactors에 시험 재배

There is significant interest in the study of microalgae for engineering applications such as the production of biofuels, high value products, and for the ...