Name: fabrication of anisotropic polymeric artificial antigen presenting cells for cd8+ t cell activation
Uploaded: 2018-10-12T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fabrication of Anisotropic Polymeric Artificial Antigen Presenting Cells for CD8+ T Cell Activation at JoVE.com

EBA (DGE-1746891) e o KRR (DGE-1232825) agradecem o programa de bolsa de pesquisa pós-graduação NSF para apoio. RAM graças a pesquisa nacional serviço prêmio NIH NCI F31 (F31CA214147) e as recompensas de realização para comunhão universitária de cientistas para apoio. Os autores agradecer o NIH (R01EB016721 e R01CA195503), a pesquisa para evitar cegueira James e Carole livre Catalyst Award e o Instituto de Bloomberg-Kimmel JHU de imunoterapia para apoio.

Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo cuidado institucional do Animal e Comissão de utilização (IACUC) da Universidade de Johns Hopkins.
1. fabricação de PLGA esférico partículas de tamanho ajustável
<ol><li>Preparação de materiais para a síntese de partículas<ol>
<li>Prepare a solução a 5% w/w de álcool polivinílico (PVA).<ol>
<li>Adicionar 500 mL de água desionizada (DI) para um Erlenmeyer com uma barra de agitação magnética e colocar no agitador de plac...

<ol>
	<li>Eggermont, L. J., Paulis, L. E., Tel, J., Figdor, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+efficient+cancer+immunotherapy:+Advances+in+developing+artificial+antigen-presenting+cells.">Towards efficient cancer immunotherapy: Advances in developing artificial antigen-presenting cells.</a> Trends in Biotechnology. 32 (9), 456-465 (2014).</li><li>Maus, M. V., Riley, J. L., Kwok, W. W., Nepom, G. T., June, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HLA+tetramer-based+artificial+antigen-presenting+cells+for+stimulation+of+CD4++T+cells.">HLA tetramer-based artificial antigen-presenting cells for stimulation of CD4+ T cells.</a> Clinical Immunology. 106 (1), 16-22 (2003).</li><li>Oelke, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+induction+and+expansion+of+antigen-specific+cytotoxic+T+cells+by+HLA-Ig-coated+artificial+antigen-presenting+cells.">Ex vivo induction and expansion of antigen-specific cytotoxic T cells by HLA-Ig-coated artificial antigen-presenting cells.</a> Nature Medicine. 9 (5), 619-624 (2003).</li><li>Rudolf, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potent+costimulation+of+human+CD8+T+cells+by+anti-4-1BB+and+anti-CD28+on+synthetic+artificial+antigen+presenting+cells.">Potent costimulation of human CD8 T cells by anti-4-1BB and anti-CD28 on synthetic artificial antigen presenting cells.</a> Cancer Immunology, Immunotherapy. 57 (2), 175-183 (2008).</li><li>Tham, E. L., Jensen, P. L., Mescher, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+antigen-specific+T+cells+by+artificial+cell+constructs+having+immobilized+multimeric+peptide-class+I+complexes+and+recombinant+B7-Fc+proteins.">Activation of antigen-specific T cells by artificial cell constructs having immobilized multimeric peptide-class I complexes and recombinant B7-Fc proteins.</a> Journal of Immunological Methods. 249 (1-2), 111-119 (2001).</li><li>Perica, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+field-induced+T+cell+receptor+clustering+by+nanoparticles+enhances+T+cell+activation+and+stimulates+antitumor+activity.">Magnetic field-induced T cell receptor clustering by nanoparticles enhances T cell activation and stimulates antitumor activity.</a> ACS Nano. 8 (3), 2252-2260 (2014).</li><li>Steenblock, E. R., Fadel, T., Labowsky, M., Pober, J. S., Fahmy, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+artificial+antigen-presenting+cell+with+paracrine+delivery+of+IL-2+impacts+the+magnitude+and+direction+of+the+T+cell+response.">An artificial antigen-presenting cell with paracrine delivery of IL-2 impacts the magnitude and direction of the T cell response.</a> The Journal of Biological Chemistry. 286 (40), 34883-34892 (2011).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paracrine+release+of+IL-2+and+anti-CTLA-4+enhances+the+ability+of+artificial+polymer+antigen-presenting+cells+to+expand+antigen-specific+T+cells+and+inhibit+tumor+growth+in+a+mouse+model.">Paracrine release of IL-2 and anti-CTLA-4 enhances the ability of artificial polymer antigen-presenting cells to expand antigen-specific T cells and inhibit tumor growth in a mouse model.</a> Cancer Immunology, Immunotherapy. 66 (9), 1229-1241 (2017).</li><li>Mescher, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+contact+requirements+for+activation+of+cytotoxic+T+lymphocytes.">Surface contact requirements for activation of cytotoxic T lymphocytes.</a> The Journal of Immunology. 149 (7), 2402-2405 (1992).</li><li>Steenblock, E. R., Fahmy, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+platform+for+ex+vivo+T-cell+expansion+based+on+biodegradable+polymeric+artificial+antigen-presenting+cells.">A comprehensive platform for ex vivo T-cell expansion based on biodegradable polymeric artificial antigen-presenting cells.</a> Molecular Therapy. 16 (4), 765-772 (2008).</li><li>Fifis, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size-dependent+immunogenicity:+therapeutic+and+protective+properties+of+nano-vaccines+against+tumors.">Size-dependent immunogenicity: therapeutic and protective properties of nano-vaccines against tumors.</a> The Journal of Immunology. 173 (5), 3148-3154 (2004).</li><li>Sunshine, J. C., Perica, K., Schneck, J. P., Green, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Particle+shape+dependence+of+CD8++T+cell+activation+by+artificial+antigen+presenting+cells.">Particle shape dependence of CD8+ T cell activation by artificial antigen presenting cells.</a> Biomaterials. 35 (1), 269-277 (2014).</li><li>Meyer, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biodegradable+nanoellipsoidal+artificial+antigen+presenting+cells+for+antigen+specific+T-cell+activation.">Biodegradable nanoellipsoidal artificial antigen presenting cells for antigen specific T-cell activation.</a> Small. 11 (13), 1519-1525 (2015).</li><li>Champion, J. A., Katare, Y. K., Mitragotri, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Particle+shape:+a+new+design+parameter+for+micro-+and+nanoscale+drug+delivery+carriers.">Particle shape: a new design parameter for micro- and nanoscale drug delivery carriers.</a> Journal of Controlled Release. 121 (1-2), 3-9 (2007).</li><li>Meyer, R. A., Meyer, R. S., Green, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+automated+multidimensional+thin+film+stretching+device+for+the+generation+of+anisotropic+polymeric+micro-+and+nanoparticles.">An automated multidimensional thin film stretching device for the generation of anisotropic polymeric micro- and nanoparticles.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 103 (8), 2747-2757 (2015).</li><li>Ho, C. C., Keller, A., Odell, J. A., Ottewill, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+monodisperse+ellipsoidal+polystyrene+particles.">Preparation of monodisperse ellipsoidal polystyrene particles.</a> Colloid and Polymer Science. 271 (5), 469-479 (1993).</li><li>Shum, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet+microfluidics+for+fabrication+of+non-spherical+particles.">Droplet microfluidics for fabrication of non-spherical particles.</a> Macromolecular Rapid Communications. 31 (2), 108-118 (2010).</li><li>Lan, W., Li, S., Xu, J., Luo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controllable+preparation+of+nanoparticle-coated+chitosan+microspheres+in+a+co-axial+microfluidic+device.">Controllable preparation of nanoparticle-coated chitosan microspheres in a co-axial microfluidic device.</a> Lab on a Chip. 11 (4), 652-657 (2011).</li><li>Yang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+synthesis+of+multifunctional+Janus+particles+for+biomedical+applications.">Microfluidic synthesis of multifunctional Janus particles for biomedical applications.</a> Lab on a Chip. 12 (12), 2097-2102 (2012).</li><li>Zhou, Z., Anselmo, A. C., Mitragotri, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+protein-based,+rod-shaped+particles+from+spherical+templates+using+layer-by-layer+assembly.">Synthesis of protein-based, rod-shaped particles from spherical templates using layer-by-layer assembly.</a> Advanced Materials. 25 (19), 2723-2727 (2013).</li><li>Jang, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Striped,+ellipsoidal+particles+by+controlled+assembly+of+diblock+copolymers.">Striped, ellipsoidal particles by controlled assembly of diblock copolymers.</a> Journal of the American Chemical Society. 135 (17), 6649-6657 (2013).</li><li>Petzetakis, N., Dove, A. P., O'Reilly, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cylindrical+micelles+from+the+living+crystallization-driven+self-assembly+of+poly(lactide)-containing+block+copolymers.">Cylindrical micelles from the living crystallization-driven self-assembly of poly(lactide)-containing block copolymers.</a> Chemical Science. 2 (5), 955-960 (2011).</li><li>Rolland, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+fabrication+and+harvesting+of+monodisperse,+shape-specific+nanobiomaterials.">Direct fabrication and harvesting of monodisperse, shape-specific nanobiomaterials.</a> Journal of the American Chemical Society. 127 (28), 10096-10100 (2005).</li><li>Meyer, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anisotropic+biodegradable+lipid+coated+particles+for+spatially+dynamic+protein+presentation.">Anisotropic biodegradable lipid coated particles for spatially dynamic protein presentation.</a> Acta Biomaterialia. 72, 228-238 (2018).</li></ol>

Este protocolo detalha um método versátil para a geração precisa de partículas poliméricas anisotrópicas. A película fina alongamento técnica descrita aqui é escalável, altamente reprodutível e barato. Técnicas alternativas para a geração de partículas anisotrópicas sofrem muitas limitações, incluindo o alto custo, baixa taxa de transferência e tamanho de partícula limitada. A película fina, abordagem de alongamento também é vantajosa porque as partículas são modificadas para serem anisotrópica...

Células de apresentação de antígeno artificial (aAPC) têm mostrado promessa como agentes imunomoduladores porque elas podem gerar uma resposta robusta pilha de T antígeno-específicas. Essenciais para essas plataformas são sua capacidade de apresentar eficientemente cruciais sinais para a ativação de células T. AAPC acelular são uma alternativa atraente para aAPC baseados em células, porque eles são mais fácil e menos dispendiosa fabricar, enfrentam poucos desafios durante o scale-up e Tradução e atenuar os riscos associados com terapias baseadas em células. AAPC acelular também permitem um alto grau de controle sobre parâmetros de apresentação do sinal e propriedades físicas da superfície que irá interagir com T células1.
aAPC deve recapitular um mínimo de dois sinais essenciais para a ativação de células T. Sinal 1 prevê o reconhecimento do antígeno e ocorre quando o receptor de células T (TCR) reconhece e se envolve com um MHC-classe I ou II, tendo seu antígeno cognato, culminando na sinalização através do TCR complexo. Para contornar a exigência de especificidade do antígeno, aAPC sistemas frequentemente suportar um agonístico anticorpo monoclonal contra o receptor CD3, que nonspecifically estimula o complexo TCR. Formas recombinantes do MHC, particularmente oriundas de MHC, também utilizámos na superfície da aAPC para fornecer o antígeno especificidade2,3. Sinal 2 é um sinal de co-estimulação que direciona a atividade das células T. Para fornecer o costimulation necessária para a ativação de células T, o receptor CD28 geralmente é estimulado com um anticorpo agonístico apresentado na superfície aAPC, apesar de outros receptores co-estimulação como 4-1BB foram alvejados com sucesso4. Proteínas de sinal 1 e 2 são normalmente imobilizadas na superfície de partículas rígidas para sintetizar aAPC. Historicamente, aAPC têm sido fabricados a partir de uma variedade de materiais, incluindo poliestireno4,5 e ferro dextrano6. Sistemas mais novos utilizam polímeros biodegradáveis como poli (ácido lático-co-glicólico) (PLGA) para gerar aAPC que pode ser facilmente acoplado para sinalizar proteínas, é adequados para a administração direta na vivoe pode facilitar a liberação sustentada de encapsulados de citocinas ou fatores solúveis para aumentar a ativação de célula T7,8.
Além da presença de proteínas de sinal necessário, engajamento do receptor sobre uma superfície suficientemente grande durante a interação de célula aAPC/T é essencial para a ativação de células T. Assim, os parâmetros físicos da aAPC como tamanho e forma drasticamente alteram sua área de contato disponível e afetam sua capacidade de estimular células T. AAPC micro-empresas foram mostrados para ser mais eficaz em estimular as células T do que suas contrapartes de nanoescala9,10. No entanto, nano-aAPC pode ter biodistribuição superior e melhor drenagem para os linfonodos que pode melhorar seu desempenho na vivo sobre micro-aAPC11. A forma é outra variável de interesse em sistemas baseados em partículas aAPC. AAPC anisotrópica recentemente foram mostrados para ser mais eficaz do que partículas isotrópicas a estimular as células T, principalmente devido à interação aprimorada com células alvo juntamente com absorção reduzida celular específico. Células ligam preferencialmente ao eixo longo de partículas elipsoidais, e o maior raio de curvatura e superfície mais plana que permitem mais contato entre a aAPC e células T12. O longo eixo das partículas elipsoidais também desencoraja a fagocitose, resultando em aumento da circulação de tempo em comparação com as partículas esféricas em vivo administração12,13a seguir. Devido a estas vantagens, partículas elipsoidais mediam a maior expansão do antígeno-específicas T células in vitro e em vivo em comparação com as partículas esféricas, um efeito observado em ambos os micro e nanoscales12, 13. Existem várias estratégias para fabricar partículas anisotrópicas, mas alongamento de película fina é um método simples, amplamente aceitado, usado para gerar uma gama de partículas diversas formas14. Após a síntese, partículas são lançadas filmes e esticadas em uma ou duas dimensões, a uma temperatura acima da temperatura de transição vítrea do material das partículas. O filme é então dissolvido para recuperar as partículas. Apesar do crescente interesse em partículas anisotrópicas, abordagens atuais para fabricação baseada em partículas aAPC limitam-se principalmente aos sistemas isotrópicos, e métodos de alterar a forma das partículas podem ser difícil de implementar, incompatível com certa síntese aAPC estratégias e falta de precisão e reprodutibilidade15. Nossa técnica de alongamento de película fina pode ser executada manualmente ou em um modo automatizado para gerar rapidamente partículas anisotrópicas sintetizadas a partir de uma variedade de polímeros biodegradáveis, esticada para uma proporção desejada em uma ou duas dimensões15.
Baseado no nosso trabalho anterior, desenvolvemos uma abordagem baseada em partículas biodegradável combinada com tecnologia de alongamento de thin-film escalável para gerar rapidamente aAPC com tamanho ajustável e a forma de uma forma padronizada para células T expansão ex vivo ou em vivo. Nossa estratégia de conjugação de proteínas pode ser usada para acoplar qualquer somáticas de interesse aos grupos da carboxila na superfície da partícula em uma densidade desejada, dando a este sistema de aAPC um alto grau de flexibilidade. Descrevemos também métodos para caracterizar o tamanho, morfologia e teor de aAPC de proteínas de superfície e para avaliar sua funcionalidade em vitro. Este protocolo pode ser facilmente adaptado para expandir as células imunes ex vivo ou na vivo para uma variedade de aplicações de imunoterapia.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Poly(vinyl alcohol), MW 25000, 88% hydrolyzed</td>
			<td>Polysciences, Inc.</td>
			<td>02975-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Thermometer</td>
			<td>Fluke</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Model name: Fluke 52 II</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersion Temperature Probe</td>
			<td>Fluke</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Model name: Fluke 80PK 22</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Hotplate &#38; Stirrer</td>
			<td>Benchmark Scientific</td>
			<td>H3760-HS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multipoint stirrer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>50093538</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Resomer RG 504 H, Poly(D,L-lactide-co-glycolide)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>719900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichloromethane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D65100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homogenizer</td>
			<td>IKA</td>
			<td>&#160;0003725001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>Sonics &#38; Materials, Inc.</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Model number: VC 505</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator sound abating enclosure</td>
			<td>Sonics &#38; Materials, Inc.</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Part number: 630-0427</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator probe</td>
			<td>Sonics &#38; Materials, Inc.</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Part number: 630-0220</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator microtip</td>
			<td>Sonics &#38; Materials, Inc.</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Part number: 630-0423</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High speed centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Model number: J-20XP (discontinued), alternative model: J-26XP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High speed centrifuge rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>369691</td>
			<td>Model number: JA-17</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High speed polycarbonate centrifuge tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>3118-0050</td>
			<td>50 mL, screw cap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rectangular disposable petri dish</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>25384-322</td>
			<td>75 x 50 x 10 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Square disposable petri dish</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>10799-140</td>
			<td>100 mm x 100 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LEAF&#160;Purified anti-mouse CD3&#949; Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>InVivoMab anti-mouse CD28, clone 37.51</td>
			<td>Bio X Cell</td>
			<td>BE0015-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-(3-Dimethylaminopropyl)-N&#8242;-ethylcarbodiimide hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E6383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Hydroxysulfosuccinimide sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>56485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3671</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 anti-mouse CD3 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-mouse CD28 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>102109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning&#160;96 Well Solid Polystyrene Microplate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS3915</td>
			<td>flat bottom, black polystyrene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein LoBind Tubes, 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22431081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Medium (+ L-Glutamine)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11875093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F4135</td>
			<td>Heat Inactivated, sterile-filtered</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ciprofloxacin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>17850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human IL-2 (carrier-free)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>589102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate (100 mM)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11360070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Vitamin Solution (100X)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11120052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD8a+&#160;T Cell Isolation Kit, mouse</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-104-075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>C34554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS Columns</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MidiMACS Separator</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-042-302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS Multistand</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-042-303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Cytometer</td>
			<td>Accuri C6</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synergy 2 Multi-Detection Microplate Reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>autoMACS Running Buffer</td>
			<td>Miltenyi BIotech</td>
			<td>130-091-221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>22363548</td>
			<td>Sterile, 70 &#181;m nylon mesh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACK Lysing Buffer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A1049201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6J (Black 6) Mouse</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>000664</td>
			<td>Male, at least 7 weeks old</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-Bottom Tissue Culture Plates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>353227</td>
			<td>Sterile, 96-well tissue culture treated polystyrene plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 V DC Power Supply</td>
			<td>Probotix</td>
			<td>LPSK-4010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE Coated Wire</td>
			<td>Mouser</td>
			<td>602-5858-100-01</td>
			<td>This is for a 100 ft. spool but an equivalent wire will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stepper Motor Driver</td>
			<td>Probotix</td>
			<td>MondoStep5.6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IDC Connector Kit</td>
			<td>Probotix</td>
			<td>IDCM-10-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcontroller</td>
			<td>Probotix</td>
			<td>PBX-RF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4A Fuses</td>
			<td>Radio Shack</td>
			<td>2701026</td>
			<td>Equivalent fuses will work as well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DB25 Male to Male Cable</td>
			<td>Probotix</td>
			<td>DB25-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USB-A to USB-B Cable</td>
			<td>Staples</td>
			<td>2094915</td>
			<td>Equivalent cable will work as well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-Pin Amphenol Connectors Male and Female</td>
			<td>Mouser</td>
			<td>654-97-3100A-20-7P and 654-97-3106A20-7S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stepper Motor</td>
			<td>Probotix</td>
			<td>HT23-420-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Right Hand Lead Screw</td>
			<td>Roton</td>
			<td>60722</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Left Hand Lead Screw</td>
			<td>Roton</td>
			<td>60723</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screws</td>
			<td>McMaster Carr</td>
			<td>92196A151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neoprene Rubber</td>
			<td>McMaster Carr</td>
			<td>8698K51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Right Handed Flanged Lead Nut</td>
			<td>Roton</td>
			<td>91962</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Left Handed Flanged Lead Nut</td>
			<td>Roton</td>
			<td>91963</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Linux Control Computer</td>
			<td>Probotix</td>
			<td>LCNC-PC</td>
			<td>Any computer with matching specification and Linux operating system will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning bottle-top vacuum filter system</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS431097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution, 0.4 %</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fabrication of anisotropic polymeric artificial antigen presenting cells for cd8+ t cell activation

Células de apresentação de antígeno artificial (aAPC) são uma plataforma promissora para modulação imune devido a sua potente capacidade de estimular células T. Substratos acelulares oferecem vantagens chaves sobre aAPC baseados em células, incluindo um controle preciso dos parâmetros de apresentação do sinal e propriedades físicas da superfície aAPC modular suas interações com as células T. aAPC, construída a partir de partículas anisotrópicas, partículas particularmente elipsoidais, foram mostrados para ser mais eficaz do que suas contrapartes esféricos para estimulantes células T devido ao aumento de vinculação e maior área de superfície disponível para a célula T entrar em contato, bem como como reduzida absorção inespecífica e reforçadas propriedades farmacocinéticas. Apesar do aumento do interesse em partículas anisotrópicas, ainda amplamente aceita métodos de geração de partículas anisotrópicas tais como alongamento de filme fino pode ser um desafio para implementar e usar reproducibly.
Para este fim, descrevemos um protocolo para a preparação rápida, padronizada de biodegradável aAPC anisotrópica baseada em partículas com tamanho ajustável, forma e sinal de apresentação para células T expansão ex vivo ou na vivo, juntamente com métodos para caracterizar o seu tamanho, morfologia e superfície teor de proteínas e para avaliar sua funcionalidade. Essa abordagem para fabricar aAPC anisotrópica é escalável e reprodutíveis, tornando-a ideal para a geração de aAPC para imunoterapias "prateleira".

Um esquema para a película fina 2D automatizado dispositivo de alongamento é dada na Figura 1. Um esquema e uma descrição para uma película fina de 1D, dispositivo de alongamento é dada na Ho et al.17 a maca é construída a partir de usando o padrão de moagem e de técnicas de usinagem de peças de alumínio. Semelhante a maca 1D, 2D maca consiste em apertos metálicos e trilhos de guia. Bidirecional de roscas são usadas para ...

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Fabrication of Anisotropic Polymeric Artificial Antigen Presenting Cells for CD8+ T Cell Activation

Aqui, apresentamos um protocolo para reproducibly e rapidamente gerar biologicamente inspirados, biodegradável articifical apresentadoras de células (aAPC) com tamanho ajustável, forma e apresentação de proteína de superfície de célula T expansão ex vivo ou in vivo .

Fabricação de anisotrópica poliméricas Artificial células apresentadoras para ativação de células T CD8 +

Artificial antigen presenting cells (aAPC) are a promising platform for immune modulation due to their potent ability to stimulate T cells. Acellular ...

Este método pode ajudar a responder perguntas-chave no campo da aminoengenharia. Como, qual é o papel das propriedades físicas de partículas nas interações e ativação de células imunes biomaterial. A principal vantagem desta técnica é que ela permite um controle independente do tamanho e forma das partículas biomiméticas.As implicações dessa técnica se estendem para a terapia do câncer, pois é uma terapia de partículas fora da prateleira que pode causar respostas imunes mediadas por células in vivo. Embora este método possa fornecer insights sobre a aminoterapia do câncer, ele também pode ser aplicado a outros sistemas. Como, doença infecciosa ou diabetes tipo Um.Para a síntese de micropartículas, comece pesando 100 miligramas de poli (ácido cótico-coglicólico)ou PLGA, em um frasco de cintilação e dissolvendo o PLGA em cinco mililitros de diclorometano por vórtice. Coloque um homogeneizador em um béquer contendo 50 mililitros de 1%de álcool polivinyl, ou solução PVA, de modo que o homogeneizador esteja o mais próximo possível do fundo do béquer sem tocá-lo. Ligue o homogeneizador à velocidade apropriada e adicione a solução PLGA ao béquer por um minuto de homogeneização.Ao final da homogeneização, despeje a solução de micropartículas PLGA de álcool polivinyl em um béquer contendo 100 mililitros de solução de 5%PVA em uma placa de mexida em uma capa química e mexa a solução por pelo menos quatro horas. Quando o solvente evaporar, despeje a solução de partículas em tubos cônicos de 50 mililitros e colete as partículas por centrifugação. Substitua o supernasal em cada tubo por 20 mililitros de água desionizada e suspenda as partículas por vórtice.Em seguida, traga o volume final em cada tubo até 50 mililitros com água desionizada fresca e lave as partículas mais duas vezes como apenas demonstrado. Para a síntese de nanopartículas, dissolva 200 miligramas de PLGA em cinco mililitros de diclorometano e coloque uma sonda sonicator em um béquer contendo 50 mililitros de solução de 1%PVA no gelo sem tocar no fundo do béquer. Inicie a sônica em 12 watts e adicione imediatamente a solução PLGA ao béquer por uma sônica de dois minutos para gerar nanopartículas com aproximadamente 200 nanômetros de diâmetro.Após a sônicação, despeje a solução de nanopartículas PLGA de 1%polivinyl em um béquer contendo 100 mililitros de solução de 5 PVA em uma placa de agitação durante quatro horas de evaporação de solvente em um capô de fumaça química. Quando todo o solvente for evaporado, despeje a solução de partículas em tubos cônicos de 50 mililitros para centrifugação para remover quaisquer micropartículas e remover os sobrenantes. Em seguida, transfira as nanopartículas em tubos de centrífugas de alta velocidade para três lavagens em água desionizada como demonstrado.Para a fabricação de partículas poliméricas, após a última lavagem, suspenda as partículas em aproximadamente um mililitro de água desionizada fresca e adicione a solução de fundição de filme às partículas a uma concentração final de 2,5 miligramas por partículas mililitros. Transfira a suspensão de partículas em alíquotas de 10 mililitros em placas de Petri retangulares de 75 por 50 milímetros para alongamento unidimensional. Ou em alíquotas de 15 mililitros em 100 por 100 milímetros quadrados placas de Petri para alongamento bidimensional.Depois de secar durante a noite em um capô químico, use pinças para remover os filmes e corte as bordas com uma tesoura. Para alongamento 1D, coloque as duas bordas curtas de uma película entre duas peças de borracha neoprene para montagem nos blocos de alumínio de um eixo de um dispositivo automatizado de alongamento de filme fino. Em seguida, use uma chave Allen para ferrar as garras metálicas em cima da borracha para manter o filme no lugar.Para alongamento 2D, monte todas as quatro bordas em quatro blocos de alumínio para esticar a película em ambos os eixos e regissue o comprimento da película entre os blocos de alumínio em um eixo para um alongamento D ou ambos os eixos para alongamento 2D e calcule a distância necessária para esticar o filme em uma ou duas direções com base no trecho da dobra desejada. Em seguida, coloque o dispositivo de alongamento carregado em um forno a 90 graus Celsius ao lado de um béquer maior de uma pequena quantidade de água para levar o filme à temperatura acima de 10 minutos. Quando o alongamento estiver completo, deixe o filme esfriar à temperatura ambiente por 20 minutos.Para alongamento 1D, corte o filme do dispositivo de alongamento nas bordas. Para alongamento 2D, corte e salve o quadrado central do filme que é uniformemente estendido em ambos os eixos. Coloque os filmes em tubos cônicos de 50 mililitros com não mais do que dois filmes por tubo e adicione aproximadamente 25 mililitros de água desionizada a cada tubo para vórtice.Quando os filmes se dissolverem, lave as partículas três vezes em água desionizada como demonstrado. Re-suspendendo as partículas em aproximadamente um mililitro de água desionizada fresca por tubo após a última lavagem. Em seguida, congele as partículas a menos 80 graus Celsius durante uma hora ou lyofilização durante a noite.Na manhã seguinte, suspenda a micro ou nanopartículas liofilizadas a 20 miligramas por mililitro em um buffer MES recém-preparado com vórtice. Adicione 100 microliters da solução de partículas a um tubo de micro centrífuga de micropropileno contendo 900 microliters de buffer MES e adicione 100 microliters de solução EDC NHS recém-preparada. Misture as partículas por vórtice e incuba as partículas em um inversor à temperatura ambiente por 30 minutos.No final da incubação, colete as partículas por centrifugação e suspenda as pelotas de micropartículas em um mililitro de PBS por vórtice ou suspenda as nanopartículas em um mililitro de PBS por cinco segundos de sônica em dois a três watts. Em seguida, adicione oito microgramas de um sinal adequado uma proteína e 10 microgramas de anticorpos CD28 anti-rato às micropartículas, ou 16 microgramas do sinal de uma proteína e 20 microgramas de CD28 anti-rato para as nanopartículas. Leve o volume final em cada tubo para 1,1 mililitro com PBS e incubar as partículas durante a noite em um inversor a quatro graus Celsius.No dia seguinte, lave as partículas três vezes em água desionizada como demonstrado. Estas nano e micropartículas PLGA foram sintetizadas usando as técnicas únicas de emulsão, como demonstrado e imageado usando a microscopia eletrônica de transmissão e varredura. Após a homogeneização, as micropartículas demonstraram um diâmetro médio de cerca de três micrômetros.As micropartículas esféricas tinham uma ração de aspecto de cerca de uma, enquanto as partículas elipsoidais esticadas em 1D tinham uma proporção maior de cerca de três e meio e as partículas elipsoidais esticadas em 2D tinham uma proporção de cerca de 1,2, aproximadamente mantendo uma proporção de uma. Os resultados da eficiência conjugal revelam as quantidades similares de proteína na superfície do antígeno microaroidal esférico e elipsoidal que apresenta células, ou AAPC e nano-AAPC, demonstrando que o acoplamento de proteínas durante a síntese da AAPC ocorre de forma dependente da concentração. A AAPC prolate elipsoidal foi encontrada para induzir níveis mais elevados de proliferação de células T em doses subsaturantes do que a AAPC esférica com a melhor separação alcançada em uma dose de 01 miligramas.Após sete dias, a contagem manual das células T revelou que a AAPC elipsoidal prolate estimula mais eficazmente as células T em comparação com suas contrapartes esféricas na micro e nano escala de uma maneira dependente de dose. Após este procedimento, a AAPC pode ser administrada in vivo para medir sua eficácia terapêutica e farmacocinética. Após seu desenvolvimento, essa técnica ajudou a pavimentar o caminho para pesquisadores da área de imunoengenharia explorarem o efeito da anisotropia na eficácia da AAPC.

Research

JoVE Journal

Environment

Mass Production of Genetically Modified Aedes aegypti for Field Releases in Brazil

Mass Production of Genetically Modified Aedes aegypti for Field Releases in Brazil

Produção em massa de Aedes aegypti geneticamente modificado para lançamentos de campo no Brasil

New techniques and methods are being sought to try to win the battle against mosquitoes. Recent advances in molecular techniques have led to the ...

Ambiente

Measuring Fluxes of Mineral Nutrients and Toxicants in Plants with Radioactive Tracers

Medindo Fluxos de nutrientes minerais e substâncias tóxicas em plantas com Traçadores Radioativos

Unidirectional influx and efflux of nutrients and toxicants, and their resultant net fluxes, are central to the nutrition and toxicology of plants. ...

A Whole Cell Bioreporter Approach to Assess Transport and Bioavailability of Organic Contaminants in Water Unsaturated Systems

Uma Abordagem Bioreporter celular todo avalie Transportes e biodisponibilidade de contaminantes orgânicos em água insaturadas Sistemas

Bioavailability of contaminants is a prerequisite for their effective biodegradation in soil. The average bulk concentration of a contaminant, however, is ...

Use of Chironomidae (Diptera) Surface-Floating Pupal Exuviae as a Rapid Bioassessment Protocol for Water Bodies

Use of Chironomidae Diptera Surface-Floating Pupal Exuviae as a Rapid Bioassessment Protocol for Water Bodies

Uso de Chironomidae (Diptera) Pupal Exuviae como um Bioavaliação Protocolo Rápido para massas de água de superfície flutuante

Rapid bioassessment protocols using benthic macroinvertebrate assemblages have been successfully used to assess human impacts on water quality. ...

Extraction of Structural Extracellular Polymeric Substances from Aerobic Granular Sludge

Extracção de substâncias estrutural extracelular poliméricos de Aerobic Granular Sludge

To evaluate and develop methodologies for the extraction of gel-forming extracellular polymeric substances (EPS), EPS from aerobic granular sludge (AGS) ...

Functionalization and Dispersion of Carbon Nanomaterials Using an Environmentally Friendly Ultrasonicated Ozonolysis Process

Funcionalidade e Dispersão de Nanomateriais de Carbono Usando um Processo de Ozonólise Ultrasonicada Ambientalmente Amigável

Functionalization of carbon nanomaterials is often a critical step that facilitates their integration into larger material systems and devices. In the ...

Ecosystem Fabrication (EcoFAB) Protocols for The Construction of Laboratory Ecosystems Designed to Study Plant-microbe Interactions

Ecosystem Fabrication EcoFAB Protocols for The Construction of Laboratory Ecosystems Designed to Study Plant-microbe Interactions

Protocolos de fabricação (EcoFAB) ecossistema para a construção de ecossistemas de laboratório projetado para estudar interações planta-micróbio

Beneficial plant-microbe interactions offer a sustainable biological solution with the potential to boost low-input food and bioenergy production. A ...

A Strain Gauge Monitor (SGM) for Continuous Valve Gape Measurements in Bivalve Molluscs in Response to Laboratory Induced Diel-cycling Hypoxia and pH

A Strain Gauge Monitor SGM for Continuous Valve Gape Measurements in Bivalve Molluscs in Response to Laboratory Induced Diel-cycling Hypoxia and pH

Um Monitor de Strain Gauge (SGM) para válvula contínua Gape medições em moluscos bivalves em resposta à hipóxia laboratório induzido Diel-ciclismo e pH

An inexpensive, laboratory-based, strain gauge valve gape monitor (SGM) was developed to monitor the valve gape behavior of bivalve molluscs in response ...

Bioindication Testing of Stream Environment Suitability for Young Freshwater Pearl Mussels Using In Situ Exposure Methods

Bioindication Testing of Stream Environment Suitability for Young Freshwater Pearl Mussels Using In Situ Exposure Methods

Bioindicação teste de adequação de ambiente de fluxo para jovens de água doce da pérola mexilhões usando métodos de exposição em Situ

Knowledge of habitat suitability for freshwater mussels is an important step in the conservation of this endangered species group. We describe a protocol ...

Cultivation of Green Microalgae in Bubble Column Photobioreactors and an Assay for Neutral Lipids

Cultivo de microalgas verdes em fotobiorreatores coluna de bolha e um ensaio para lípidos neutros

There is significant interest in the study of microalgae for engineering applications such as the production of biofuels, high value products, and for the ...