Name: fabrication of anisotropic polymeric artificial antigen presenting cells for cd8+ t cell activation
Uploaded: 2018-10-12T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fabrication of Anisotropic Polymeric Artificial Antigen Presenting Cells for CD8+ T Cell Activation at JoVE.com

ВКО (DGE-1746891) и KRR (DGE-1232825) Спасибо программа NSF исследовательских стипендий для поддержки. Оперативной памяти благодаря национальной исследовательской службы премии NIH NCI F31 (F31CA214147) и достижение награды для стипендий коллежа ученых для поддержки. Авторы благодарят NIH (R01EB016721 и R01CA195503), исследования, чтобы предотвратить слепоту Джеймс и Кэрол бесплатно Катализатор премии и Институт УДХ Bloomberg-Kimmel рака иммунотерапия для поддержки.

Все методы, описанные здесь были одобрены институциональный уход животных и использование Комитет (IACUC) из университета Джона Хопкинса.
1. Изготовление PLGA сферических частиц размером перестраиваемый
<ol><li>Подготовка материалов для синтеза частиц<ol>
<li>Готовят раствор 5% w/w...

<ol>
	<li>Eggermont, L. J., Paulis, L. E., Tel, J., Figdor, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+efficient+cancer+immunotherapy:+Advances+in+developing+artificial+antigen-presenting+cells.">Towards efficient cancer immunotherapy: Advances in developing artificial antigen-presenting cells.</a> Trends in Biotechnology. 32 (9), 456-465 (2014).</li><li>Maus, M. V., Riley, J. L., Kwok, W. W., Nepom, G. T., June, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HLA+tetramer-based+artificial+antigen-presenting+cells+for+stimulation+of+CD4++T+cells.">HLA tetramer-based artificial antigen-presenting cells for stimulation of CD4+ T cells.</a> Clinical Immunology. 106 (1), 16-22 (2003).</li><li>Oelke, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+induction+and+expansion+of+antigen-specific+cytotoxic+T+cells+by+HLA-Ig-coated+artificial+antigen-presenting+cells.">Ex vivo induction and expansion of antigen-specific cytotoxic T cells by HLA-Ig-coated artificial antigen-presenting cells.</a> Nature Medicine. 9 (5), 619-624 (2003).</li><li>Rudolf, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potent+costimulation+of+human+CD8+T+cells+by+anti-4-1BB+and+anti-CD28+on+synthetic+artificial+antigen+presenting+cells.">Potent costimulation of human CD8 T cells by anti-4-1BB and anti-CD28 on synthetic artificial antigen presenting cells.</a> Cancer Immunology, Immunotherapy. 57 (2), 175-183 (2008).</li><li>Tham, E. L., Jensen, P. L., Mescher, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+antigen-specific+T+cells+by+artificial+cell+constructs+having+immobilized+multimeric+peptide-class+I+complexes+and+recombinant+B7-Fc+proteins.">Activation of antigen-specific T cells by artificial cell constructs having immobilized multimeric peptide-class I complexes and recombinant B7-Fc proteins.</a> Journal of Immunological Methods. 249 (1-2), 111-119 (2001).</li><li>Perica, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+field-induced+T+cell+receptor+clustering+by+nanoparticles+enhances+T+cell+activation+and+stimulates+antitumor+activity.">Magnetic field-induced T cell receptor clustering by nanoparticles enhances T cell activation and stimulates antitumor activity.</a> ACS Nano. 8 (3), 2252-2260 (2014).</li><li>Steenblock, E. R., Fadel, T., Labowsky, M., Pober, J. S., Fahmy, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+artificial+antigen-presenting+cell+with+paracrine+delivery+of+IL-2+impacts+the+magnitude+and+direction+of+the+T+cell+response.">An artificial antigen-presenting cell with paracrine delivery of IL-2 impacts the magnitude and direction of the T cell response.</a> The Journal of Biological Chemistry. 286 (40), 34883-34892 (2011).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paracrine+release+of+IL-2+and+anti-CTLA-4+enhances+the+ability+of+artificial+polymer+antigen-presenting+cells+to+expand+antigen-specific+T+cells+and+inhibit+tumor+growth+in+a+mouse+model.">Paracrine release of IL-2 and anti-CTLA-4 enhances the ability of artificial polymer antigen-presenting cells to expand antigen-specific T cells and inhibit tumor growth in a mouse model.</a> Cancer Immunology, Immunotherapy. 66 (9), 1229-1241 (2017).</li><li>Mescher, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+contact+requirements+for+activation+of+cytotoxic+T+lymphocytes.">Surface contact requirements for activation of cytotoxic T lymphocytes.</a> The Journal of Immunology. 149 (7), 2402-2405 (1992).</li><li>Steenblock, E. R., Fahmy, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+platform+for+ex+vivo+T-cell+expansion+based+on+biodegradable+polymeric+artificial+antigen-presenting+cells.">A comprehensive platform for ex vivo T-cell expansion based on biodegradable polymeric artificial antigen-presenting cells.</a> Molecular Therapy. 16 (4), 765-772 (2008).</li><li>Fifis, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size-dependent+immunogenicity:+therapeutic+and+protective+properties+of+nano-vaccines+against+tumors.">Size-dependent immunogenicity: therapeutic and protective properties of nano-vaccines against tumors.</a> The Journal of Immunology. 173 (5), 3148-3154 (2004).</li><li>Sunshine, J. C., Perica, K., Schneck, J. P., Green, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Particle+shape+dependence+of+CD8++T+cell+activation+by+artificial+antigen+presenting+cells.">Particle shape dependence of CD8+ T cell activation by artificial antigen presenting cells.</a> Biomaterials. 35 (1), 269-277 (2014).</li><li>Meyer, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biodegradable+nanoellipsoidal+artificial+antigen+presenting+cells+for+antigen+specific+T-cell+activation.">Biodegradable nanoellipsoidal artificial antigen presenting cells for antigen specific T-cell activation.</a> Small. 11 (13), 1519-1525 (2015).</li><li>Champion, J. A., Katare, Y. K., Mitragotri, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Particle+shape:+a+new+design+parameter+for+micro-+and+nanoscale+drug+delivery+carriers.">Particle shape: a new design parameter for micro- and nanoscale drug delivery carriers.</a> Journal of Controlled Release. 121 (1-2), 3-9 (2007).</li><li>Meyer, R. A., Meyer, R. S., Green, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+automated+multidimensional+thin+film+stretching+device+for+the+generation+of+anisotropic+polymeric+micro-+and+nanoparticles.">An automated multidimensional thin film stretching device for the generation of anisotropic polymeric micro- and nanoparticles.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 103 (8), 2747-2757 (2015).</li><li>Ho, C. C., Keller, A., Odell, J. A., Ottewill, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+monodisperse+ellipsoidal+polystyrene+particles.">Preparation of monodisperse ellipsoidal polystyrene particles.</a> Colloid and Polymer Science. 271 (5), 469-479 (1993).</li><li>Shum, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet+microfluidics+for+fabrication+of+non-spherical+particles.">Droplet microfluidics for fabrication of non-spherical particles.</a> Macromolecular Rapid Communications. 31 (2), 108-118 (2010).</li><li>Lan, W., Li, S., Xu, J., Luo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controllable+preparation+of+nanoparticle-coated+chitosan+microspheres+in+a+co-axial+microfluidic+device.">Controllable preparation of nanoparticle-coated chitosan microspheres in a co-axial microfluidic device.</a> Lab on a Chip. 11 (4), 652-657 (2011).</li><li>Yang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+synthesis+of+multifunctional+Janus+particles+for+biomedical+applications.">Microfluidic synthesis of multifunctional Janus particles for biomedical applications.</a> Lab on a Chip. 12 (12), 2097-2102 (2012).</li><li>Zhou, Z., Anselmo, A. C., Mitragotri, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+protein-based,+rod-shaped+particles+from+spherical+templates+using+layer-by-layer+assembly.">Synthesis of protein-based, rod-shaped particles from spherical templates using layer-by-layer assembly.</a> Advanced Materials. 25 (19), 2723-2727 (2013).</li><li>Jang, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Striped,+ellipsoidal+particles+by+controlled+assembly+of+diblock+copolymers.">Striped, ellipsoidal particles by controlled assembly of diblock copolymers.</a> Journal of the American Chemical Society. 135 (17), 6649-6657 (2013).</li><li>Petzetakis, N., Dove, A. P., O'Reilly, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cylindrical+micelles+from+the+living+crystallization-driven+self-assembly+of+poly(lactide)-containing+block+copolymers.">Cylindrical micelles from the living crystallization-driven self-assembly of poly(lactide)-containing block copolymers.</a> Chemical Science. 2 (5), 955-960 (2011).</li><li>Rolland, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+fabrication+and+harvesting+of+monodisperse,+shape-specific+nanobiomaterials.">Direct fabrication and harvesting of monodisperse, shape-specific nanobiomaterials.</a> Journal of the American Chemical Society. 127 (28), 10096-10100 (2005).</li><li>Meyer, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anisotropic+biodegradable+lipid+coated+particles+for+spatially+dynamic+protein+presentation.">Anisotropic biodegradable lipid coated particles for spatially dynamic protein presentation.</a> Acta Biomaterialia. 72, 228-238 (2018).</li></ol>

Этот протокол подробности универсальным методом для точного поколения анизотропной полимерных частиц. Тонкая пленка, растяжения техники, описанные здесь, масштабируемые, воспроизводимые и недорогой. Альтернативные методы для генерации анизотропной частицы страдают от многих ограни...

Искусственные антиген представляющих клеток (aAPC) показали обещание как иммуномодулирующих агентов, потому что они могут генерировать ответ надежные антиген специфические Т-клеток. Важное значение для этих платформ являются их способность эффективно представит решающую сигналов для активации Т-клеток. Бесклеточной aAPC являются привлекательной альтернативой на основе ячеек aAPC, потому что они легче и дешевле в изготовлении, сталкиваются с меньшими проблемами во время масштабирования и перевод и смягчить риски, связанные с лечения на основе ячеек. Бесклеточной aAPC также обеспечить высокую степень контроля над представления параметров сигнала и физические свойства поверхности, которая будет взаимодействовать с клетками T1.
aAPC должны охарактеризовать как минимум двух сигналов, необходимых для активации Т-клеток. Сигнал 1 обеспечивает антигены и происходит, когда Т-клеточных рецепторов (TCR) признает и осуществляет взаимодействие с MHC класса I или II, с учетом его родственных антигена, кульминацией сигнализации через TCR комплекс. Чтобы обойти требование конкретизации антигена, aAPC систем часто несут агонистических моноклональные антитела против CD3-рецептор, который nonspecifically стимулирует TCR комплекс. Рекомбинантные формы MHC, особенно MHC мультимеры, также используются на поверхности aAPC предоставлять антигена специфика2,3. Сигнал 2 это костимуляторных сигнал, который направляет деятельность Т-клеток. Предоставлять костимуляции, необходимые для активации клеток T, рецептор CD28 обычно стимулируется с агонистических антитела представлены на поверхности aAPC, хотя другие костимуляторных рецепторов, таких как 4-1BB были успешно целевых4. Сигнал 1 и 2 белки обычно лишенных подвижности на поверхности жестких частиц синтезировать aAPC. Исторически aAPC были изготовлены из различных материалов, в том числе полистирола4,5 и Железо декстран6. Новые системы используют биоразлагаемые полимеры как поли (молочно co гликолевая кислота) (PLGA) для создания aAPC, который может легко сочетаться сигнал белки, подходят для прямого управления в естественных условияхи могут облегчить стабильного выпуска инкапсулированные цитокинов или растворимых факторов для расширения Т-клеток активации7,8.
В дополнение к наличие необходимых сигналов белков рецептор взаимодействие через достаточно большой площади поверхности во время взаимодействия клеток aAPC/T имеет важное значение для активации клеток T. Таким образом физические параметры aAPC, такие как размер и форма резко изменить их доступных площадь контакта и влияет на их способность стимулировать клетки T. Микронных размеров aAPC показали должна быть более эффективной в стимулировании Т-клеток, чем их коллеги наноразмерных9,10. Однако нано aAPC может иметь Улучшенный накопление и лучше дренаж на лимфатические узлы, которые могут повысить их производительность в vivo над микро aAPC11. Форма является другой переменной интерес в системах на основе частиц aAPC. Анизотропные aAPC недавно было показано, быть более эффективным, чем изотропной частиц на стимулирование Т-клеток, главным образом благодаря укреплению взаимодействия с сочетании с снижение неспецифической клеток поглощения клеток-мишеней. Клетки преференциально связывают к длинной оси эллипсоидальными частицами, и больший радиус кривизны и плоской поверхности позволяют больше контакта между aAPC и12Т-клеток. Длинная ось эллипсоидальными частицами также препятствует фагоцитоза, что приводит к времени увеличенная циркуляция, по сравнению с сферических частиц, следуя в естественных условиях администрации12,13. Учитывая все эти преимущества эллипсоидальными частицами посредником большее расширение антиген специфические T клетки в пробирке и в естественных условиях по сравнению с сферических частиц, эффект наблюдается как микро, так и nanoscales12, 13. Существуют различные стратегии для изготовления анизотропной частицы, но тонкопленочных растяжения является простым, широко признанным метод, используемый для создания целого ряда различных частиц формы14. После синтеза частицы брошен в фильмах и растягивается в одном или двух измерениях при температуре выше температуры стеклования частиц материала. Затем фильм растворяется для извлечения частиц. Несмотря на растущий интерес к анизотропной частиц, текущие подходы для изготовления на основе частиц aAPC в основном ограничиваются изотропной систем и методы изменения формы частиц может быть трудно осуществить, несовместимые с определенным aAPC синтез стратегии и отсутствие точности и воспроизводимости15. Нашу технику растяжения тонкопленочных может быть выполнена вручную или в автоматическом режиме быстро сформировать анизотропной частицы, синтезированных из целого ряда биоразлагаемых полимеров, растягивается до желаемой пропорции в один или два размеры15.
Основываясь на нашей предыдущей работы, мы разработали биологически подход на основе частиц, в сочетании с масштабируемой растяжения тонкопленочной технологии быстро генерировать aAPC с перестраиваемой размер и форму в стандартизованном виде для Т-клеток расширения ex vivo или в VIVO. Наша стратегия спряжение белка может использоваться для пара любые белки интерес к карбоксильных групп на поверхности частиц на желаемой плотности, давая этой системы aAPC высокую степень гибкости. Мы также описывают методы характеризуют размер, морфология и поверхностных белков содержание aAPC и оценить их функциональность в пробирке. Этот протокол может быть легко адаптирована для расширения иммунные клетки ex vivo или в естественных условиях для различных иммунотерапевтических приложений.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Poly(vinyl alcohol), MW 25000, 88% hydrolyzed</td>
			<td>Polysciences, Inc.</td>
			<td>02975-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Thermometer</td>
			<td>Fluke</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Model name: Fluke 52 II</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersion Temperature Probe</td>
			<td>Fluke</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Model name: Fluke 80PK 22</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Hotplate &#38; Stirrer</td>
			<td>Benchmark Scientific</td>
			<td>H3760-HS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multipoint stirrer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>50093538</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Resomer RG 504 H, Poly(D,L-lactide-co-glycolide)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>719900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichloromethane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D65100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homogenizer</td>
			<td>IKA</td>
			<td>&#160;0003725001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>Sonics &#38; Materials, Inc.</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Model number: VC 505</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator sound abating enclosure</td>
			<td>Sonics &#38; Materials, Inc.</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Part number: 630-0427</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator probe</td>
			<td>Sonics &#38; Materials, Inc.</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Part number: 630-0220</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator microtip</td>
			<td>Sonics &#38; Materials, Inc.</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Part number: 630-0423</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High speed centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Model number: J-20XP (discontinued), alternative model: J-26XP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High speed centrifuge rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>369691</td>
			<td>Model number: JA-17</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High speed polycarbonate centrifuge tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>3118-0050</td>
			<td>50 mL, screw cap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rectangular disposable petri dish</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>25384-322</td>
			<td>75 x 50 x 10 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Square disposable petri dish</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>10799-140</td>
			<td>100 mm x 100 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LEAF&#160;Purified anti-mouse CD3&#949; Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>InVivoMab anti-mouse CD28, clone 37.51</td>
			<td>Bio X Cell</td>
			<td>BE0015-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-(3-Dimethylaminopropyl)-N&#8242;-ethylcarbodiimide hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E6383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Hydroxysulfosuccinimide sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>56485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3671</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 anti-mouse CD3 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-mouse CD28 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>102109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning&#160;96 Well Solid Polystyrene Microplate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS3915</td>
			<td>flat bottom, black polystyrene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein LoBind Tubes, 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22431081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Medium (+ L-Glutamine)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11875093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F4135</td>
			<td>Heat Inactivated, sterile-filtered</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ciprofloxacin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>17850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human IL-2 (carrier-free)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>589102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate (100 mM)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11360070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Vitamin Solution (100X)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11120052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD8a+&#160;T Cell Isolation Kit, mouse</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-104-075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>C34554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS Columns</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MidiMACS Separator</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-042-302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS Multistand</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-042-303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Cytometer</td>
			<td>Accuri C6</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synergy 2 Multi-Detection Microplate Reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>autoMACS Running Buffer</td>
			<td>Miltenyi BIotech</td>
			<td>130-091-221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>22363548</td>
			<td>Sterile, 70 &#181;m nylon mesh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACK Lysing Buffer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A1049201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6J (Black 6) Mouse</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>000664</td>
			<td>Male, at least 7 weeks old</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-Bottom Tissue Culture Plates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>353227</td>
			<td>Sterile, 96-well tissue culture treated polystyrene plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 V DC Power Supply</td>
			<td>Probotix</td>
			<td>LPSK-4010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE Coated Wire</td>
			<td>Mouser</td>
			<td>602-5858-100-01</td>
			<td>This is for a 100 ft. spool but an equivalent wire will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stepper Motor Driver</td>
			<td>Probotix</td>
			<td>MondoStep5.6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IDC Connector Kit</td>
			<td>Probotix</td>
			<td>IDCM-10-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcontroller</td>
			<td>Probotix</td>
			<td>PBX-RF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4A Fuses</td>
			<td>Radio Shack</td>
			<td>2701026</td>
			<td>Equivalent fuses will work as well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DB25 Male to Male Cable</td>
			<td>Probotix</td>
			<td>DB25-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USB-A to USB-B Cable</td>
			<td>Staples</td>
			<td>2094915</td>
			<td>Equivalent cable will work as well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-Pin Amphenol Connectors Male and Female</td>
			<td>Mouser</td>
			<td>654-97-3100A-20-7P and 654-97-3106A20-7S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stepper Motor</td>
			<td>Probotix</td>
			<td>HT23-420-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Right Hand Lead Screw</td>
			<td>Roton</td>
			<td>60722</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Left Hand Lead Screw</td>
			<td>Roton</td>
			<td>60723</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screws</td>
			<td>McMaster Carr</td>
			<td>92196A151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neoprene Rubber</td>
			<td>McMaster Carr</td>
			<td>8698K51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Right Handed Flanged Lead Nut</td>
			<td>Roton</td>
			<td>91962</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Left Handed Flanged Lead Nut</td>
			<td>Roton</td>
			<td>91963</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Linux Control Computer</td>
			<td>Probotix</td>
			<td>LCNC-PC</td>
			<td>Any computer with matching specification and Linux operating system will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning bottle-top vacuum filter system</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS431097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution, 0.4 %</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fabrication of anisotropic polymeric artificial antigen presenting cells for cd8+ t cell activation

Искусственные антиген представляющих клеток (aAPC) являются перспективной платформой для иммунной модуляции вследствие их мощной способностью стимулировать Т-клеток. Бесклеточной субстратов предлагают ключевые преимущества над на основе ячеек aAPC, включая точный контроль параметров сигнала презентации и физические свойства поверхности aAPC чтобы модулировать его взаимодействия с Т-клеток. aAPC построены из анизотропных частиц, особенно эллипсоидальными частицами, было показано, чтобы быть более эффективным, чем связаться с их сферических коллегами на стимулирование Т-клеток, за счет расширения привязки и больше площадь поверхности для Т-клеток, а также как снижение неспецифической поглощения и расширенной фармакокинетические свойства. Несмотря на повышенный интерес к анизотропной частиц даже широко методы генерации анизотропной частицы, такие как растяжения тонкопленочных может быть сложным для реализации и использования можно воспроизвести.
С этой целью мы описать протокол для быстрого, стандартизированные изготовления биологически анизотропной aAPC на основе частиц с перестраиваемой размер, форма и сигнал презентации для Т-клеток расширения ex vivo или в естественных условиях, а также методы для характеризовать их размер, морфология и поверхностных белков содержание и оценить их функциональность. Такой подход к фабрикации анизотропной aAPC является масштабируемой и воспроизводимости, что делает его идеальным для генерации aAPC для «стандартных» immunotherapies.

Схема для автоматизированного 2D тонкой пленки, растяжения устройство приводится на рисунке 1. Схема и описание для 1D тонкой пленки, растяжения устройство приводится в Хо et al.17 подрамника построен из алюминиевых деталей, используя стандарт?...

Watch this Scientific Journal Video about Fabrication of Anisotropic Polymeric Artificial Antigen Presenting Cells for CD8+ T Cell Activation at JoVE.com

Fabrication of Anisotropic Polymeric Artificial Antigen Presenting Cells for CD8+ T Cell Activation

Здесь мы представляем протокол для герметизации и быстро генерировать биологически вдохновил, биологически articifical антиген представляющих клеток (aAPC) с перестраиваемой размер, форму и представление поверхности белка для Т-клеток расширения ex vivo или в естественных условиях .

Изготовление анизотропной полимерного искусственного антиген представляющих клеток для CD8 + Т-клеток активации

Artificial antigen presenting cells (aAPC) are a promising platform for immune modulation due to their potent ability to stimulate T cells. Acellular ...

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области аминокислот. Например, какова роль физических свойств частиц в взаимодействии и активации биоматериалов иммунных клеток. Основным преимуществом этой техники является то, что она позволяет самостоятельно контролировать размер и форму биомиметических частиц.Последствия этого метода распространяются на терапию рака, как это с полки частицы терапии, которые могут вызвать in vivo клеток опосредовано иммунных реакций. Хотя этот метод может дать представление о раке аминокислоты, он также может быть применен к другим системам. Например, инфекционное заболевание или диабет 1-го типа.Для синтеза микрочастиц, начните с взвешивания 100 миллиграммов поли (молочно-когликолевая кислота) или PLGA, в сцинтилляционный флакон и растворения PLGA в пяти миллилитров дихлорметана вихрем. Поместите гомогенизатор в стакан, содержащий 50 миллилитров 1%поливиниловый спирт, или PVA раствор, так что гомогенизатор как можно ближе к нижней части стакана, как это возможно, не касаясь его. Включите гомогенизатор до соответствующей скорости и добавьте решение PLGA в стакан в течение одной минуты гомогенизации.В конце гомогенизации, залить поливиниловый спирт PLGA микрочастицы раствор в стакан, содержащий 100 миллилитров 5%PVA раствор на пластине перемешать в химическом капюшоне и перемешать раствор, по крайней мере четыре часа. Когда растворитель испарится, вылейте раствор частицы в 50 миллилитровых конических трубок и собирать частицы центрифугации. Замените супернатант в каждой трубке на 20 миллилитров деионизированной воды и повторно приостановив частицы вихрем.Затем довести окончательный объем в каждой трубке до 50 миллилитров со свежей деионизированной водой и мыть частицы еще в два раза, как только что продемонстрировали. Для синтеза наночастиц растворите 200 миллиграммов PLGA в пяти миллилитров дихлорметана и поместите зонд sonicator в стакан, содержащий 50 миллилитров раствора 1%PVA на льду, не касаясь дна стакана. Начните sonication на 12 ватт и немедленно добавьте разрешение PLGA к стакану на 2 минуты sonication для того чтобы произвести nano-частицы с приблизительно диаметром 200 nanometer.После sonication, залить 1%поливиниловый спирт PLGA наночастицы раствора в стакан, содержащий 100 миллилитров 5 PVA раствора на пластине перемешивания в течение четырех часов растворителя испарения в химическом капюшоне дыма. Когда весь растворитель испаряется, залить раствор частиц в 50 миллилитров конических труб для центрифугации, чтобы удалить любые микрочастицы и удалить супернатанты. Затем перенесите наночастицы в высокоскоростные центрифуги трубы для трех моет в деионизированной воде, как попродемонстрировано.Для изготовления полимерных частиц после последней стирки повторно приостанавливайте частицы примерно в миллилитр свежей деионизированной воды и добавляйте раствор литья пленки к частицам до конечной концентрации 2,5 миллиграмма на миллилитровые частицы. Перенесите суспензию частиц в 10 миллилитров алицитов в прямоугольные чашки Петри размером 75 на 50 миллиметров для одномерного растяжения. Или в 15 миллилитров aliquots в 100 на 100 миллиметров квадратных чашек Петри для двухмерного растяжения.После ночной сушки в химическом капюшоне используйте пинцет, чтобы удалить пленки и обрезать края ножницами. Для 1D растяжения, место два коротких края одной пленки между двумя кусками неопреновой резины для монтажа на алюминиевые блоки одной оси автоматизированной тонкой пленки растяжения устройства. Затем используйте гаечный ключ Аллена, чтобы винт металлические ручки на верхней части резины, чтобы держать пленку на месте.Для 2D растяжения, смонтировать все четыре края на четыре алюминиевых блоков, чтобы растянуть пленку на обоих осей измерения и записи длины пленки между алюминиевыми блоками на одной оси для одного D растяжения или обе оси для 2D растяжения и рассчитать расстояние, необходимое для растянуть пленку в одном или двух направлениях на основе желаемого раза стрейч. Затем поместите пленку загружен растяжения устройства в духовке при температуре 90 градусов по Цельсию рядом с большим стаканом небольшого количества воды, чтобы довести пленку до температуры в течение 10 минут. Когда растяжение завершено, дайте пленке остыть до комнатной температуры в течение 20 минут.Для 1D растяжения, вырезать пленку из растяжения устройства по краям. Для 2D растяжения, вырезать и сохранить центральный квадрат пленки, которая равномерно растягивается на обеих осях. Поместите пленки в 50 миллилитровых конических трубок с не более чем двумя пленками на трубку и добавьте приблизительно 25 миллилитров деионизированной воды к каждой трубке для вихря.Когда пленки растворились, мыть частицы три раза в деионизированной воде, как попродемонстрировано. Повторное приостановление частиц примерно в один миллилитр свежей деионизированной воды на трубку после последней стирки. Затем заморозить частицы при температуре минус 80 градусов по Цельсию в течение одного часа или на ночь лиофилизации.На следующее утро повторно приостанавливаем лиофильные микро- или наночастицы на уровне 20 миллиграммов на миллилитр в свежеприготовленном буфере МЕ СВЕ с вихрем. Добавьте 100 микролитров раствора частиц в полипропиленовую микроцентрифугу, содержащую 900 микролитров буфера МЭС, и добавьте 100 микролитров свежеприготовленного раствора EDC NHS. Смешайте частицы вихрем и инкубировать частицы на инверторе при комнатной температуре в течение 30 минут.В конце инкубации, собирать частицы центрифугации и повторно приостановить микрочастиц гранулы в один миллилитр PBS путем вихревого или повторно приостановить наночастицы в один миллилитр PBS на пять секунд sonication на два-три Вт. Далее добавьте восемь микрограммов подходящего сигнала один белок и 10 микрограммов антител антимышки CD28 к микрочастицам, или 16 микрограммов сигнала один белок и 20 микрограммов антимошейки CD28 к наночастицам. Довнесите окончательный объем в каждой трубке до 1,1 миллилитра с PBS и инкубировать частицы на ночь на инверторе при четырех градусах цельсия.На следующий день, мыть частицы три раза в деионизированной воде, как попродемонстрировано. Эти PLGA nano и микрочастицы были синтезированы с использованием методов единой эмульсии, как попродемонстрировано и изображено с помощью передачи и сканирования электронной микроскопии. После гомогенизации микрочастицы продемонстрировали средний диаметр около трех микрометров.Сферические микрочастицы имели рацион аспекта около одного, в то время как 1D растянутые эллипсоидные частицы имели большее соотношение аспектов приблизительно три с половиной, а 2D растянутые эллипсоидные частицы имели соотношение сторон около 1,2, примерно поддерживая соотношение сторон одного. Результаты конъюгации показывают аналогичное количество белка на поверхности сферических и эллипсоидных микро-искусственных антигенов, или AAPC и nano-AAPC, демонстрируя, что соединение белка во время синтеза AAPC происходит в зависимости от концентрации. Было установлено, что пролат эллипсоидный ААПЦ вызывает более высокие уровни пролиферации Т-клеток в субэсатурирующих дозах, чем сферический ААПЦ с лучшим разделением, достигнутым в дозе 01 миллиграмм.После семи дней, ручной подсчет Т-клеток показали, что пролат эллипсоидных AAPC более эффективно стимулировать Т-клеток по сравнению с их сферическими коллегами на микро-и нано масштаба в дозе зависимым образом. После этой процедуры, AAPC может управляться in vivo, чтобы оценить их терапевтическую эффективность и фармакокинетику. После его развития, этот метод помог проложить путь для исследователей в области иммуно-инженерии, чтобы исследовать влияние анисотропии на эффективность ААПЦ.

Research

JoVE Journal

Environment

Mass Production of Genetically Modified Aedes aegypti for Field Releases in Brazil

Mass Production of Genetically Modified Aedes aegypti for Field Releases in Brazil

Массовое производство генетически модифицированных Aedes aegypti для полевых релизов в Бразилии

New techniques and methods are being sought to try to win the battle against mosquitoes. Recent advances in molecular techniques have led to the ...

Measuring Fluxes of Mineral Nutrients and Toxicants in Plants with Radioactive Tracers

Измерение потоков минеральных питательных веществ и токсикантов в растениях с помощью радиоактивной метки

Unidirectional influx and efflux of nutrients and toxicants, and their resultant net fluxes, are central to the nutrition and toxicology of plants. ...

A Whole Cell Bioreporter Approach to Assess Transport and Bioavailability of Organic Contaminants in Water Unsaturated Systems

Всего сотовый Bioreporter подход к оценке переноса и биодоступности органических загрязнителей в ненасыщенных систем водоснабжения

Bioavailability of contaminants is a prerequisite for their effective biodegradation in soil. The average bulk concentration of a contaminant, however, is ...

Use of Chironomidae (Diptera) Surface-Floating Pupal Exuviae as a Rapid Bioassessment Protocol for Water Bodies

Use of Chironomidae Diptera Surface-Floating Pupal Exuviae as a Rapid Bioassessment Protocol for Water Bodies

Использование хирономид (Diptera), поверхностно-Плавающие куколки экзувии как Bioassessment протокола Rapid для водоемов

Rapid bioassessment protocols using benthic macroinvertebrate assemblages have been successfully used to assess human impacts on water quality. ...

Extraction of Structural Extracellular Polymeric Substances from Aerobic Granular Sludge

Добыча структурной внеклеточной полимерных веществ из аэробного Гранулированный Sludge

To evaluate and develop methodologies for the extraction of gel-forming extracellular polymeric substances (EPS), EPS from aerobic granular sludge (AGS) ...

Functionalization and Dispersion of Carbon Nanomaterials Using an Environmentally Friendly Ultrasonicated Ozonolysis Process

Функционализация и дисперсия углеродных наноматериалов с использованием экологически чистого ультразвукового процесса озонолиза

Functionalization of carbon nanomaterials is often a critical step that facilitates their integration into larger material systems and devices. In the ...

Ecosystem Fabrication (EcoFAB) Protocols for The Construction of Laboratory Ecosystems Designed to Study Plant-microbe Interactions

Ecosystem Fabrication EcoFAB Protocols for The Construction of Laboratory Ecosystems Designed to Study Plant-microbe Interactions

Экосистема изготовление (EcoFAB) протоколы для строительства лаборатории экосистем, предназначенных для изучения растений микробных взаимодействий

Beneficial plant-microbe interactions offer a sustainable biological solution with the potential to boost low-input food and bioenergy production. A ...

A Strain Gauge Monitor (SGM) for Continuous Valve Gape Measurements in Bivalve Molluscs in Response to Laboratory Induced Diel-cycling Hypoxia and pH

A Strain Gauge Monitor SGM for Continuous Valve Gape Measurements in Bivalve Molluscs in Response to Laboratory Induced Diel-cycling Hypoxia and pH

Тензометрический датчик монитора (СВП) для непрерывных измерений зияют клапан в двустворчатых моллюсков в ответ на Велоспорт Лаборатория индуцированного Diel гипоксии и рН

An inexpensive, laboratory-based, strain gauge valve gape monitor (SGM) was developed to monitor the valve gape behavior of bivalve molluscs in response ...

Bioindication Testing of Stream Environment Suitability for Young Freshwater Pearl Mussels Using In Situ Exposure Methods

Bioindication Testing of Stream Environment Suitability for Young Freshwater Pearl Mussels Using In Situ Exposure Methods

Биоиндикация тестирования потока среды пригодности для молодых пресноводных жемчужное мидии с использованием методов экспозиции в Situ

Knowledge of habitat suitability for freshwater mussels is an important step in the conservation of this endangered species group. We describe a protocol ...

Cultivation of Green Microalgae in Bubble Column Photobioreactors and an Assay for Neutral Lipids

Выращивание зеленых микроводорослей в фотобиореакторах колонки пузыря и Assay для нейтральные липиды

There is significant interest in the study of microalgae for engineering applications such as the production of biofuels, high value products, and for the ...