Name: fabrication of anisotropic polymeric artificial antigen presenting cells for cd8+ t cell activation
Uploaded: 2018-10-12T13:30:00
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EBA (DGE-1746891) y KRR (DGE-1232825) gracias al programa de beca de investigación postgrado NSF para apoyo. Memoria RAM gracias a la investigación nacional servicio Premio NIH NCI F31 (F31CA214147) y las recompensas del logro para colegio científicos becas de apoyo. Los autores agradecen los NIH (R01EB016721 y R01CA195503), la investigación para prevenir ceguera James y Carole gratis Premio de catalizador y el Instituto de Bloomberg-Kimmel JHU de inmunoterapia del cáncer para la ayuda.

Todos los métodos aquí descritos han sido aprobados por el institucional cuidado Animal y el Comité uso (IACUC) de la Universidad Johns Hopkins.
1. fabricación de partículas esféricas PLGA de tamaño ajustable
<ol><li>Preparación de materiales para la síntesis de partículas<ol>
<li>Preparar la solución al 5% p/p, alcohol de polivinilo (PVA).<ol>
<li>Añadir 500 mL de agua desionizada (DI) a un matraz de Erlenmeyer con una barra de agitación magnética y colocar en placa caliente a...

<ol>
	<li>Eggermont, L. J., Paulis, L. E., Tel, J., Figdor, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+efficient+cancer+immunotherapy:+Advances+in+developing+artificial+antigen-presenting+cells.">Towards efficient cancer immunotherapy: Advances in developing artificial antigen-presenting cells.</a> Trends in Biotechnology. 32 (9), 456-465 (2014).</li><li>Maus, M. V., Riley, J. L., Kwok, W. W., Nepom, G. T., June, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HLA+tetramer-based+artificial+antigen-presenting+cells+for+stimulation+of+CD4++T+cells.">HLA tetramer-based artificial antigen-presenting cells for stimulation of CD4+ T cells.</a> Clinical Immunology. 106 (1), 16-22 (2003).</li><li>Oelke, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+induction+and+expansion+of+antigen-specific+cytotoxic+T+cells+by+HLA-Ig-coated+artificial+antigen-presenting+cells.">Ex vivo induction and expansion of antigen-specific cytotoxic T cells by HLA-Ig-coated artificial antigen-presenting cells.</a> Nature Medicine. 9 (5), 619-624 (2003).</li><li>Rudolf, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potent+costimulation+of+human+CD8+T+cells+by+anti-4-1BB+and+anti-CD28+on+synthetic+artificial+antigen+presenting+cells.">Potent costimulation of human CD8 T cells by anti-4-1BB and anti-CD28 on synthetic artificial antigen presenting cells.</a> Cancer Immunology, Immunotherapy. 57 (2), 175-183 (2008).</li><li>Tham, E. L., Jensen, P. L., Mescher, M. 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R., Fadel, T., Labowsky, M., Pober, J. S., Fahmy, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+artificial+antigen-presenting+cell+with+paracrine+delivery+of+IL-2+impacts+the+magnitude+and+direction+of+the+T+cell+response.">An artificial antigen-presenting cell with paracrine delivery of IL-2 impacts the magnitude and direction of the T cell response.</a> The Journal of Biological Chemistry. 286 (40), 34883-34892 (2011).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paracrine+release+of+IL-2+and+anti-CTLA-4+enhances+the+ability+of+artificial+polymer+antigen-presenting+cells+to+expand+antigen-specific+T+cells+and+inhibit+tumor+growth+in+a+mouse+model.">Paracrine release of IL-2 and anti-CTLA-4 enhances the ability of artificial polymer antigen-presenting cells to expand antigen-specific T cells and inhibit tumor growth in a mouse model.</a> Cancer Immunology, Immunotherapy. 66 (9), 1229-1241 (2017).</li><li>Mescher, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+contact+requirements+for+activation+of+cytotoxic+T+lymphocytes.">Surface contact requirements for activation of cytotoxic T lymphocytes.</a> The Journal of Immunology. 149 (7), 2402-2405 (1992).</li><li>Steenblock, E. R., Fahmy, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+platform+for+ex+vivo+T-cell+expansion+based+on+biodegradable+polymeric+artificial+antigen-presenting+cells.">A comprehensive platform for ex vivo T-cell expansion based on biodegradable polymeric artificial antigen-presenting cells.</a> Molecular Therapy. 16 (4), 765-772 (2008).</li><li>Fifis, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size-dependent+immunogenicity:+therapeutic+and+protective+properties+of+nano-vaccines+against+tumors.">Size-dependent immunogenicity: therapeutic and protective properties of nano-vaccines against tumors.</a> The Journal of Immunology. 173 (5), 3148-3154 (2004).</li><li>Sunshine, J. C., Perica, K., Schneck, J. P., Green, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Particle+shape+dependence+of+CD8++T+cell+activation+by+artificial+antigen+presenting+cells.">Particle shape dependence of CD8+ T cell activation by artificial antigen presenting cells.</a> Biomaterials. 35 (1), 269-277 (2014).</li><li>Meyer, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biodegradable+nanoellipsoidal+artificial+antigen+presenting+cells+for+antigen+specific+T-cell+activation.">Biodegradable nanoellipsoidal artificial antigen presenting cells for antigen specific T-cell activation.</a> Small. 11 (13), 1519-1525 (2015).</li><li>Champion, J. A., Katare, Y. K., Mitragotri, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Particle+shape:+a+new+design+parameter+for+micro-+and+nanoscale+drug+delivery+carriers.">Particle shape: a new design parameter for micro- and nanoscale drug delivery carriers.</a> Journal of Controlled Release. 121 (1-2), 3-9 (2007).</li><li>Meyer, R. A., Meyer, R. S., Green, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+automated+multidimensional+thin+film+stretching+device+for+the+generation+of+anisotropic+polymeric+micro-+and+nanoparticles.">An automated multidimensional thin film stretching device for the generation of anisotropic polymeric micro- and nanoparticles.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 103 (8), 2747-2757 (2015).</li><li>Ho, C. C., Keller, A., Odell, J. A., Ottewill, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+monodisperse+ellipsoidal+polystyrene+particles.">Preparation of monodisperse ellipsoidal polystyrene particles.</a> Colloid and Polymer Science. 271 (5), 469-479 (1993).</li><li>Shum, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet+microfluidics+for+fabrication+of+non-spherical+particles.">Droplet microfluidics for fabrication of non-spherical particles.</a> Macromolecular Rapid Communications. 31 (2), 108-118 (2010).</li><li>Lan, W., Li, S., Xu, J., Luo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controllable+preparation+of+nanoparticle-coated+chitosan+microspheres+in+a+co-axial+microfluidic+device.">Controllable preparation of nanoparticle-coated chitosan microspheres in a co-axial microfluidic device.</a> Lab on a Chip. 11 (4), 652-657 (2011).</li><li>Yang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+synthesis+of+multifunctional+Janus+particles+for+biomedical+applications.">Microfluidic synthesis of multifunctional Janus particles for biomedical applications.</a> Lab on a Chip. 12 (12), 2097-2102 (2012).</li><li>Zhou, Z., Anselmo, A. C., Mitragotri, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+protein-based,+rod-shaped+particles+from+spherical+templates+using+layer-by-layer+assembly.">Synthesis of protein-based, rod-shaped particles from spherical templates using layer-by-layer assembly.</a> Advanced Materials. 25 (19), 2723-2727 (2013).</li><li>Jang, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Striped,+ellipsoidal+particles+by+controlled+assembly+of+diblock+copolymers.">Striped, ellipsoidal particles by controlled assembly of diblock copolymers.</a> Journal of the American Chemical Society. 135 (17), 6649-6657 (2013).</li><li>Petzetakis, N., Dove, A. P., O'Reilly, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cylindrical+micelles+from+the+living+crystallization-driven+self-assembly+of+poly(lactide)-containing+block+copolymers.">Cylindrical micelles from the living crystallization-driven self-assembly of poly(lactide)-containing block copolymers.</a> Chemical Science. 2 (5), 955-960 (2011).</li><li>Rolland, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+fabrication+and+harvesting+of+monodisperse,+shape-specific+nanobiomaterials.">Direct fabrication and harvesting of monodisperse, shape-specific nanobiomaterials.</a> Journal of the American Chemical Society. 127 (28), 10096-10100 (2005).</li><li>Meyer, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anisotropic+biodegradable+lipid+coated+particles+for+spatially+dynamic+protein+presentation.">Anisotropic biodegradable lipid coated particles for spatially dynamic protein presentation.</a> Acta Biomaterialia. 72, 228-238 (2018).</li></ol>

Este protocolo detalla un método versátil para la generación precisa de anisotrópicas partículas poliméricas. La película fina estiramiento técnica descrita aquí es escalable, altamente reproducible y económica. Técnicas alternativas para la generación de partículas anisotrópicas sufren muchas limitaciones, incluyendo alto costo, bajo rendimiento y tamaño de partícula limitada. La película fina estiramiento enfoque también es ventajosa porque las partículas se modifican para ser anisotrópicas después...

Las células que presenta antígenos artificiales (aAPC) han demostrado promesa como agentes inmunomoduladores porque pueden generar una respuesta robusta célula de T antígeno-específica. Esencial para estas plataformas son su capacidad para presentar eficientemente señales cruciales para la activación de células T. AAPC acelular son una alternativa atractiva a aAPC celulares porque son más fáciles y menos costosos de fabricar, menos dificultades durante el escalado y traducción y mitigar los riesgos asociados con las terapias basadas en células. AAPC acelular también permiten un alto grado de control sobre los parámetros de presentación de señal y características físicas de la superficie que se une con las células de T1.
aAPC debe recapitular un mínimo de dos señales esenciales para la activación de células T. Señal 1 proporciona el reconocimiento del antígeno y se produce cuando el receptor T (TCR) reconoce y compromete con un MHC de clase I o II con su antígeno cognado, culminando en la señalización a través del complejo TCR. Para omitir el requisito de especificidad de antígeno, aAPC sistemas a menudo llevan un agonístico anticuerpo monoclonal contra el receptor CD3, que estimula un complejo TCR. Formas recombinantes de MHC, particularmente MHC Multímeros, han utilizado también en la superficie de aAPC para proporcionar especificidad de antígeno2,3. Señal 2 es una señal costimulatory que dirige la actividad de las células T. Para proporcionar la coestimulación necesaria para la activación de células T, el receptor CD28 generalmente es estimulado con un anticuerpo agonístico presentado en la superficie de la aAPC, aunque otros receptores costimulatory como 4-1BB han dirigido con éxito4. Proteínas de señal 1 y 2 normalmente son inmovilizadas en la superficie de partículas rígidas para sintetizar aAPC. Históricamente, aAPC han sido fabricados de una variedad de materiales, incluyendo poliestireno4,5 y hierro dextrano6. Los sistemas más nuevos utilizan polímeros biodegradables como poli (ácido láctico-co-glicólico) (PLGA) para generar aAPC que puede acoplarse fácilmente para señalar las proteínas, es convenientes para la administración directa en vivoy puede facilitar la liberación de encapsulado de citocinas o factores solubles al aumentar la activación de la célula de T7,8.
Además de la presencia de proteínas de señal necesario, compromiso del receptor sobre una superficie suficientemente grande durante la interacción de la célula de la aAPC/T es esencial para la activación de células T. Así, parámetros físicos de la aAPC tales como tamaño y forma drásticamente alteran su área disponible de contacto y afectan su capacidad para estimular las células T. AAPC tamaño micrométrico han demostrado ser más eficaz en estimular las células de T que sus contrapartes de nanoescala9,10. Sin embargo, puede tener nano-aAPC biodistribución superior y mejor drenaje a los ganglios linfáticos que pueden mejorar su rendimiento en vivo sobre micro-aAPC11. La forma es otra variable de interés en sistemas basados en partículas aAPC. AAPC anisotrópico se han demostrado recientemente para ser más eficaz que partículas isotrópicas a estimular las células T, debido principalmente a la mayor interacción con las células diana junto con captación reducida celular inespecífica. Células se unen preferentemente al eje longitudinal de las partículas elipsoidales, y el mayor radio de curvatura y la superficie plana permite más contacto entre la aAPC y de la célula de T12. El eje largo de las partículas elipsoidales también desalienta la fagocitosis, dando por resultado la circulación creciente de tiempo que las partículas esféricas siguiendo en vivo administración12,13. Debido a estas ventajas, las partículas elipsoidales median una mayor expansión de específica de antígeno las células T en vitro y en vivo en comparación con las partículas esféricas, un efecto observado en el micro y nanoscales12, 13. Hay varias estrategias para fabricar partículas anisotrópicas, pero película delgada que se extiende es un método simple, ampliamente aceptado para generar una amplia gama de partículas diversas formas14. Tras la síntesis, las partículas son en películas y se extendía en una o dos dimensiones a una temperatura por encima de la temperatura de transición vítrea del material de partículas. La película entonces se disuelve para recuperar las partículas. A pesar de un creciente interés en las partículas anisotrópicas, enfoques actuales de fabricación aAPC basada en partículas en su mayoría se limitan a isotrópicos sistemas y métodos de alterar la forma de la partícula pueden ser difícil de implementar, incompatibles con determinadas síntesis de aAPC estrategias y falta de precisión y reproducibilidad15. Nuestra técnica de estiramiento de película delgada puede ser realizado manualmente o en forma automática para generar rápidamente las partículas anisotrópicas sintetizadas a partir de una variedad de polímeros biodegradables, se extendía a una relación de aspecto deseada en una o dos dimensiones15.
Basado en nuestro trabajo anterior, hemos desarrollado un enfoque basados en partículas biodegradable combinado con escalable tecnología de película delgada que estira para rápidamente generar aAPC con forma y tamaño ajustable de manera estandarizada para la expansión de la célula de T ex vivo o en vivo. Nuestra estrategia verbal de proteína se puede utilizar para acoplar cualquier proteína de interés a los grupos carboxilo en la superficie de la partícula en una densidad deseada, dando un alto grado de flexibilidad a este sistema aAPC. También se describen métodos para caracterizar el tamaño, la morfología y la proteína de la superficie de aAPC y para evaluar su funcionalidad en vitro. Este protocolo puede ser muy fácilmente adaptable para expandir las células inmunes ex vivo o en vivo para una variedad de aplicaciones de inmunoterapia.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Poly(vinyl alcohol), MW 25000, 88% hydrolyzed</td>
			<td>Polysciences, Inc.</td>
			<td>02975-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Thermometer</td>
			<td>Fluke</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Model name: Fluke 52 II</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersion Temperature Probe</td>
			<td>Fluke</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Model name: Fluke 80PK 22</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Hotplate &#38; Stirrer</td>
			<td>Benchmark Scientific</td>
			<td>H3760-HS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multipoint stirrer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>50093538</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Resomer RG 504 H, Poly(D,L-lactide-co-glycolide)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>719900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichloromethane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D65100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homogenizer</td>
			<td>IKA</td>
			<td>&#160;0003725001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>Sonics &#38; Materials, Inc.</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Model number: VC 505</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator sound abating enclosure</td>
			<td>Sonics &#38; Materials, Inc.</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Part number: 630-0427</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator probe</td>
			<td>Sonics &#38; Materials, Inc.</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Part number: 630-0220</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator microtip</td>
			<td>Sonics &#38; Materials, Inc.</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Part number: 630-0423</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High speed centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Model number: J-20XP (discontinued), alternative model: J-26XP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High speed centrifuge rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>369691</td>
			<td>Model number: JA-17</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High speed polycarbonate centrifuge tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>3118-0050</td>
			<td>50 mL, screw cap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rectangular disposable petri dish</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>25384-322</td>
			<td>75 x 50 x 10 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Square disposable petri dish</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>10799-140</td>
			<td>100 mm x 100 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LEAF&#160;Purified anti-mouse CD3&#949; Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>InVivoMab anti-mouse CD28, clone 37.51</td>
			<td>Bio X Cell</td>
			<td>BE0015-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-(3-Dimethylaminopropyl)-N&#8242;-ethylcarbodiimide hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E6383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Hydroxysulfosuccinimide sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>56485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3671</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 anti-mouse CD3 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-mouse CD28 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>102109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning&#160;96 Well Solid Polystyrene Microplate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS3915</td>
			<td>flat bottom, black polystyrene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein LoBind Tubes, 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22431081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Medium (+ L-Glutamine)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11875093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F4135</td>
			<td>Heat Inactivated, sterile-filtered</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ciprofloxacin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>17850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human IL-2 (carrier-free)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>589102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate (100 mM)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11360070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Vitamin Solution (100X)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11120052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD8a+&#160;T Cell Isolation Kit, mouse</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-104-075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>C34554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS Columns</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MidiMACS Separator</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-042-302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS Multistand</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-042-303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Cytometer</td>
			<td>Accuri C6</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synergy 2 Multi-Detection Microplate Reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>autoMACS Running Buffer</td>
			<td>Miltenyi BIotech</td>
			<td>130-091-221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>22363548</td>
			<td>Sterile, 70 &#181;m nylon mesh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACK Lysing Buffer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A1049201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6J (Black 6) Mouse</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>000664</td>
			<td>Male, at least 7 weeks old</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-Bottom Tissue Culture Plates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>353227</td>
			<td>Sterile, 96-well tissue culture treated polystyrene plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 V DC Power Supply</td>
			<td>Probotix</td>
			<td>LPSK-4010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE Coated Wire</td>
			<td>Mouser</td>
			<td>602-5858-100-01</td>
			<td>This is for a 100 ft. spool but an equivalent wire will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stepper Motor Driver</td>
			<td>Probotix</td>
			<td>MondoStep5.6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IDC Connector Kit</td>
			<td>Probotix</td>
			<td>IDCM-10-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcontroller</td>
			<td>Probotix</td>
			<td>PBX-RF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4A Fuses</td>
			<td>Radio Shack</td>
			<td>2701026</td>
			<td>Equivalent fuses will work as well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DB25 Male to Male Cable</td>
			<td>Probotix</td>
			<td>DB25-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USB-A to USB-B Cable</td>
			<td>Staples</td>
			<td>2094915</td>
			<td>Equivalent cable will work as well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-Pin Amphenol Connectors Male and Female</td>
			<td>Mouser</td>
			<td>654-97-3100A-20-7P and 654-97-3106A20-7S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stepper Motor</td>
			<td>Probotix</td>
			<td>HT23-420-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Right Hand Lead Screw</td>
			<td>Roton</td>
			<td>60722</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Left Hand Lead Screw</td>
			<td>Roton</td>
			<td>60723</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screws</td>
			<td>McMaster Carr</td>
			<td>92196A151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neoprene Rubber</td>
			<td>McMaster Carr</td>
			<td>8698K51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Right Handed Flanged Lead Nut</td>
			<td>Roton</td>
			<td>91962</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Left Handed Flanged Lead Nut</td>
			<td>Roton</td>
			<td>91963</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Linux Control Computer</td>
			<td>Probotix</td>
			<td>LCNC-PC</td>
			<td>Any computer with matching specification and Linux operating system will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning bottle-top vacuum filter system</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS431097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution, 0.4 %</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fabrication of anisotropic polymeric artificial antigen presenting cells for cd8+ t cell activation

Antígeno artificial que presenta las células (aAPC) son una prometedora plataforma para modulación inmune debido a su potente capacidad para estimular las células T. Acelulares sustratos ofrecen ventajas sobre aAPC basadas en células, incluyendo un control preciso de los parámetros de presentación de señal y las características físicas de la superficie de la aAPC para modular las interacciones con las células de T. aAPC construido a partir de partículas anisotrópicas, partículas especialmente elipsoidales, han demostrado ser más eficaz que sus contrapartes esféricas a estimulantes células T debido a la mayor unión y mayor superficie disponible para la célula de T de contacto, así disminución de la absorción no específica y propiedades farmacocinéticas mejoradas. A pesar del creciente interés partículas anisotrópicas, incluso ampliamente aceptados métodos de generar partículas anisotrópicas como estiramiento de película delgada puede ser un desafío implementar y usar de manera reproducible.
Para ello, describimos un protocolo para la fabricación rápida y estandarizada de biodegradable anisotrópico aAPC basada en partículas con tamaño ajustable, forma y señal de presentación de la célula de T expansión ex vivo o en vivo, junto con métodos para caracterizan su tamaño, morfología y superficie contenido en proteínas y para evaluar su funcionalidad. Esta forma de fabricación de aAPC anisotrópico es escalable y reproducible, lo que es ideal para la generación de aAPC para inmunoterapias "estándares".

Un esquema de la película fina 2D automatizado dispositivo de estiramiento se da en la figura 1. Un esquema y una descripción de una película fina de 1D dispositivo de estiramiento se da en Ho et al.17 la camilla está hecha de piezas de aluminio mediante fresado y mecanizado técnicas estándar. Similar a la camilla de 1D, la camilla 2D consiste en puños metálicos y guías. Se utilizan tornillos bidireccional para traducir lineal...

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Fabrication of Anisotropic Polymeric Artificial Antigen Presenting Cells for CD8+ T Cell Activation

Aquí, presentamos un protocolo de forma rápida y reproducible generar biológicamente inspirado, biodegradable articifical antígeno que presenta las células (aAPC) con tamaño ajustable, forma y presentación de proteína de la superficie de la célula de T expansión ex vivo o en vivo .

Fabricación de Anisotropic antígeno Artificial polimérico que presenta las células para la activación de células T CD8 +

Artificial antigen presenting cells (aAPC) are a promising platform for immune modulation due to their potent ability to stimulate T cells. Acellular ...

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la aminoingeniería. Por ejemplo, ¿cuál es el papel de las propiedades físicas de las partículas en las interacciones y activación de células inmunitarias biomateriales. La principal ventaja de esta técnica es que permite un control independiente del tamaño y la forma de las partículas biomiméticas.Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la terapia del cáncer, ya que es una terapia de partículas fuera de la plataforma que puede causar respuestas inmunitarias mediadas por células in vivo. Aunque este método puede proporcionar información sobre la aminoterapia contra el cáncer, también se puede aplicar a otros sistemas. Por ejemplo, enfermedades infecciosas o diabetes tipo uno.Para la síntesis de micropartículas, comience por pesar 100 miligramos de poli(ácido láctico-co-glicólico) o PLGA, en un vial de centelleo y disolver el PLGA en cinco mililitros de diclorometano por vórtice. Coloque un homogeneizador en un vaso de precipitados que contenga 50 mililitros de alcohol 1%polivinílico, o solución de PVA, de modo que el homogeneizador esté lo más cerca posible del fondo del vaso de precipitados sin tocarlo. Encienda el homogeneizador a la velocidad adecuada y añada la solución PLGA al vaso de precipitados durante un minuto de homogeneización.Al final de la homogeneización, vierta la solución de micropartículas PLGA de alcohol polivinílico en un vaso de precipitados que contenga 100 mililitros de solución de 5%PVA en una placa de agitación en una campana química y revuelva la solución durante al menos cuatro horas. Cuando el disolvente se haya evaporado, vierta la solución de partículas en tubos cónicos de 50 mililitros y recoja las partículas por centrifugación. Sustituya el sobrenadante de cada tubo por 20 mililitros de agua desinocida y vuelva a suspender las partículas por vórtice.A continuación, lleve el volumen final en cada tubo hasta 50 mililitros con agua fresca desimalitizada y lave las partículas dos veces más como se acaba de demostrar. Para la síntesis de nanopartículas, disolver 200 miligramos de PLGA en cinco mililitros de diclorometano y colocar una sonda sonicadora en un vaso de precipitados que contenga 50 mililitros de 1%PVA solución en hielo sin tocar la parte inferior del vaso de precipitados. Comience la sonicación a 12 vatios e añada inmediatamente la solución PLGA al vaso de precipitados para una sonicación de dos minutos para generar nanopartículas con un diámetro aproximado de 200 nanómetros.Después de la sonicación, vierta la solución de nanopartículas PLGA de alcohol polivinílico 1%en un vaso de precipitados que contenga 100 mililitros de solución de 5 PVA en una placa de agitación durante cuatro horas de evaporación de disolvente en una campana de humo química. Cuando todo el disolvente se evapore, vierta la solución de partículas en tubos cónicos de 50 mililitros para centrifugación para eliminar cualquier micropartícula y eliminar los sobrenadantes. A continuación, transfiera las nanopartículas a tubos centrífugos de alta velocidad para tres lavados en agua desionizada como se ha demostrado.Para la fabricación de partículas poliméricas, después del último lavado, vuelva a suspender las partículas en aproximadamente un mililitro de agua fresca desimalitizada y agregue la solución de fundición de película a las partículas a una concentración final de 2,5 miligramos por mililitro de partículas. Transfiera la suspensión de partículas en alícuotas de 10 mililitros en platos Petri rectangulares de 75 por 50 milímetros para un estiramiento dimensional. O en alícuotas de 15 mililitros en platos Petri de 100 por 100 milímetros cuadrados para estiramiento bidimensional.Después de secar durante la noche en una capucha química, utilice pinzas para quitar las películas y recortar los bordes con tijeras. Para el estiramiento 1D, coloque los dos bordes cortos de una película entre dos piezas de caucho de neopreno para montarlos en los bloques de aluminio de un eje de un dispositivo automatizado de estiramiento de película delgada. A continuación, utilice una llave Allen para atornillar las empuñaduras metálicas en la parte superior de la goma para mantener la película en su lugar.Para el estiramiento 2D, monte los cuatro bordes en cuatro bloques de aluminio para estirar la película en ambos ejes miden y registren la longitud de la película entre los bloques de aluminio en un eje para un estiramiento D o ambos ejes para el estiramiento 2D y calcule la distancia necesaria para estirar la película en una o dos direcciones en función del estiramiento de pliegue deseado. A continuación, coloque el dispositivo de estiramiento cargado de película en un horno a 90 grados centígrados junto a un vaso de precipitados más grande de una pequeña cantidad de agua para llevar la película a temperatura durante 10 minutos. Cuando el estiramiento esté completo, deje que la película se enfríe a temperatura ambiente durante 20 minutos.Para el estiramiento 1D, corte la película del dispositivo de estiramiento en los bordes. Para el estiramiento 2D, corte y guarde el cuadrado central de la película que se estira uniformemente en ambos ejes. Coloque las películas en tubos cónicos de 50 mililitros con no más de dos películas por tubo y agregue aproximadamente 25 mililitros de agua desinciso a cada tubo para el vórtice.Cuando las películas se hayan disuelto, lave las partículas tres veces en agua des ionizada como se ha demostrado. Re-suspender las partículas en aproximadamente un mililitro de agua fresca desimalitizada por tubo después del último lavado. A continuación, congele las partículas a menos 80 grados centígrados durante una hora o liofilización durante la noche.A la mañana siguiente, vuelva a suspender las micro o nanopartículas liofilizadas a 20 miligramos por mililitro en tampón MES recién preparado con vórtice. Añadir 100 microlitros de la solución de partículas a un tubo de micro centrífuga de polipropileno que contenga 900 microlitros de tampón MES y añadir 100 microlitros de solución EDC NHS recién preparada. Mezclar las partículas por vórtice e incubar las partículas en un inversor a temperatura ambiente durante 30 minutos.Al final de la incubación, recoger las partículas por centrifugación y volver a suspender los pellets de micropartículas en un mililitro de PBS por vórtice o volver a suspender las nanopartículas en un mililitro de PBS por cinco segundos de sonicación a dos a tres vatios. A continuación, agregue ocho microgramos de una señal adecuada una proteína y 10 microgramos de anticuerpos CD28 antiratón a las micropartículas, o 16 microgramos de la señal de una proteína y 20 microgramos de CD28 anti mouse a las nanopartículas. Lleve el volumen final en cada tubo a 1,1 mililitros con PBS e incubar las partículas durante la noche en un inversor a cuatro grados centígrados.Al día siguiente, lave las partículas tres veces en agua des ionizada como se ha demostrado. Estas nanopartículas y micropartículas PLGA se sintetizaron utilizando las técnicas de emulsión única demostradas e imágenes mediante microscopía electrónica de transmisión y barrido. Después de la homogeneización, las micropartículas demostraron un diámetro medio de unos tres micrómetros.Las micropartículas esféricas tenían una ración de aspecto de aproximadamente una, mientras que las partículas elipsoidales prolatos estiradas en 1D tenían una relación de aspecto mayor de aproximadamente tres y medio y las partículas elipsoidales oblatos estiradas en 2D tenían una relación de aspecto de aproximadamente 1,2, manteniendo aproximadamente una relación de aspecto de una. Los resultados de la eficiencia de conjugación revelan las cantidades similares de proteína en la superficie de las células de presentación de antígenos micro-artificiales esféricos y elipsoidales, o AAPC y nano-AAPC, lo que demuestra que el acoplamiento de proteínas durante la síntesis de AAPC se produce de manera dependiente de la concentración. Se encontró que el AAPC elipsoidal prolato induce mayores niveles de proliferación de células T a dosis de sub-saturación que el AAPC esférico con la mejor separación lograda a una dosis de 01 miligramos.Después de siete días, el recuento manual de las células T reveló que el AAPC elipsoidal prolato estimula más eficazmente las células T en comparación con sus contrapartes esféricas a escala micro y nano en una manera dependiente de la dosis. Después de este procedimiento, AAPC se puede administrar in vivo para medir su eficacia terapéutica y farmacocinética. Después de su desarrollo, esta técnica ayudó a allanar el camino para que los investigadores en el campo de la inmuno-ingeniería explorar el efecto de la anisotropía en la eficacia de AAPC.

Research

JoVE Journal

Environment

Mass Production of Genetically Modified Aedes aegypti for Field Releases in Brazil

Mass Production of Genetically Modified Aedes aegypti for Field Releases in Brazil

Producción masiva de Aedes aegypti genéticamente modificados para liberaciones de campo en Brasil

New techniques and methods are being sought to try to win the battle against mosquitoes. Recent advances in molecular techniques have led to the ...

Investigación

Medio ambiente

Measuring Fluxes of Mineral Nutrients and Toxicants in Plants with Radioactive Tracers

Flujos de nutrientes minerales y sustancias tóxicas de medición en plantas con Trazadores Radiactivos

Unidirectional influx and efflux of nutrients and toxicants, and their resultant net fluxes, are central to the nutrition and toxicology of plants. ...

A Whole Cell Bioreporter Approach to Assess Transport and Bioavailability of Organic Contaminants in Water Unsaturated Systems

Todo un enfoque bioinformador celular para evaluar Transporte y Biodisponibilidad de los Contaminantes Orgánicos en Sistemas no saturadas de agua

Bioavailability of contaminants is a prerequisite for their effective biodegradation in soil. The average bulk concentration of a contaminant, however, is ...

Use of Chironomidae (Diptera) Surface-Floating Pupal Exuviae as a Rapid Bioassessment Protocol for Water Bodies

Use of Chironomidae Diptera Surface-Floating Pupal Exuviae as a Rapid Bioassessment Protocol for Water Bodies

El uso de Chironomidae (Diptera) en superficie flotante pupal Exuviae como Protocolo Bioassessment rápida para las Masas de Agua

Rapid bioassessment protocols using benthic macroinvertebrate assemblages have been successfully used to assess human impacts on water quality. ...

Extraction of Structural Extracellular Polymeric Substances from Aerobic Granular Sludge

La extracción de sustancias poliméricas extracelulares estructural de lodo granular aerobio

To evaluate and develop methodologies for the extraction of gel-forming extracellular polymeric substances (EPS), EPS from aerobic granular sludge (AGS) ...

Functionalization and Dispersion of Carbon Nanomaterials Using an Environmentally Friendly Ultrasonicated Ozonolysis Process

Funcionalización y Dispersión de Nanomateriales de Carbono Utilizando un Proceso de Ozonolisis Ultrasonido

Functionalization of carbon nanomaterials is often a critical step that facilitates their integration into larger material systems and devices. In the ...

Ecosystem Fabrication (EcoFAB) Protocols for The Construction of Laboratory Ecosystems Designed to Study Plant-microbe Interactions

Ecosystem Fabrication EcoFAB Protocols for The Construction of Laboratory Ecosystems Designed to Study Plant-microbe Interactions

Protocolos de fabricación (EcoFAB) del ecosistema para la construcción de ecosistemas de laboratorio diseñado para estudiar las interacciones planta-microorganismo

Beneficial plant-microbe interactions offer a sustainable biological solution with the potential to boost low-input food and bioenergy production. A ...

A Strain Gauge Monitor (SGM) for Continuous Valve Gape Measurements in Bivalve Molluscs in Response to Laboratory Induced Diel-cycling Hypoxia and pH

A Strain Gauge Monitor SGM for Continuous Valve Gape Measurements in Bivalve Molluscs in Response to Laboratory Induced Diel-cycling Hypoxia and pH

Un Monitor de galgas extensométricas (SGM) para válvula abren las mediciones continuas en los moluscos bivalvos en respuesta a hipoxia laboratorio inducida por Diel-ciclismo y pH

An inexpensive, laboratory-based, strain gauge valve gape monitor (SGM) was developed to monitor the valve gape behavior of bivalve molluscs in response ...

Bioindication Testing of Stream Environment Suitability for Young Freshwater Pearl Mussels Using In Situ Exposure Methods

Bioindication Testing of Stream Environment Suitability for Young Freshwater Pearl Mussels Using In Situ Exposure Methods

Bioindicación para el examen de idoneidad del entorno de corriente joven agua dulce mejillones utilizando métodos de exposición In Situ de la perla

Knowledge of habitat suitability for freshwater mussels is an important step in the conservation of this endangered species group. We describe a protocol ...

Cultivation of Green Microalgae in Bubble Column Photobioreactors and an Assay for Neutral Lipids

Cultivo de microalgas verdes en fotobiorreactores de columna de burbuja y un análisis de lípidos neutros

There is significant interest in the study of microalgae for engineering applications such as the production of biofuels, high value products, and for the ...