Name: fabrication of anisotropic polymeric artificial antigen presenting cells for cd8+ t cell activation
Uploaded: 2018-10-12T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fabrication of Anisotropic Polymeric Artificial Antigen Presenting Cells for CD8+ T Cell Activation at JoVE.com

EBA (DGE-1746891) och KRR (DGE-1232825) tacka NSF Graduate Research Fellowship-programmet för stöd. RAM tack den nationella forskningen Service Award NIH NCI F31 (F31CA214147) och de uppnå belöningar för College forskare stipendium för stöd. Författarna tackar NIH (R01EB016721 och R01CA195503), forskningen till förhindra blindhet James och Carole gratis katalysator Award, och JHU Bloomberg-Kimmel Institute for Cancer immunterapi för stöd.

Alla metoderna som beskrivs här har godkänts av den institutionella djur vård och användning kommittén (IACUC) av Johns Hopkins University.
1. tillverkning av sfäriska PLGA partiklar av avstämbara storlek
<ol><li>Beredning av material för partikel syntes<ol>
<li>Bered 5% w/w polyvinylalkohol (PVA).<ol>
<li>Lägga till 500 mL avjoniserat vatten (DI) vatten i en Erlenmeyerkolv med magnetiska rör bar och placera på värmeplatta omrörare på 500 rpm och övervaka temperatur med termom...

<ol>
	<li>Eggermont, L. J., Paulis, L. E., Tel, J., Figdor, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+efficient+cancer+immunotherapy:+Advances+in+developing+artificial+antigen-presenting+cells.">Towards efficient cancer immunotherapy: Advances in developing artificial antigen-presenting cells.</a> Trends in Biotechnology. 32 (9), 456-465 (2014).</li><li>Maus, M. V., Riley, J. L., Kwok, W. W., Nepom, G. T., June, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HLA+tetramer-based+artificial+antigen-presenting+cells+for+stimulation+of+CD4++T+cells.">HLA tetramer-based artificial antigen-presenting cells for stimulation of CD4+ T cells.</a> Clinical Immunology. 106 (1), 16-22 (2003).</li><li>Oelke, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+induction+and+expansion+of+antigen-specific+cytotoxic+T+cells+by+HLA-Ig-coated+artificial+antigen-presenting+cells.">Ex vivo induction and expansion of antigen-specific cytotoxic T cells by HLA-Ig-coated artificial antigen-presenting cells.</a> Nature Medicine. 9 (5), 619-624 (2003).</li><li>Rudolf, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potent+costimulation+of+human+CD8+T+cells+by+anti-4-1BB+and+anti-CD28+on+synthetic+artificial+antigen+presenting+cells.">Potent costimulation of human CD8 T cells by anti-4-1BB and anti-CD28 on synthetic artificial antigen presenting cells.</a> Cancer Immunology, Immunotherapy. 57 (2), 175-183 (2008).</li><li>Tham, E. L., Jensen, P. L., Mescher, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+antigen-specific+T+cells+by+artificial+cell+constructs+having+immobilized+multimeric+peptide-class+I+complexes+and+recombinant+B7-Fc+proteins.">Activation of antigen-specific T cells by artificial cell constructs having immobilized multimeric peptide-class I complexes and recombinant B7-Fc proteins.</a> Journal of Immunological Methods. 249 (1-2), 111-119 (2001).</li><li>Perica, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+field-induced+T+cell+receptor+clustering+by+nanoparticles+enhances+T+cell+activation+and+stimulates+antitumor+activity.">Magnetic field-induced T cell receptor clustering by nanoparticles enhances T cell activation and stimulates antitumor activity.</a> ACS Nano. 8 (3), 2252-2260 (2014).</li><li>Steenblock, E. R., Fadel, T., Labowsky, M., Pober, J. S., Fahmy, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+artificial+antigen-presenting+cell+with+paracrine+delivery+of+IL-2+impacts+the+magnitude+and+direction+of+the+T+cell+response.">An artificial antigen-presenting cell with paracrine delivery of IL-2 impacts the magnitude and direction of the T cell response.</a> The Journal of Biological Chemistry. 286 (40), 34883-34892 (2011).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paracrine+release+of+IL-2+and+anti-CTLA-4+enhances+the+ability+of+artificial+polymer+antigen-presenting+cells+to+expand+antigen-specific+T+cells+and+inhibit+tumor+growth+in+a+mouse+model.">Paracrine release of IL-2 and anti-CTLA-4 enhances the ability of artificial polymer antigen-presenting cells to expand antigen-specific T cells and inhibit tumor growth in a mouse model.</a> Cancer Immunology, Immunotherapy. 66 (9), 1229-1241 (2017).</li><li>Mescher, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+contact+requirements+for+activation+of+cytotoxic+T+lymphocytes.">Surface contact requirements for activation of cytotoxic T lymphocytes.</a> The Journal of Immunology. 149 (7), 2402-2405 (1992).</li><li>Steenblock, E. R., Fahmy, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+platform+for+ex+vivo+T-cell+expansion+based+on+biodegradable+polymeric+artificial+antigen-presenting+cells.">A comprehensive platform for ex vivo T-cell expansion based on biodegradable polymeric artificial antigen-presenting cells.</a> Molecular Therapy. 16 (4), 765-772 (2008).</li><li>Fifis, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size-dependent+immunogenicity:+therapeutic+and+protective+properties+of+nano-vaccines+against+tumors.">Size-dependent immunogenicity: therapeutic and protective properties of nano-vaccines against tumors.</a> The Journal of Immunology. 173 (5), 3148-3154 (2004).</li><li>Sunshine, J. C., Perica, K., Schneck, J. P., Green, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Particle+shape+dependence+of+CD8++T+cell+activation+by+artificial+antigen+presenting+cells.">Particle shape dependence of CD8+ T cell activation by artificial antigen presenting cells.</a> Biomaterials. 35 (1), 269-277 (2014).</li><li>Meyer, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biodegradable+nanoellipsoidal+artificial+antigen+presenting+cells+for+antigen+specific+T-cell+activation.">Biodegradable nanoellipsoidal artificial antigen presenting cells for antigen specific T-cell activation.</a> Small. 11 (13), 1519-1525 (2015).</li><li>Champion, J. A., Katare, Y. K., Mitragotri, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Particle+shape:+a+new+design+parameter+for+micro-+and+nanoscale+drug+delivery+carriers.">Particle shape: a new design parameter for micro- and nanoscale drug delivery carriers.</a> Journal of Controlled Release. 121 (1-2), 3-9 (2007).</li><li>Meyer, R. A., Meyer, R. S., Green, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+automated+multidimensional+thin+film+stretching+device+for+the+generation+of+anisotropic+polymeric+micro-+and+nanoparticles.">An automated multidimensional thin film stretching device for the generation of anisotropic polymeric micro- and nanoparticles.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 103 (8), 2747-2757 (2015).</li><li>Ho, C. C., Keller, A., Odell, J. A., Ottewill, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+monodisperse+ellipsoidal+polystyrene+particles.">Preparation of monodisperse ellipsoidal polystyrene particles.</a> Colloid and Polymer Science. 271 (5), 469-479 (1993).</li><li>Shum, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet+microfluidics+for+fabrication+of+non-spherical+particles.">Droplet microfluidics for fabrication of non-spherical particles.</a> Macromolecular Rapid Communications. 31 (2), 108-118 (2010).</li><li>Lan, W., Li, S., Xu, J., Luo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controllable+preparation+of+nanoparticle-coated+chitosan+microspheres+in+a+co-axial+microfluidic+device.">Controllable preparation of nanoparticle-coated chitosan microspheres in a co-axial microfluidic device.</a> Lab on a Chip. 11 (4), 652-657 (2011).</li><li>Yang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+synthesis+of+multifunctional+Janus+particles+for+biomedical+applications.">Microfluidic synthesis of multifunctional Janus particles for biomedical applications.</a> Lab on a Chip. 12 (12), 2097-2102 (2012).</li><li>Zhou, Z., Anselmo, A. C., Mitragotri, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+protein-based,+rod-shaped+particles+from+spherical+templates+using+layer-by-layer+assembly.">Synthesis of protein-based, rod-shaped particles from spherical templates using layer-by-layer assembly.</a> Advanced Materials. 25 (19), 2723-2727 (2013).</li><li>Jang, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Striped,+ellipsoidal+particles+by+controlled+assembly+of+diblock+copolymers.">Striped, ellipsoidal particles by controlled assembly of diblock copolymers.</a> Journal of the American Chemical Society. 135 (17), 6649-6657 (2013).</li><li>Petzetakis, N., Dove, A. P., O'Reilly, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cylindrical+micelles+from+the+living+crystallization-driven+self-assembly+of+poly(lactide)-containing+block+copolymers.">Cylindrical micelles from the living crystallization-driven self-assembly of poly(lactide)-containing block copolymers.</a> Chemical Science. 2 (5), 955-960 (2011).</li><li>Rolland, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+fabrication+and+harvesting+of+monodisperse,+shape-specific+nanobiomaterials.">Direct fabrication and harvesting of monodisperse, shape-specific nanobiomaterials.</a> Journal of the American Chemical Society. 127 (28), 10096-10100 (2005).</li><li>Meyer, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anisotropic+biodegradable+lipid+coated+particles+for+spatially+dynamic+protein+presentation.">Anisotropic biodegradable lipid coated particles for spatially dynamic protein presentation.</a> Acta Biomaterialia. 72, 228-238 (2018).</li></ol>

Detta protokoll Detaljer en mångsidig metod för exakt generering av anisotropisk polymera partiklar. Tunna filmen stretching teknik som beskrivs här är skalbar, mycket reproducerbara och billiga. Alternativa tekniker för att generera Anisotrop partiklar lider många begränsningar, inklusive hög kostnad, låg genomströmning och begränsad partikelstorlek. Tunna filmen stretching strategi är också en fördel eftersom partiklarna är modifierad för att vara Anisotrop efter syntes, och som ett resultat, är kompat...

Konstgjorda antigen presenterande celler (aAPC) har visat lovande resultat som immunmodulerande medel eftersom de kan generera ett robust antigen-specifika T-cellssvar. Nödvändigt att dessa plattformar är deras förmåga att effektivt presentera avgörande signaler för T-cellsaktivering. Acellulärt aAPC är ett attraktivt alternativ till cell-baserat aAPC eftersom de är lättare och billigare att tillverka, färre utmaningar under skala upp och översättning och mildra riskerna med cellbaserade terapier. Acellulärt aAPC möjliggör även en hög grad av kontroll över signalen presentation parametrar och fysikaliska egenskaper av ytan som kommer att samverka med T celler1.
aAPC måste sammanfatta ett minimum av två signaler viktigt för T-cellsaktivering. Signal 1 ger antigen erkännande och uppstår när T cell receptorn (TCR) erkänner och engagerar med en MHC klass I eller II bär dess cognate antigen, vilket kulminerade i signalering genom komplexa TCR. För att kringgå kravet på antigen specificitet, bär aAPC system ofta en agonistiska monoklonal antikropp mot de CD3-receptorn, som nonspecifically stimulerar TCR komplexet. Rekombinant former av MHC, särskilt MHC multimers, har också använts på ytan av aAPC för att ge antigen specificitet2,3. Signal 2 är en costimulatory signal som styr T cellsaktivitet. För att ge costimulation som krävs för T-cellsaktivering, stimuleras CD28 receptorn generellt med en agonistiska antikropp som presenteras på den aAPC ytan, även om andra costimulatory receptorer såsom 4-1BB har varit framgångsrikt riktade4. Signalproteiner 1 och 2 är vanligtvis orörlig på ytan av styv partiklar att syntetisera aAPC. AAPC har historiskt sett varit påhittade från en mängd olika material, inklusive polystyren4,5 och järn dextran6. Nyare system utnyttja biologiskt nedbrytbara polymerer som poly (mjölksyra-co-glykolsyra) (PLGA) för att generera aAPC som enkelt kan kopplas för att signalera proteiner, lämpar sig för direkt administrering i vivooch kan underlätta den fördröjd frisättningen av inkapslade cytokiner eller lösliga faktorer att öka T cell aktivering7,8.
Utöver förekomsten av nödvändiga signalproteiner är receptor engagemang över en tillräckligt stor yta under aAPC/T cell samspelet viktigt för T-cellsaktivering. Således fysiska parametrar i aAPC såsom storlek och form drastiskt förändrar deras tillgängliga kontaktyta och påverka deras förmåga att stimulera T-celler. Micron stora aAPC har visat sig vara mer effektiva på stimulera T-celler än deras nanoskala motsvarigheter9,10. Nano-aAPC kan dock ha överlägsen biodistribution och bättre dränering till lymfkörtlarna som kan förbättra deras prestanda i vivo över mikro-aAPC11. Formen är en annan variabeln av intresse i partikel-baserade aAPC system. Anisotropic aAPC har nyligen visat sig vara effektivare än isotropiskt partiklar vid stimulera T-celler, främst på grund av förbättrad interaktion med målceller i kombination med minskad icke-specifik cell upptag. Celler binder prioriterat till den långa axeln av elliptiskt partiklar och större radie av krökning och plattare yta möjliggör mer kontakt mellan aAPC och T-cell12. Den långa axeln av elliptiskt partiklar avskräcker också fagocytos, vilket resulterar i ökad cirkulation tid jämfört med sfäriska partiklar efter i vivo administration12,13. På grund av dessa fördelar medla elliptiskt partiklar större expansion av antigen-specifika T celler in vitro- och in-vivo jämfört med sfäriska partiklar, en effekt som observerades både mikro- och nanoscales12, 13. Det finns olika strategier att fabricera Anisotrop partiklar, men tunnfilms-stretching är en enkel, allmänt accepterad metod som används för att generera en rad olika partikel former14. Efter syntes, partiklar kastas i filmer och utsträckt i en eller två dimensioner vid en temperatur över glasomvandlingstemperatur på partikel materialet. Filmen löses sedan för att hämta partiklarna. Trots växande intresse för anisotropisk partiklar, nuvarande metoder för fabricera partikel-baserade aAPC är mestadels begränsad till isotropiskt system och metoder för att förändra partikelform kan vara svår att genomföra, oförenlig med vissa aAPC syntes strategier och brist på precision och reproducerbarhet15. Vår tunnfilms-stretching teknik kan utföras manuellt eller i ett automatiserat sätt att snabbt generera Anisotrop partiklarna syntetiseras från en mängd biologiskt nedbrytbara polymerer, sträckt till önskad proportionerna i en eller två dimensioner15.
Baserat på vårt tidigare arbete, utvecklat vi en biologiskt nedbrytbar partikel-baserade strategi i kombination med skalbar tunnfilms-stretching teknik att snabbt generera aAPC med avstämbara storlek och form på ett standardiserat sätt för T-cell expansion ex vivo eller i vivo. Vår strategi för Konjugation av protein kan användas att någon proteinernas sevärdheter till carboxyl grupper på partikeln ytbehandlar på en önskad täthet, ger detta aAPC system en hög grad av flexibilitet. Vi beskriver också att karakterisera storlek, morfologi och ytan protein innehåll av aAPC, och att utvärdera deras funktioner in vitro-metoder. Detta protokoll kan enkelt anpassas till expandera immunceller ex vivo eller in-vivo för en mängd immunoterapeutisk tillämpningar.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Poly(vinyl alcohol), MW 25000, 88% hydrolyzed</td>
			<td>Polysciences, Inc.</td>
			<td>02975-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Thermometer</td>
			<td>Fluke</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Model name: Fluke 52 II</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersion Temperature Probe</td>
			<td>Fluke</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Model name: Fluke 80PK 22</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Hotplate &#38; Stirrer</td>
			<td>Benchmark Scientific</td>
			<td>H3760-HS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multipoint stirrer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>50093538</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Resomer RG 504 H, Poly(D,L-lactide-co-glycolide)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>719900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichloromethane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D65100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homogenizer</td>
			<td>IKA</td>
			<td>&#160;0003725001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>Sonics &#38; Materials, Inc.</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Model number: VC 505</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator sound abating enclosure</td>
			<td>Sonics &#38; Materials, Inc.</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Part number: 630-0427</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator probe</td>
			<td>Sonics &#38; Materials, Inc.</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Part number: 630-0220</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator microtip</td>
			<td>Sonics &#38; Materials, Inc.</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Part number: 630-0423</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High speed centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Model number: J-20XP (discontinued), alternative model: J-26XP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High speed centrifuge rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>369691</td>
			<td>Model number: JA-17</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High speed polycarbonate centrifuge tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>3118-0050</td>
			<td>50 mL, screw cap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rectangular disposable petri dish</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>25384-322</td>
			<td>75 x 50 x 10 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Square disposable petri dish</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>10799-140</td>
			<td>100 mm x 100 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LEAF&#160;Purified anti-mouse CD3&#949; Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>InVivoMab anti-mouse CD28, clone 37.51</td>
			<td>Bio X Cell</td>
			<td>BE0015-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-(3-Dimethylaminopropyl)-N&#8242;-ethylcarbodiimide hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E6383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Hydroxysulfosuccinimide sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>56485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3671</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 anti-mouse CD3 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-mouse CD28 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>102109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning&#160;96 Well Solid Polystyrene Microplate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS3915</td>
			<td>flat bottom, black polystyrene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein LoBind Tubes, 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22431081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Medium (+ L-Glutamine)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11875093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F4135</td>
			<td>Heat Inactivated, sterile-filtered</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ciprofloxacin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>17850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human IL-2 (carrier-free)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>589102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate (100 mM)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11360070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Vitamin Solution (100X)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11120052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD8a+&#160;T Cell Isolation Kit, mouse</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-104-075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>C34554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS Columns</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MidiMACS Separator</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-042-302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS Multistand</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-042-303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Cytometer</td>
			<td>Accuri C6</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synergy 2 Multi-Detection Microplate Reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>autoMACS Running Buffer</td>
			<td>Miltenyi BIotech</td>
			<td>130-091-221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>22363548</td>
			<td>Sterile, 70 &#181;m nylon mesh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACK Lysing Buffer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A1049201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6J (Black 6) Mouse</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>000664</td>
			<td>Male, at least 7 weeks old</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-Bottom Tissue Culture Plates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>353227</td>
			<td>Sterile, 96-well tissue culture treated polystyrene plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 V DC Power Supply</td>
			<td>Probotix</td>
			<td>LPSK-4010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE Coated Wire</td>
			<td>Mouser</td>
			<td>602-5858-100-01</td>
			<td>This is for a 100 ft. spool but an equivalent wire will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stepper Motor Driver</td>
			<td>Probotix</td>
			<td>MondoStep5.6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IDC Connector Kit</td>
			<td>Probotix</td>
			<td>IDCM-10-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcontroller</td>
			<td>Probotix</td>
			<td>PBX-RF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4A Fuses</td>
			<td>Radio Shack</td>
			<td>2701026</td>
			<td>Equivalent fuses will work as well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DB25 Male to Male Cable</td>
			<td>Probotix</td>
			<td>DB25-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USB-A to USB-B Cable</td>
			<td>Staples</td>
			<td>2094915</td>
			<td>Equivalent cable will work as well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-Pin Amphenol Connectors Male and Female</td>
			<td>Mouser</td>
			<td>654-97-3100A-20-7P and 654-97-3106A20-7S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stepper Motor</td>
			<td>Probotix</td>
			<td>HT23-420-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Right Hand Lead Screw</td>
			<td>Roton</td>
			<td>60722</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Left Hand Lead Screw</td>
			<td>Roton</td>
			<td>60723</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screws</td>
			<td>McMaster Carr</td>
			<td>92196A151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neoprene Rubber</td>
			<td>McMaster Carr</td>
			<td>8698K51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Right Handed Flanged Lead Nut</td>
			<td>Roton</td>
			<td>91962</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Left Handed Flanged Lead Nut</td>
			<td>Roton</td>
			<td>91963</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Linux Control Computer</td>
			<td>Probotix</td>
			<td>LCNC-PC</td>
			<td>Any computer with matching specification and Linux operating system will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning bottle-top vacuum filter system</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS431097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution, 0.4 %</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fabrication of anisotropic polymeric artificial antigen presenting cells for cd8+ t cell activation

Konstgjorda antigen presenterande celler (aAPC) är en lovande plattform för immun modulering på grund av sin potenta förmåga att stimulera T-celler. Acellulärt substrat erbjuder viktiga fördelar över cell-baserat aAPC, inklusive exakt kontroll av signal presentation parametrar och fysiska egenskaper av den aAPC ytan att modulera dess interaktioner med T-celler. aAPC tillverkad av anisotropisk partiklar, särskilt elliptiskt partiklar, har visat sig vara effektivare än sina sfäriska motsvarigheter på stimulera T-celler på grund av ökad bindning och större yta tillgänglig för T-cell kontakta, samt som minskad ospecifik upptag och förbättrad farmakokinetiska egenskaper. Trots ökade intresset Anisotrop partiklar, accepterade även allmänt metoder för att producera Anisotrop partiklar såsom tunnfilms-stretching kan vara svårt att införa och använda reproducibly.
I detta syfte vi beskriva ett protokoll för snabb, standardiserad tillverkning av biologiskt nedbrytbara Anisotrop partikel-baserade aAPC med avstämbara storlek, form och signalera presentation för T-cell expansion ex vivo eller in-vivo, tillsammans med metoder för att karakterisera deras storlek, morfologi och ytan protein innehåll, och att bedöma deras funktionalitet. Detta synsätt att fabricera Anisotrop aAPC är skalbar och reproducerbara, vilket gör den idealisk för att skapa aAPC för ”off-the-shelf” immunterapier.

En schematisk för automatiserad 2D tunn film stretching enheten ges i figur 1. En schematisk och beskrivning för en 1D tunn film stretching enheten ges i Ho et al.17 båren är tillverkad av aluminum delar använder standard fräsning och bearbetning tekniker. Liknar båren 1D, 2D båren består av metalliskt grepp och gejdrar. Dubbelriktad bly skruvar används för att översätta linjär till roterande rörelse. Bly skruvarna är b...

Watch this Scientific Journal Video about Fabrication of Anisotropic Polymeric Artificial Antigen Presenting Cells for CD8+ T Cell Activation at JoVE.com

Fabrication of Anisotropic Polymeric Artificial Antigen Presenting Cells for CD8+ T Cell Activation

Här presenterar vi ett protokoll för att snabbt och reproducibly generera biologiskt inspirerad, biologiskt nedbrytbar dagsljus antigenpresenterande celler (aAPC) med avstämbara storlek, form och yta protein presentation för T-cell expansion ex vivo eller in vivo .

Tillverkning av anisotropisk polymera konstgjorda antigenpresenterande celler CD8 + T Cell aktivering

Artificial antigen presenting cells (aAPC) are a promising platform for immune modulation due to their potent ability to stimulate T cells. Acellular ...

Denna metod kan hjälpa till att besvara viktiga frågor inom det aminotekniska området. Såsom, vad är den roll som partikel fysiska egenskaper på biomaterial immun cell interaktioner och aktivering. Den största fördelen med denna teknik är att den möjliggör en oberoende kontroll av storleken och formen av biomimetiska partiklar.Konsekvenserna av denna teknik sträcker sig mot behandling av cancer eftersom det är en från hyllan partikelterapi som kan orsaka in vivo cell medierad immunsvar. Även om denna metod kan ge insikt i cancer aminoterapi, det kan också tillämpas på andra system. Såsom, infektionssjukdom eller typ ett diabetes.För mikro-partikelsyntes, börja med att väga ut 100 milligram poly(mjölksyra-co-glykolsyra)eller PLGA, till en scintillationsflaska och lösa upp PLGA i fem milliliter av diklormetan genom vortexing. Placera en homogenisator i en bägare som innehåller 50 milliliter 1%polyvinylalkohol, eller PVA-lösning, så att homogenisatoren är så nära bägarens botten som möjligt utan att vidröra den. Sätt på homogenisatorn till lämplig hastighet och lägg plga-lösningen i bägaren under en minuts homogenisering.I slutet av homogeniseringen häller du den polyvinylalkohol PLGA mikropartikellösningen i en bägare innehållande 100 milliliter 5%PVA-lösning på en omrörningsplatta i en kemisk huva och rör om lösningen i minst fyra timmar. När lösningsmedlet har avdunstat, häll partikellösningen i 50 milliliter koniska rör och samla partiklarna genom centrifuger. Ersätt supernatanten i varje rör med 20 milliliter avjoniserat vatten och åter upphäva partiklarna genom att virveln.Ta sedan med den slutliga volymen i varje rör upp till 50 milliliter med färskt avjoniserat vatten och tvätta partiklarna ytterligare två gånger som bara visats. För nano-partikelsyntes, lös 200 milligram PLGA i fem milliliter av diklormetan och placera en sonicator sond i en bägare som innehåller 50 milliliter av 1%PVA lösning på is utan att vidröra botten av bägaren. Börja ultraljudsbehandling på 12 watt och omedelbart lägga plga lösningen i bägaren för en två minuters ultraljudsbehandling för att generera nano-partiklar med en ungefärlig 200 nanometer diameter.Efter ultraljudsbehandling, häll 1%polyvinylalkohol PLGA nano-partikellösning i en bägare som innehåller 100 milliliter 5 PVA-lösning på en stir plate för fyra timmars lösningsmedelsavdunstning i en kemisk rökhuva. När hela lösningsmedlet är förångat, häll partikellösningen i 50 milliliter koniska rör för centrifugeringen för att avlägsna eventuella mikropartiklar och avlägsna supernatanterna. Överför sedan nano-partiklarna till hög hastighet centrifugrör för tre tvättar i avjoniserat vatten som visas.För polymer partikel fabricering, efter den sista tvätten, åter upphäva partiklarna i cirka en milliliter färskt avjoniserat vatten och tillsätt filmgjutningslösning till partiklarna till en slutlig koncentration av 2,5 milligram per milliliter partiklar. Överför partikelupphängningen i 10 milliliter alikvoter till 75 med 50 millimeter rektangulära petriskålar för endimensionell sträckning. Eller i 15 milliliter alikvoter i 100 av 100 millimeter kvadrat Petri rätter för två dimensionell stretching.Efter natten torkning i en kemisk huva, använd pincett för att ta bort filmerna och trimma kanterna med sax. För 1D-sträckning, placera de två kort kanterna på en film mellan två bitar av neoprengummi för montering på aluminiumblocken av en axel av en automatiserad tunnfilmsträckningsanordning. Använd sedan en Insexnyckel för att skruva fast metallgreppen ovanpå gummit för att hålla filmen på plats.För 2D stretching, montera alla fyra kanter på fyra aluminiumblock för att sträcka filmen på båda axlarna mäta och spela in längden på film i mellan aluminium blocken på en axel för en D stretching eller båda axlarna för 2D stretching och beräkna det avstånd som krävs för att sträcka filmen i en eller två riktningar baserat på önskad luckan stretch. Placera sedan filmen lastade stretching enhet i en ugn på 90 grader Celsius bredvid en större bägare av en liten mängd vatten för att få filmen till temperatur över 10 minuter. När sträckningen är klar, låt filmen svalna till rumstemperatur i 20 minuter.För 1D-sträckning, skär filmen ur sträckningsanordningen i kanterna. För 2D stretching, klippa ut och spara centrum torget i film som är jämnt utsträckt på båda axlarna. Placera filmerna i 50 milliliter koniska rör med högst två filmer per rör och tillsätt cirka 25 milliliter avjoniserat vatten till varje rör för virvelning.När filmerna har lösts upp, tvätta partiklarna tre gånger i avjoniserat vatten som visats. Återupphängning av partiklarna i ungefär en milliliter färskt avjoniserat vatten per rör efter den sista tvätten. Sedan frysa partiklarna på minus 80 grader Celsius i en timme eller över natten lyofilisering.Nästa morgon, åter upphäva lyophilized mikro eller nano-partiklar på 20 milligram per milliliter i nyberedda MES buffert med virvlande. Tillsätt 100 mikroliter av partikellösningen till ett polypropylenmikcentrifugrör som innehåller 900 mikroliter MES-buffert och tillsätt 100 mikroliter av nyberedda EDC NHS-lösning. Blanda partiklarna genom att virvelning och inkubera partiklarna på en inverter vid rumstemperatur i 30 minuter.I slutet av inkuberingen, samla partiklarna genom centrifugering och åter upphäva mikropartikelpellets i en milliliter PBS genom att virvelning eller åter upphäva nano-partiklarna i en milliliter av PBS med fem sekunder av ultraljudsbehandling vid två till tre watt. Lägg därefter till åtta mikrogram av en lämplig signal ett protein och 10 mikrogram antimus CD28 antikropp till mikropartiklar, eller 16 mikrogram av signalen ett protein och 20 mikrogram antimus CD28 till nano-partiklar. Ta den slutliga volymen i varje rör till 1,1 milliliter med PBS och inkubera partiklarna över natten på en inverter vid fyra grader Celsius.Nästa dag, tvätta partiklarna tre gånger i avjoniserat vatten som visats. Dessa PLGA nano och mikro-partiklar var syntetiserade med hjälp av den enda emulsion tekniker som visat och avbildas med hjälp av överföring och scanning elektronmikroskopi. Efter homogenisering, visade mikropartiklarna en genomsnittlig diameter på cirka tre mikrometer.De sfäriska mikro-partiklar hade en aspekt ranson på ungefär en, medan 1D sträckte prolate ellipsformade partiklar hade en större bildförhållande på cirka tre och en halv och 2D sträckte oblate ellipsformade partiklar hade ett bildförhållande på cirka 1,2, ungefär upprätthålla ett bildförhållande på en. Konjugation effektivitetsresultat avslöjar liknande mängder protein på ytan av sfäriska och ellipsoidal mikro-artificiell antigen presentera celler, eller AAPC och nano-AAPC, visar att protein koppling under AAPC syntes sker i en koncentration beroende sätt. Prolate ellipsoidal AAPC befanns inducera högre nivåer av T-cellproliferation vid sub-mättande doser än sfäriska AAPC med den bästa separationen uppnås vid en 01 milligram dos.Efter sju dagar, manuell räkning av T-cellerna visade att prolate ellipsformade AAPC mer effektivt stimulera T-celler jämfört med deras sfäriska motsvarigheter på mikro-och nano skala i en dos beroende sätt. Efter detta förfarande kan AAPC administreras in vivo för att mäta deras terapeutiska effekt och farmakokinetik. Efter dess utveckling, denna teknik hjälpte bana väg för forskare inom immun-engineering att utforska effekten av anisotropi på AAPC effekt.

Research

JoVE Journal

Environment

Mass Production of Genetically Modified Aedes aegypti for Field Releases in Brazil

Mass Production of Genetically Modified Aedes aegypti for Field Releases in Brazil

Massproduktion av genetiskt modifierade Aedes aegypti för fältutsläpp i Brasilien

New techniques and methods are being sought to try to win the battle against mosquitoes. Recent advances in molecular techniques have led to the ...

Measuring Fluxes of Mineral Nutrients and Toxicants in Plants with Radioactive Tracers

Att mäta flöden av mineralnäringsämnen och gifter i Växter med radioaktiva markörer

Unidirectional influx and efflux of nutrients and toxicants, and their resultant net fluxes, are central to the nutrition and toxicology of plants. ...

A Whole Cell Bioreporter Approach to Assess Transport and Bioavailability of Organic Contaminants in Water Unsaturated Systems

En hel cell Bioreporter metod för att bedöma transport och biotillgänglighet av organiska föroreningar i vatten Omättade Systems

Bioavailability of contaminants is a prerequisite for their effective biodegradation in soil. The average bulk concentration of a contaminant, however, is ...

Use of Chironomidae (Diptera) Surface-Floating Pupal Exuviae as a Rapid Bioassessment Protocol for Water Bodies

Use of Chironomidae Diptera Surface-Floating Pupal Exuviae as a Rapid Bioassessment Protocol for Water Bodies

Användning av Chironomidae (Diptera) Utanpå Flytande PUPP exuviae som en snabb Bioassessment protokoll för vattenförekomster

Rapid bioassessment protocols using benthic macroinvertebrate assemblages have been successfully used to assess human impacts on water quality. ...

Extraction of Structural Extracellular Polymeric Substances from Aerobic Granular Sludge

Utvinning av struktur extracellulär polymera substanser från Aerobic Granular Slam

To evaluate and develop methodologies for the extraction of gel-forming extracellular polymeric substances (EPS), EPS from aerobic granular sludge (AGS) ...

Functionalization and Dispersion of Carbon Nanomaterials Using an Environmentally Friendly Ultrasonicated Ozonolysis Process

Funktionalisering och dispersion av karbonnanomaterial med användning av en miljövänlig ultraljudsbehandling med ozonolys

Functionalization of carbon nanomaterials is often a critical step that facilitates their integration into larger material systems and devices. In the ...

Ecosystem Fabrication (EcoFAB) Protocols for The Construction of Laboratory Ecosystems Designed to Study Plant-microbe Interactions

Ecosystem Fabrication EcoFAB Protocols for The Construction of Laboratory Ecosystems Designed to Study Plant-microbe Interactions

Ekosystemet Fabrication (EcoFAB) protokoll för byggandet av laboratoriet ekosystem för att studera växt-mikrobinteraktioner

Beneficial plant-microbe interactions offer a sustainable biological solution with the potential to boost low-input food and bioenergy production. A ...

A Strain Gauge Monitor (SGM) for Continuous Valve Gape Measurements in Bivalve Molluscs in Response to Laboratory Induced Diel-cycling Hypoxia and pH

A Strain Gauge Monitor SGM for Continuous Valve Gape Measurements in Bivalve Molluscs in Response to Laboratory Induced Diel-cycling Hypoxia and pH

En töjningsmätaren Monitor (SGM) för kontinuerlig ventil gapa mätningar i tvåskaliga blötdjur som svar på laboratoriet inducerad Diel-cykling hypoxi och pH

An inexpensive, laboratory-based, strain gauge valve gape monitor (SGM) was developed to monitor the valve gape behavior of bivalve molluscs in response ...

Bioindication Testing of Stream Environment Suitability for Young Freshwater Pearl Mussels Using In Situ Exposure Methods

Bioindication Testing of Stream Environment Suitability for Young Freshwater Pearl Mussels Using In Situ Exposure Methods

Bioindication provning av Stream miljö lämplighet för ung sötvatten pärla musslorna med i Situ exponering metoder

Knowledge of habitat suitability for freshwater mussels is an important step in the conservation of this endangered species group. We describe a protocol ...

Cultivation of Green Microalgae in Bubble Column Photobioreactors and an Assay for Neutral Lipids

Odling av grön mikroalg i bubbla kolumn Photobioreactors och ett test för neutrala lipider

There is significant interest in the study of microalgae for engineering applications such as the production of biofuels, high value products, and for the ...