Name: fabrication of anisotropic polymeric artificial antigen presenting cells for cd8+ t cell activation
Uploaded: 2018-10-12T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fabrication of Anisotropic Polymeric Artificial Antigen Presenting Cells for CD8+ T Cell Activation at JoVE.com

EBA (DGE-1746891) ve KRR (DGE-1232825) NSF yüksek lisans araştırma bursu program destek için teşekkür ederim. RAM teşekkür Ulusal Araştırma hizmet ödülü NIH ncı F31 (F31CA214147) ve üniversite bilim adamları burs desteği için başarı ödülleri. Yazarlar teşekkür NIH (R01EB016721 ve R01CA195503), körlüğü James önlemek ve Carole ücretsiz Catalyst Ödülü, araştırma ve destek için kanserli hastalarda JHU Bloomberg-Kimmel Enstitüsü.

Tüm yöntem tanımlamak burada kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC) Johns Hopkins Üniversitesi tarafından onaylanmıştır.
1. küresel PLGA parçacıklar Tunable boyutta imalatı
<ol><li>Parçacık sentezi için malzeme hazırlanması<ol>
<li>% 5 w/w Polivinil alkol (PVA) çözüm hazırlamak.<ol>
<li>Bir Erlenmeyer şişesi bir manyetik heyecan çizgiyle 500 mL deiyonize (DI) su ekleyin ve elektrikli karıştırıcı 500 rpm ve monitör sıcaklık termometre ile yerleşt...

<ol>
	<li>Eggermont, L. J., Paulis, L. E., Tel, J., Figdor, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+efficient+cancer+immunotherapy:+Advances+in+developing+artificial+antigen-presenting+cells.">Towards efficient cancer immunotherapy: Advances in developing artificial antigen-presenting cells.</a> Trends in Biotechnology. 32 (9), 456-465 (2014).</li><li>Maus, M. V., Riley, J. L., Kwok, W. W., Nepom, G. T., June, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HLA+tetramer-based+artificial+antigen-presenting+cells+for+stimulation+of+CD4++T+cells.">HLA tetramer-based artificial antigen-presenting cells for stimulation of CD4+ T cells.</a> Clinical Immunology. 106 (1), 16-22 (2003).</li><li>Oelke, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+induction+and+expansion+of+antigen-specific+cytotoxic+T+cells+by+HLA-Ig-coated+artificial+antigen-presenting+cells.">Ex vivo induction and expansion of antigen-specific cytotoxic T cells by HLA-Ig-coated artificial antigen-presenting cells.</a> Nature Medicine. 9 (5), 619-624 (2003).</li><li>Rudolf, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potent+costimulation+of+human+CD8+T+cells+by+anti-4-1BB+and+anti-CD28+on+synthetic+artificial+antigen+presenting+cells.">Potent costimulation of human CD8 T cells by anti-4-1BB and anti-CD28 on synthetic artificial antigen presenting cells.</a> Cancer Immunology, Immunotherapy. 57 (2), 175-183 (2008).</li><li>Tham, E. L., Jensen, P. L., Mescher, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+antigen-specific+T+cells+by+artificial+cell+constructs+having+immobilized+multimeric+peptide-class+I+complexes+and+recombinant+B7-Fc+proteins.">Activation of antigen-specific T cells by artificial cell constructs having immobilized multimeric peptide-class I complexes and recombinant B7-Fc proteins.</a> Journal of Immunological Methods. 249 (1-2), 111-119 (2001).</li><li>Perica, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+field-induced+T+cell+receptor+clustering+by+nanoparticles+enhances+T+cell+activation+and+stimulates+antitumor+activity.">Magnetic field-induced T cell receptor clustering by nanoparticles enhances T cell activation and stimulates antitumor activity.</a> ACS Nano. 8 (3), 2252-2260 (2014).</li><li>Steenblock, E. R., Fadel, T., Labowsky, M., Pober, J. S., Fahmy, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+artificial+antigen-presenting+cell+with+paracrine+delivery+of+IL-2+impacts+the+magnitude+and+direction+of+the+T+cell+response.">An artificial antigen-presenting cell with paracrine delivery of IL-2 impacts the magnitude and direction of the T cell response.</a> The Journal of Biological Chemistry. 286 (40), 34883-34892 (2011).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paracrine+release+of+IL-2+and+anti-CTLA-4+enhances+the+ability+of+artificial+polymer+antigen-presenting+cells+to+expand+antigen-specific+T+cells+and+inhibit+tumor+growth+in+a+mouse+model.">Paracrine release of IL-2 and anti-CTLA-4 enhances the ability of artificial polymer antigen-presenting cells to expand antigen-specific T cells and inhibit tumor growth in a mouse model.</a> Cancer Immunology, Immunotherapy. 66 (9), 1229-1241 (2017).</li><li>Mescher, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+contact+requirements+for+activation+of+cytotoxic+T+lymphocytes.">Surface contact requirements for activation of cytotoxic T lymphocytes.</a> The Journal of Immunology. 149 (7), 2402-2405 (1992).</li><li>Steenblock, E. R., Fahmy, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+platform+for+ex+vivo+T-cell+expansion+based+on+biodegradable+polymeric+artificial+antigen-presenting+cells.">A comprehensive platform for ex vivo T-cell expansion based on biodegradable polymeric artificial antigen-presenting cells.</a> Molecular Therapy. 16 (4), 765-772 (2008).</li><li>Fifis, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size-dependent+immunogenicity:+therapeutic+and+protective+properties+of+nano-vaccines+against+tumors.">Size-dependent immunogenicity: therapeutic and protective properties of nano-vaccines against tumors.</a> The Journal of Immunology. 173 (5), 3148-3154 (2004).</li><li>Sunshine, J. C., Perica, K., Schneck, J. P., Green, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Particle+shape+dependence+of+CD8++T+cell+activation+by+artificial+antigen+presenting+cells.">Particle shape dependence of CD8+ T cell activation by artificial antigen presenting cells.</a> Biomaterials. 35 (1), 269-277 (2014).</li><li>Meyer, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biodegradable+nanoellipsoidal+artificial+antigen+presenting+cells+for+antigen+specific+T-cell+activation.">Biodegradable nanoellipsoidal artificial antigen presenting cells for antigen specific T-cell activation.</a> Small. 11 (13), 1519-1525 (2015).</li><li>Champion, J. A., Katare, Y. K., Mitragotri, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Particle+shape:+a+new+design+parameter+for+micro-+and+nanoscale+drug+delivery+carriers.">Particle shape: a new design parameter for micro- and nanoscale drug delivery carriers.</a> Journal of Controlled Release. 121 (1-2), 3-9 (2007).</li><li>Meyer, R. A., Meyer, R. S., Green, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+automated+multidimensional+thin+film+stretching+device+for+the+generation+of+anisotropic+polymeric+micro-+and+nanoparticles.">An automated multidimensional thin film stretching device for the generation of anisotropic polymeric micro- and nanoparticles.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 103 (8), 2747-2757 (2015).</li><li>Ho, C. C., Keller, A., Odell, J. A., Ottewill, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+monodisperse+ellipsoidal+polystyrene+particles.">Preparation of monodisperse ellipsoidal polystyrene particles.</a> Colloid and Polymer Science. 271 (5), 469-479 (1993).</li><li>Shum, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet+microfluidics+for+fabrication+of+non-spherical+particles.">Droplet microfluidics for fabrication of non-spherical particles.</a> Macromolecular Rapid Communications. 31 (2), 108-118 (2010).</li><li>Lan, W., Li, S., Xu, J., Luo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controllable+preparation+of+nanoparticle-coated+chitosan+microspheres+in+a+co-axial+microfluidic+device.">Controllable preparation of nanoparticle-coated chitosan microspheres in a co-axial microfluidic device.</a> Lab on a Chip. 11 (4), 652-657 (2011).</li><li>Yang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+synthesis+of+multifunctional+Janus+particles+for+biomedical+applications.">Microfluidic synthesis of multifunctional Janus particles for biomedical applications.</a> Lab on a Chip. 12 (12), 2097-2102 (2012).</li><li>Zhou, Z., Anselmo, A. C., Mitragotri, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+protein-based,+rod-shaped+particles+from+spherical+templates+using+layer-by-layer+assembly.">Synthesis of protein-based, rod-shaped particles from spherical templates using layer-by-layer assembly.</a> Advanced Materials. 25 (19), 2723-2727 (2013).</li><li>Jang, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Striped,+ellipsoidal+particles+by+controlled+assembly+of+diblock+copolymers.">Striped, ellipsoidal particles by controlled assembly of diblock copolymers.</a> Journal of the American Chemical Society. 135 (17), 6649-6657 (2013).</li><li>Petzetakis, N., Dove, A. P., O'Reilly, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cylindrical+micelles+from+the+living+crystallization-driven+self-assembly+of+poly(lactide)-containing+block+copolymers.">Cylindrical micelles from the living crystallization-driven self-assembly of poly(lactide)-containing block copolymers.</a> Chemical Science. 2 (5), 955-960 (2011).</li><li>Rolland, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+fabrication+and+harvesting+of+monodisperse,+shape-specific+nanobiomaterials.">Direct fabrication and harvesting of monodisperse, shape-specific nanobiomaterials.</a> Journal of the American Chemical Society. 127 (28), 10096-10100 (2005).</li><li>Meyer, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anisotropic+biodegradable+lipid+coated+particles+for+spatially+dynamic+protein+presentation.">Anisotropic biodegradable lipid coated particles for spatially dynamic protein presentation.</a> Acta Biomaterialia. 72, 228-238 (2018).</li></ol>

Bu iletişim kuralı anizotropik polimer parçacıkları kesin üretimi için çok yönlü bir yöntemi ayrıntıları. Ölçeklenebilir, tekrarlanabilir ve ucuz burada açıklanan tekniği uzanan ince filmidir. Yönbağımlı parçacıklar üretmek için alternatif teknikleri yüksek maliyetli, düşük performans ve sınırlı partikül boyutu da dahil olmak üzere birçok sınırlamalar acı. Yaklaşım uzanan ince film parçacıklar sonra sentez anizotropik olmak değiştirilir de avantajlı çünkü ve sonuç olarak...

Onlar sağlam antijen spesifik T hücre yanıt oluşturabilir çünkü yapay antijen sunan hücreler (aAPC) immunomodulatory ajanları olarak söz göstermiştir. Bu platformlar için temel yeteneklerini çok önemli sinyaller T Hücre aktivasyonu için verimli bir şekilde sunmak için vardır. Acellular aAPC çünkü onlar daha kolay ve daha az maliyetli imal, ölçek-up ve çeviri sırasında daha az sorunlarla karşı karşıya ve hücre tabanlı terapiler ile ilgili riskleri hafifletmek hücre tabanlı aAPC için cazip bir alternatif vardır. Acellular aAPC de yüksek derecede sinyal sunu parametreleri üzerinde kontrol ve T hücreleri1ile arayüzü yüzey fiziksel özellikleri için izin verir.
aAPC iki sinyal T Hücre aktivasyonu için gerekli en az özetlemek gerekir. Sinyal 1 antijen tanıma sağlar ve T hücre reseptör (TCR) tanır ve ben ya da karmaşık TCR sinyal sonuçlanan soydaş, antijen taşıyan II MHC sınıf ile yürütmektedir oluşur. Antijen özgüllük gereksinimi atlamak için aAPC sistemleri genellikle karşı nonspecifically TCR karmaşık uyarır CD3 reseptör agonistik bir monoklonal antikor ayı. MHC, özellikle MHC multimers, rekombinant formları da aAPC yüzeyinde antijen özgüllük2,3sağlamak için kullanılmıştır. Sinyal 2 T hücre etkinliği yönlendirir costimulatory bir sinyalidir. 4-1BB gibi diğer costimulatory reseptörleri başarıyla hedeflenen4olmasına rağmen costimulation T Hücre aktivasyonu için gerekli sağlamak için CD28 reseptör genellikle aAPC yüzeyi üzerinde sunulan agonistik bir antikor ile uyarılır. 1 ve 2 sinyal proteinleri genellikle aAPC sentezlemek için katı parçacıklar yüzeyinde immobilize. Tarihsel olarak, aAPC polistren4,5 ve demir dextran6gibi malzemelerin çeşitli fabrikasyon. Daha yeni sistemleri yararlanmak poli (laktik-co-Glikolik asit) gibi biyobozunur polimerler (PLGA) kolayca proteinler sinyal birleştiğinde, doğrudan yönetim içinde vivoiçin uygundur ve sürekli serbest bırakılması kolaylaştırabilir aAPC oluşturmak için sitokinler veya T hücre harekete geçirmek7,8ek olarak çözünür faktörler kapsüllenir.
Gerekli sinyal proteinleri varlığı ek olarak, yeterince büyük yüzey alanı üzerinden reseptör nişan aAPC/T hücre etkileşim sırasında T Hücre aktivasyonu için gereklidir. Böylece, aAPC boyutu ve şekli gibi fiziksel parametrelerini büyük ölçüde onların mevcut temas bölgesinin değiştirmek ve T hücreleri uyarmak için yeteneklerini etkiler. Mikron büyüklüğünde aAPC gösterilmiştir uyarıcı T hücreleri onların nano karşıtları9,'10dan daha etkili olduğu. Ancak, nano-aAPC üstün biodistribution ve onların performans vivo içinde mikro-aAPC11üzerinde artırabilir lenf düğümleri için daha iyi drenaj olabilir. Şekil aAPC parçacık tabanlı sistemler ilgi başka bir değişkendir. Yönbağımlı aAPC son zamanlarda gösterilmiştir uyarıcı T hücreleri, özellikle hedef hücreleri azaltılmış belirsiz hücre alımı ile birleştiğinde ile gelişmiş etkileşim nedeniyle izotropik parçacıklar daha etkili olmak. Hücreler tercihen ellipsoidal parçacıklar uzun eksene bağlamak ve eğrilik ve düz yüzey daha büyük yarıçapı izin aAPC ve T hücre12arasında daha fazla temas için. Ellipsoidal parçacıklar uzun ekseninin aynı zamanda küresel parçacıklar vivo içinde Yönetim12,13takip göre artan dolaşım zaman sonuçlanan fagositoz, teşvik etmemektedir. Bu avantajlar nedeniyle ellipsoidal parçacıkların mikro ve nanoscales12efekti gözlenen antijen spesifik T hücreleri vitro ve in vivo küresel parçacıklar için karşılaştırıldığında daha fazla genişlemesi aracılık, 13. Yönbağımlı partikülleri imal etmek çeşitli strateji vardır, ama ince film germe farklı parçacık şekil14bir dizi oluşturmak için kullanılan basit, yaygın olarak kabul gören bir yöntem olduğunu. Sentez, parçacıklar filmlerine döküm ve bir veya iki boyutlu bir sıcaklık parçacık malzeme cam geçiş sıcaklığı yukarıda gergin. Filmin ardından parçacıkları almak için tasfiye edilir. Yönbağımlı parçacıklar ilgi büyüyen rağmen imalatı parçacık tabanlı aAPC için geçerli yaklaşımlar çoğunlukla izotropik sistemleri ile sınırlı ve parçacık şekil değiştirme yöntemleri uygulamak zor, bazı aAPC sentezi ile uyumsuz olabilir stratejileri ve -sizlik çekmek-hassasiyet ve tekrarlanabilirlik15. Bizim ince film germe tekniği el ile gerçekleştirilen veya bir ya da iki boyutları15dakika sonra istenen bir en boy oranı hızla anizotropik parçacıklar biyobozunur polimerler çeşitli sentez oluşturmak için bir otomatik biçimde, gergin.
Bizim önceki çalışmaları temel, geliştirdiğimiz içinde hızla T hücre genişletme ex vivo veya için standart bir biçimde aAPC ayarlanabilir boyutu ve şekli oluşturmak için ölçeklenebilir ince film germe teknoloji ile birlikte biyolojik bir parçacık dayalı yaklaşım Vivo. Protein konjugasyon stratejimiz bu aAPC sistemi yüksek oranda esneklik veren karboksil grupları için istenen bir yoğunluk, parçacık yüzeyinde herhangi bir protein(s) ilgi çift için kullanılabilir. Ayrıca boyutu, Morfoloji ve yüzey protein aAPC içerik karakterize ve onların işlevselliği vitrodeğerlendirmek için yöntemleri açıklar. Bu iletişim kuralı bağışıklık hücreleri ex vivo veya vivo içinde çeşitli immunotherapeutic uygulamalar için genişletmek için kolayca adapte edilebilir.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Poly(vinyl alcohol), MW 25000, 88% hydrolyzed</td>
			<td>Polysciences, Inc.</td>
			<td>02975-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Thermometer</td>
			<td>Fluke</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Model name: Fluke 52 II</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersion Temperature Probe</td>
			<td>Fluke</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Model name: Fluke 80PK 22</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Hotplate &#38; Stirrer</td>
			<td>Benchmark Scientific</td>
			<td>H3760-HS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multipoint stirrer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>50093538</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Resomer RG 504 H, Poly(D,L-lactide-co-glycolide)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>719900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichloromethane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D65100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homogenizer</td>
			<td>IKA</td>
			<td>&#160;0003725001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>Sonics &#38; Materials, Inc.</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Model number: VC 505</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator sound abating enclosure</td>
			<td>Sonics &#38; Materials, Inc.</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Part number: 630-0427</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator probe</td>
			<td>Sonics &#38; Materials, Inc.</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Part number: 630-0220</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator microtip</td>
			<td>Sonics &#38; Materials, Inc.</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Part number: 630-0423</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High speed centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Model number: J-20XP (discontinued), alternative model: J-26XP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High speed centrifuge rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>369691</td>
			<td>Model number: JA-17</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High speed polycarbonate centrifuge tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>3118-0050</td>
			<td>50 mL, screw cap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rectangular disposable petri dish</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>25384-322</td>
			<td>75 x 50 x 10 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Square disposable petri dish</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>10799-140</td>
			<td>100 mm x 100 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LEAF&#160;Purified anti-mouse CD3&#949; Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>InVivoMab anti-mouse CD28, clone 37.51</td>
			<td>Bio X Cell</td>
			<td>BE0015-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-(3-Dimethylaminopropyl)-N&#8242;-ethylcarbodiimide hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E6383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Hydroxysulfosuccinimide sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>56485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3671</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 anti-mouse CD3 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-mouse CD28 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>102109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning&#160;96 Well Solid Polystyrene Microplate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS3915</td>
			<td>flat bottom, black polystyrene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein LoBind Tubes, 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22431081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Medium (+ L-Glutamine)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11875093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F4135</td>
			<td>Heat Inactivated, sterile-filtered</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ciprofloxacin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>17850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human IL-2 (carrier-free)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>589102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate (100 mM)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11360070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Vitamin Solution (100X)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11120052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD8a+&#160;T Cell Isolation Kit, mouse</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-104-075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>C34554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS Columns</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MidiMACS Separator</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-042-302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS Multistand</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-042-303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Cytometer</td>
			<td>Accuri C6</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synergy 2 Multi-Detection Microplate Reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>autoMACS Running Buffer</td>
			<td>Miltenyi BIotech</td>
			<td>130-091-221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>22363548</td>
			<td>Sterile, 70 &#181;m nylon mesh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACK Lysing Buffer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A1049201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6J (Black 6) Mouse</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>000664</td>
			<td>Male, at least 7 weeks old</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-Bottom Tissue Culture Plates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>353227</td>
			<td>Sterile, 96-well tissue culture treated polystyrene plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 V DC Power Supply</td>
			<td>Probotix</td>
			<td>LPSK-4010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE Coated Wire</td>
			<td>Mouser</td>
			<td>602-5858-100-01</td>
			<td>This is for a 100 ft. spool but an equivalent wire will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stepper Motor Driver</td>
			<td>Probotix</td>
			<td>MondoStep5.6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IDC Connector Kit</td>
			<td>Probotix</td>
			<td>IDCM-10-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcontroller</td>
			<td>Probotix</td>
			<td>PBX-RF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4A Fuses</td>
			<td>Radio Shack</td>
			<td>2701026</td>
			<td>Equivalent fuses will work as well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DB25 Male to Male Cable</td>
			<td>Probotix</td>
			<td>DB25-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USB-A to USB-B Cable</td>
			<td>Staples</td>
			<td>2094915</td>
			<td>Equivalent cable will work as well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-Pin Amphenol Connectors Male and Female</td>
			<td>Mouser</td>
			<td>654-97-3100A-20-7P and 654-97-3106A20-7S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stepper Motor</td>
			<td>Probotix</td>
			<td>HT23-420-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Right Hand Lead Screw</td>
			<td>Roton</td>
			<td>60722</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Left Hand Lead Screw</td>
			<td>Roton</td>
			<td>60723</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screws</td>
			<td>McMaster Carr</td>
			<td>92196A151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neoprene Rubber</td>
			<td>McMaster Carr</td>
			<td>8698K51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Right Handed Flanged Lead Nut</td>
			<td>Roton</td>
			<td>91962</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Left Handed Flanged Lead Nut</td>
			<td>Roton</td>
			<td>91963</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Linux Control Computer</td>
			<td>Probotix</td>
			<td>LCNC-PC</td>
			<td>Any computer with matching specification and Linux operating system will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning bottle-top vacuum filter system</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS431097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution, 0.4 %</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fabrication of anisotropic polymeric artificial antigen presenting cells for cd8+ t cell activation

Yapay antijen sunan hücreler (aAPC) T hücreleri uyarmak için güçlü yeteneklerini nedeniyle bağışıklık modülasyonu için umut verici bir platform vardır. Acellular yüzeylerde sinyal sunu parametrelerinin kesin kontrol ve T hücreleri ile olan etkileşimleri modüle için aAPC yüzeyinin fiziksel özellikleri de dahil olmak üzere aAPC, hücre tabanlı anahtar avantajlar sunuyor. Yönbağımlı parçacıkları, inşa aAPC özellikle ellipsoidal parçacıklar, küresel karşılıkları, uyarıcı T hücreleri artan bağlama ve daha büyük yüzey alanı T hücre için kullanılabilir nedeniyle de ilgili kişi, daha etkili olduğu gösterilmiştir olarak nonspesifik alımı ve gelişmiş farmakokinetik özellikleri azaltılmış. Yönbağımlı parçacıklar artan ilgi rağmen bile yaygın ince film germe uygulamak ve tekrarlanarak zor olabilir gibi anizotropik parçacıklar yöntemleri kabul.
Bu amaçla, biyolojik olarak parçalanabilen anizotropik parçacık tabanlı aAPC tunable boyut, şekil, ile hızlı, standart imalatı için bir iletişim kuralı tanımlamak ve sunum T hücre genişletme ex vivo ve in vivo, yöntemleri için birlikte için sinyal onların boyutu, Morfoloji ve yüzey protein içeriği, karakterize ve işlevselliğini değerlendirmek için. Yönbağımlı aAPC imalatı bu ölçeklenebilir ve tekrarlanabilir, aAPC için "kapalı" immunotherapies üretmek için ideal hale yaklaşımdır.

Bir şematik cihaz germe otomatik 2D ince film için Şekil 1' de verilmiştir. Bir şematik ve aygıt uzanan ince bir 1 D film için açıklama sedye Alüminyum parçalar standart frezeleme ve işleme teknikleri kullanarak inşa edilmiştir Ho ve ark.17 verilir. Benzer şekilde 1D sedye, 2D sedye metalik kulpları ve kılavuz raylar oluşur. Çift yönlü Kurşun vidalar için dönme hareketi doğrusal çevirmek için kullanılır. Ku...

Watch this Scientific Journal Video about Fabrication of Anisotropic Polymeric Artificial Antigen Presenting Cells for CD8+ T Cell Activation at JoVE.com

Fabrication of Anisotropic Polymeric Artificial Antigen Presenting Cells for CD8+ T Cell Activation

Burada, hızlı ve tekrarlanarak ayarlanabilir boyutu, şekli ve yüzey proteini tanıtımı için T hücre genişletme ex vivo veya içinde vivo hücre (aAPC) sunan biyolojik ilham, biyolojik olarak parçalanabilen articifical antijen üretmek için bir iletişim kuralı mevcut .

Yönbağımlı polimer yapay antijen hücreleri CD8 + T Hücre aktivasyonu için sunma imalatı

Artificial antigen presenting cells (aAPC) are a promising platform for immune modulation due to their potent ability to stimulate T cells. Acellular ...

Bu yöntem, amino-mühendislik alanında anahtar soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Gibi, biyomalzeme bağışıklık hücresi etkileşimleri ve aktivasyonu parçacık fiziksel özelliklerinin rolü nedir. Bu tekniğin en büyük avantajı, biyomimetik parçacıkların boyutu ve şeklinin bağımsız bir şekilde kontrol edilmesini sağlamasıdır.Bu tekniğin etkileri in vivo hücre aracılı bağışıklık yanıtları neden olabilir bir raf parçacık tedavisi olarak kanser tedavisi doğru uzanır. Bu yöntem kanser amino tedavisi içine fikir sağlayabilir rağmen, aynı zamanda diğer sistemlere uygulanabilir. Bulaşıcı hastalık veya Tip 1 diyabet gibi.Mikro parçacık sentezi için, 100 miligram poli (laktik-co-glikolik asit) veya PLGA tartılarak, bir sintillasyon vial içine başlar ve girdap ile diklorotan beş mililitre PLGA eriterek. Homogenizer%1 polivinil alkol veya PVA çözeltisi 50 mililitre içeren bir kabın içine bir homogenizer yerleştirin, böylece homogenizer ona dokunmadan kabın altına mümkün olduğunca yakın olur. Homogenizer'i uygun hızda açın ve bir dakikalık homojenizasyon için PLGA çözeltisini kabına ekleyin.Homojenizasyon sonunda, polivinil alkol PLGA mikro parçacık solüsyonu bir kabın içine dökün 100 mililitre 5% PVA çözeltisi içeren bir kimyasal başlık bir karıştırma plakası üzerinde ve en az dört saat boyunca çözelti karıştırın. Çözücü buharlaştığında, parçacık çözeltisini 50 mililitrelik konik tüplere dökün ve parçacıkları santrifüj le toplayın. Her tüpteki süpernatantı 20 mililitre de-iyonize su ile değiştirin ve girdap yaparak parçacıkları yeniden askıya alın.Daha sonra her tüpteki son hacmi 50 mililitreye kadar taze iyonize su ile getirin ve parçacıkları sadece gösterildiği gibi iki kez daha yıkayın. Nano parçacık sentezi için, 200 miligram PLGA'yı beş mililitre diklorometan içinde çözün ve kabın dibine dokunmadan buz üzerinde 50 mililitre %1 PVA çözeltisi içeren bir sonicator probu yerleştirin. 12 watt'ta sonication başlayın ve hemen yaklaşık 200 nanometre çapı ile nano parçacıklar oluşturmak için iki dakikalık sonication için kabına PLGA çözüm ekleyin.Sonication sonra, kimyasal bir duman kaputunda solvent buharlaşma dört saat boyunca bir karıştırma plakası üzerinde 5 PVA çözeltisi 100 mililitre içeren bir beher içine% 1 polivinil alkol PLGA nano-parçacık solüsyonu dökün. Tüm çözücü buharlaştığında, herhangi bir mikro parçacıklar kaldırmak ve süpernatants kaldırmak için santrifüj için 50 mililitrekonik tüpler içine parçacık çözeltisi dökün. Daha sonra nano parçacıkları yüksek hızlı santrifüj tüplere aktarın.Polimerik parçacık imalatı için, son yıkamadan sonra, yaklaşık bir mililitre taze iyonize sudaki parçacıkları yeniden askıya alır ve mililitre partikülbaşına 2,5 miligramlık son konsantrasyona parçacıklara film döküm çözeltisi ekleyin. Tek boyutlu germe için parçacık süspansiyonu 10 mililitrelik aliquots içine 75 50 milimetre dikdörtgen Petri kapları aktarın. Ya da 100'e 100 milimetre kare petri yemekleri içine 15 mililitre aliquots iki boyutlu germe için.Bir kimyasal başlık içinde bir gecede kurutma sonra, filmleri kaldırmak ve makas ile kenarları kırpmacı kullanın. 1D germe için, otomatik ince film germe cihazının bir ekseninin alüminyum bloklarına monte etmek için iki parça neopren kauçuk arasında bir filmin iki kısa kenarını yerleştirin. Daha sonra filmi yerinde tutmak için kauçuk üzerindeki metal kulpları vidalamak için bir Allen anahtarı kullanın.2B germe için, her iki eksen üzerinde film germek için dört kenarı dört alüminyum blok üzerine monte ve bir D germe veya 2D germe için her iki eksen için bir eksen üzerinde alüminyum bloklar arasında film uzunluğu kaydetmek ve istenen kat streç dayalı bir veya iki yönde film germek için gerekli mesafeyi hesaplamak. Daha sonra filmi 10 dakikadan fazla ısıya getirmek için az miktarda su daha büyük bir kabın yanına 90 santigrat derecede bir fırına film yüklü germe cihazı yerleştirin. Esneme tamamlandığında, film 20 dakika oda sıcaklığına soğumaya bırakın.1D germe için, kenarlarında germe cihazı film kesip. 2B esneme için, kesip kesin ve her iki eksen üzerinde düzgün gerilmiş filmin merkezi kare kaydedin. Filmleri tüp başına en fazla iki film içeren 50 mililitrelik konik tüplere yerleştirin ve girdap için her tüpe yaklaşık 25 mililitre iyonize su ekleyin.Filmler eridiğinde, parçacıkları üç kez iyonize suda yıkayın. Son yıkamadan sonra tüp başına yaklaşık bir mililitre taze iyonize su parçacıkları yeniden askıya. Daha sonra eksi 80 derecede bir saat veya bir gecede lyophilization parçacıklar dondurun.Ertesi sabah, yeni hazırlanmış MES tampon girdap ile mililitre başına 20 miligram lyophilized mikro veya nano parçacıklar yeniden askıya. 900 mikrolitre MES tamponu içeren polipropilen mikro santrifüj tüpüne parçacık çözeltisinin 100 mikrolitresini ekleyin ve 100 mikrolitre taze hazırlanmış EDC NHS çözeltisi ekleyin. 30 dakika boyunca oda sıcaklığında bir invertör üzerinde parçacıkları girdap ve kuluçka parçacıkları karıştırın.Kuluçka sonunda, parçacıkları santrifüj le toplayın ve pbs'nin bir mililitresindeki mikro parçacık peletlerini girdaplayarak veya nano parçacıkları pBS'nin bir mililitresinde iki ila üç watt'ta beş saniye sonication ile yeniden askıya alarak yeniden askıya alın. Daha sonra, mikro parçacıklara sekiz mikrogram uygun bir sinyal bir protein ve 10 mikrogram anti fare CD28 antikor veya nano parçacıklara bir protein ve 20 mikrogram anti fare CD28 mikrogramı ekleyin. PBS ile 1.1 mililitre her tüpte son hacmi getirin ve dört santigrat derece bir inverter üzerinde bir gecede parçacıkları kuluçka.Ertesi gün, gösterildiği gibi de-iyonize suda parçacıkları üç kez yıkayın. Bu PLGA nano ve mikro parçacıklar, iletim ve taramalı elektron mikroskobu kullanılarak gösterildiği gibi tek emülsiyon teknikleri kullanılarak sentezlendi. Homojenizasyondan sonra mikro parçacıklar ortalama üç mikrometre çapında bir çap gösterdiler.Küresel mikro parçacıklar yaklaşık bir boy oranı vardı, 1D genişletilmiş prolate elipsoidal parçacıklar yaklaşık üç buçuk daha büyük bir boy oranına sahip iken ve 2D gerilmiş oblipsoidal parçacıklar yaklaşık 1.2 bir enboy oranı vardı, kabaca bir en boy oranı koruyarak. Konjugasyon verimliliği sonuçları küresel ve elipsoidal mikro-yapay antijen sunan hücreler yüzeyinde protein benzer miktarda ortaya, veya AAPC ve nano-AAPC, AAPC sentezi sırasında protein kaplin konsantrasyonbağımlı bir şekilde meydana geldiğini gösteren. Prolate elipsoidal AAPC'nin 01 miligram dozda elde edilen en iyi ayırma ile küresel AAPC'den daha düşük doymak dozlarında daha yüksek düzeyde T hücre proliferasyonuna neden olduğu bulunmuştur.Yedi gün sonra, T hücrelerinin manuel sayma prolate elipsoidal AAPC daha etkili bir doz bağımlı bir şekilde mikro ve nano ölçekte küresel muadillerine göre T hücrelerini uyarmak ortaya koymuştur. Bu prosedürü takiben, AAPC onların terapötik etkinliğini ve farmakokinetiği ölçmek için in vivo administrated olabilir. Bu teknik, geliştirilmesinden sonra immüno-mühendislik alanında araştırmacıların asiztropinin AAPC etkinliği üzerindeki etkisini keşfetmelerinin önünü netti.

Research

JoVE Journal

Environment

Mass Production of Genetically Modified Aedes aegypti for Field Releases in Brazil

Mass Production of Genetically Modified Aedes aegypti for Field Releases in Brazil

Brezilya'da Saha Sürümleri için Genetiği Değiştirilmiş Aedes aegypti'nin Seri Üretimi

New techniques and methods are being sought to try to win the battle against mosquitoes. Recent advances in molecular techniques have led to the ...

Measuring Fluxes of Mineral Nutrients and Toxicants in Plants with Radioactive Tracers

Radyoaktif izleyiciler ile Bitkilerde Mineral Besin ve Toksikantların Değişimler Ölçme

Unidirectional influx and efflux of nutrients and toxicants, and their resultant net fluxes, are central to the nutrition and toxicology of plants. ...

A Whole Cell Bioreporter Approach to Assess Transport and Bioavailability of Organic Contaminants in Water Unsaturated Systems

A Whole Hücre Bioreporter Yaklaşımı Su Doymamış Sistemleri Organik Kontaminantların Taşıma ve Biyoyararlanımını Değerlendirmek için

Bioavailability of contaminants is a prerequisite for their effective biodegradation in soil. The average bulk concentration of a contaminant, however, is ...

Use of Chironomidae (Diptera) Surface-Floating Pupal Exuviae as a Rapid Bioassessment Protocol for Water Bodies

Use of Chironomidae Diptera Surface-Floating Pupal Exuviae as a Rapid Bioassessment Protocol for Water Bodies

Chironomidae (Diptera) kullanılması Yüzey Yüzer Su Organları bir Rapid Bioassessment Protokolü Pupa Exuviae

Rapid bioassessment protocols using benthic macroinvertebrate assemblages have been successfully used to assess human impacts on water quality. ...

Extraction of Structural Extracellular Polymeric Substances from Aerobic Granular Sludge

Aerobik Granül Çamur dan Yapısal Ekstrasellüler polimerik maddelerin çıkarımı

To evaluate and develop methodologies for the extraction of gel-forming extracellular polymeric substances (EPS), EPS from aerobic granular sludge (AGS) ...

Functionalization and Dispersion of Carbon Nanomaterials Using an Environmentally Friendly Ultrasonicated Ozonolysis Process

Çevre Dostu Ultrasonik Ozonoliz İşlemi Kullanarak Karbon Nanomalzemelerin İşlevsellik ve Dağılımı

Functionalization of carbon nanomaterials is often a critical step that facilitates their integration into larger material systems and devices. In the ...

Ecosystem Fabrication (EcoFAB) Protocols for The Construction of Laboratory Ecosystems Designed to Study Plant-microbe Interactions

Ecosystem Fabrication EcoFAB Protocols for The Construction of Laboratory Ecosystems Designed to Study Plant-microbe Interactions

Ekosistem imalat (EcoFAB) protokolleri laboratuvar ekosistemlerinin bitki-mikrop etkileşimleri çalışma için tasarlanmış inşası için

Beneficial plant-microbe interactions offer a sustainable biological solution with the potential to boost low-input food and bioenergy production. A ...

A Strain Gauge Monitor (SGM) for Continuous Valve Gape Measurements in Bivalve Molluscs in Response to Laboratory Induced Diel-cycling Hypoxia and pH

A Strain Gauge Monitor SGM for Continuous Valve Gape Measurements in Bivalve Molluscs in Response to Laboratory Induced Diel-cycling Hypoxia and pH

Sürekli Vana Gape ölçümlerde Toxinler yumuşakçalar laboratuvar indüklenen Diel Bisiklete binme hipoksi ve pH yanıt için Ağırlık ölçme esneklik detektörler monitör (SGM)

An inexpensive, laboratory-based, strain gauge valve gape monitor (SGM) was developed to monitor the valve gape behavior of bivalve molluscs in response ...

Bioindication Testing of Stream Environment Suitability for Young Freshwater Pearl Mussels Using In Situ Exposure Methods

Bioindication Testing of Stream Environment Suitability for Young Freshwater Pearl Mussels Using In Situ Exposure Methods

Genç tatlı su midye içinde in Situ maruz kalma yöntemlerle inci için Bioindication akış ortamı uygunluğu test

Knowledge of habitat suitability for freshwater mussels is an important step in the conservation of this endangered species group. We describe a protocol ...

Cultivation of Green Microalgae in Bubble Column Photobioreactors and an Assay for Neutral Lipids

Kabarcık sütun Photobioreactors ve bir tahlil yeşil mikroalg ekimi için nötr lipitler

There is significant interest in the study of microalgae for engineering applications such as the production of biofuels, high value products, and for the ...