Name: "liver-on-a-chip" cultures of primary hepatocytes and kupffer cells for hepatitis b virus infection
Uploaded: 2019-02-19T13:00:00
Duration: 10 min 25 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about "Liver-on-a-Chip" Cultures of Primary Hepatocytes and Kupffer Cells for Hepatitis B Virus Infection at JoVE.com

Ce travail a été financé par une subvention de démarrage de l’European Research Council (637304), un Wellcome Trust Investigator Award (104771/Z/14/Z) et par CN Bio Innovations.

<ol>
	<li>Verrier, E. R., Colpitts, C. C., Schuster, C., Zeisel, M. B., Baumert, T. 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C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+primary+human+hepatocyte+spheroids+as+a+model+system+for+drug-induced+liver+injury,+liver+function+and+disease.">Characterization of primary human hepatocyte spheroids as a model system for drug-induced liver injury, liver function and disease.</a> Scientific Reports. 6, 25187 (2016).</li><li>Tong, W. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constrained+spheroids+for+prolonged+hepatocyte+culture.">Constrained spheroids for prolonged hepatocyte culture.</a> Biomaterials. 80, 106-120 (2016).</li><li>Griffith, L. G., Wells, A., Stolz, D. 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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Les défis dans le maintien des cultures à long terme de PHH ont conduit à l’élaboration de plusieurs modèles de culture avec une fonctionnalité accrue et de la longévité, chacun présentant des inconvénients et des avantages différentiels. Il est maintenant largement reconnu que les cultures 2D statiques de PHH sont imitant certains aspects de la biologie des hépatocytes pour une quantité très limitée de temps. Ainsi, micromotifs cocultures12,13, sphéroïde cultures14,15, et16,de cultures de foie-on-a-chip 3D17 sont rapidement remplacer ces systèmes plus basiques. Surtout quand l’étude des maladies infectieuses, qui ont coévolué avec leur hôte à utiliser des micro-environnements spécifiques, l’obligation de remettre des environnements physiologiques repose sur la nature souvent difficile de culture homme-tropic maladies infectieuses, y compris les virus de l’hépatite C, le VHB et le paludisme.
L’étape la plus critique dans le cadre de cultures de foie-on-a-chip 3D est la qualité des types cellulaires initialement d’origine. Ces cellules doivent être testés pour leur capacité d’adhérence et uniquement des lots PHH plateable doivent être utilisés afin d’assurer la formation de tissu réussie et génération de culture. Même si PHH fraîchement isolée peut être utilisé, leur cryoconservation est généralement compliquée et exige spéciaux congélateurs vitesse contrôlée.
Par contraste avec les cultures conventionnelles de 2D statiques, le bagage génétique de l’hôte est négligeable en ce qui concerne la susceptibilité à l’infection par le VHB, et tous les donateurs de l’hépatocyte testés jusqu'à présent sont capables d’établir d’infection à VHB4.
Même si le patient dérivé VHB établit des infections des cultures 3D, il est impératif d’utiliser PEG-précipité et saccharose coussin purifié VHB quand utilisant inductible VHB producteur cellule lignes pour la production d’inoculum viral. Les surnageants de culture cellulaire directement appliquées aux cultures de foie-on-a-chip 3D, soit par le biais de la présence de facteurs inhibiteurs ou en raison d’une incompatibilité de facteurs de croissance présents avec les hépatocytes, ne résultent pas facilement dans l’infection. En outre, lorsque vous sélectionnez inoculum viral dérivé de patient, seulement le sérum doit être utilisé, car inévitablement, plasma coagule et obstrue la circulation de microfluidique de la plate-forme de la culture.
Indépendamment de l’inoculum viral utilisé, assurant la viabilité cellulaire et la différenciation, en plus d’assurer le retrait complet de l’inoculum initial de VHB, est la clé pour des études à long terme de l’infection. La façon la plus pratique de le faire est d’échantillonnage cultures après le retrait de l’inoculum viral, mais aussi de mesurer les niveaux de l’albumine sérique humaine tout au long de la période de culture. De note, de même pour toutes les autres plates-formes décrits, infection par le VHB, une fois établie, ne pas facilement se propage aux cellules non infectées. Le mécanisme sous-jacent pour que cela demeure difficile, étant donné que l’infection à VHB in vivo infecte facilement la plupart des hépatocytes dans le foie.
En ce qui concerne les cocultures des cellules de Kupffer et de PHH, il est conseillé d’effectuer des essais de beaucoup de cellules de Kupffer afin d’évaluer la sécrétion en réponse à la stimulation de la LPS, IL6 et TNFα puisque pas tous les donneurs de cellules de Kupffer disponibles dans le commerce ont une réactivité égale.
Ce qui est important, pour tous les traitements médicamenteux ou infection initiale des cultures par le VHB, le volume total du puits (1,4 mL), aussi bien à partir de la chaîne microfluidiques (0,2 mL), doit prendre en compte pour le calcul des concentrations de médicament ou d’un inoculum. Afin d’assurer un dosage précis, une étape de lavage avec le milieu contenant du VHB ou médicaments est effectuée pour amorcer le canal microfluidique.
La plate-forme utilisée utilise 600 000 PHH / puits, qui assure des hépatocytes multicouches dans les échafaudages. Même si le nombre de cellule peut être modifié, la concentration cellulaire choisi assure un résultat optimal. Le format de plaque détient un total de 12 échafaudages, qui peut être amélioré à 36 échafaudages. Toutefois, en raison des exigences de microfluidique, mise à l’échelle vers le haut à un nombre bien plus élevé n’est pas possible à ce jour.
Utilisant ces approches, les cultures peuvent être maintenus avec les performances de la cellule optimale pendant au moins 40 jours, qui, jusqu’ici, offre des possibilités sans précédent pour évaluer les nouveaux médicaments candidats, ainsi que l’étude de l’interaction complexe entre les différentes cellules hépatiques populations au cours de l’infection par le VHB.

L’étude du VHB a été compliquée par la mauvaise sensibilité des systèmes de culture, obligeant plusieurs centaines de milliers de copies de génome du VHB par cellule pour lancer l' infection1. En outre, des hépatocytes humains primaires sont généralement extrêmement fragiles et dédifférencient rapidement au cours des cultures classiques2. Ceci est principalement dû au fait que les surfaces en plastique plats et durs ne pas imiter les milieux extracellulaires naturels que se trouves dans le foie de l’absence générale d’oxygénation des cultures en l’absence de circulation de la microfluidique. Rapidement, des cultures d’hépatocytes statiques classiques sur des plaques recouvertes de collagène dédifférencient et perdent leur susceptibilité à l' infection de HBV3. Nous décrivons ici la mise en place et l’infection de PHH en cultures de foie-on-a-chip 3D, qui sont très avantageuses sur les cultures PHH statiques 2D classiques sur des plaques recouvertes de collagène en raison de leur compétence étendue de métabolique et fonctionnel, facilitant cultures à long terme d’au moins 40 jours4. Dans ce système, PHH sont ensemencées sur des échafauds enduit de collagène, qui sont continuellement perfusés avec milieu de culture pour fournir l’oxygène et des nutriments vers les cellules. Même si les systèmes de culture alternative pour PHH basée sur cocultures complexes de fibroblastes murins ou croissance 3D en sphéroïdes ont été validées et sont sensibles à l’infection par le VHB à l’aide des multiplicités d’infection de 500 génomes (GE) du VHB par cellule, 3D foie-on-a-chip cultures restent le système unique modèle in vitro sensible à 0,05 GE du VHB par cellule4. C’est en outre étayé par la nécessité d’utiliser des concentrations élevées de diméthylsulfoxyde (DMSO) et le polyéthylène glycol (PEG) pour établir l’infection par le VHB dans ces cultures, qui est dispensable pour l’infection des systèmes de culture de foie-on-a-chip 3D 4. parmi les principales caractéristiques du VHB, l’infection est la piscine cccDNA, constituant ainsi le modèle transcriptional pour tous de novo–produit des virions,5,6. Même si cccDNA peut être détectée dans les hépatocytes classiques cultures7,8, on ne sait pas quant à savoir si la réglementation de cccDNA et toute approche thérapeutique visant à éliminer est récapitulées dans partiellement ou hépatocytes complètement dédifférenciées. Nous avons montré que cccDNA est formé sur le plan fonctionnel dans les cultures de foie-on-a-chip 3D, répond à des stimuli physiologiques et peut être ciblé en interférant avec l’accessibilité de la machinerie transcriptionnelle au génome cccDNA4.
Réactions de l’hôte à l’infection par le VHB dans 3D imitateur de foie-on-a-chip ceux observés chez les patients infectés par le VHB, permettant l’identification de biomarqueurs de l’infection, mais aussi le succès thérapeutique. Parmi les caractéristiques uniques du foie-on-a-chip cultures est la possibilité d’évaluer à long terme h6te entre PHH et autres cellules parenchymateuses dans le foie, y compris les cellules4Kupffer, cellules étoilées9et foie sinusoïdal les cellules endothéliales10,11. Cela offre l’occasion unique pour évaluer les interactions cellule/cellule dans un micro-environnement 3D complexe.
En outre, la période de culture prolongée de cette plate-forme facilite l’évaluation des traitements médicamenteux séquentiel et leur impact sur la persistance du VHB, qui ne sont pas possibles à l’aide de systèmes de culture conventionnels hépatocyte.
Ce protocole décrit comment 3D foie-on-a-chip cultures sont générés, soit pour les monocultures de PHH cocultures de PHH avec des cellules de Kupffer. En outre, nous décrivons la production du VHB purifié pour les études de la basse-multiplicité de l’infection, ainsi que l’analyse subséquente de l’hôte et réponses virales.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>William&#39;s E Medium, no phenol red</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>A12176-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepatocyte Thaw Medium</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>CM7500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary Hepatocyte Thawing and Plating Supplements</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>CM3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary Hepatocyte Maintenance Supplements</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>CM4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>11320-033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>12491023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids (NEAA) 100X</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, USA origin, Heat Inactivated, sterile-filtered, suitable for cell culture</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>12106C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>H0888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Merck</td>
			<td>T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen from calf skin</td>
			<td>Merck</td>
			<td>C9791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G418</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>G418-RO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracycline</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>T3258</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene glycol 8000</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>P2139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>SO389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium carbonate anhydrous</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>451614-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>S2002-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfuric acid, 99.999%</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>339741</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% Paraformaldehyde</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>252549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X 100</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>D9564</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin (human)</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>A9731</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisher BioReagent&#160;Bovine Serum Albumin, Fraction V, Heat Shock Treated</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP9701-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Antifade Mountant</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Universal Master Mix II, no UNG</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4440040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Select Master Mix</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4472903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysaccharide from Escherichia coli K12</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>tlrl-eklps</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kits/Consumables</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile membrane</td>
			<td>CN Bio innovations</td>
			<td>LC-SC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LiverChip Perfusion cell culture plate</td>
			<td>CN Bio innovations</td>
			<td>LC12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LiverChip culture plate lid</td>
			<td>CN Bio innovations</td>
			<td>LC-SC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile round filter paper</td>
			<td>CN Bio innovations</td>
			<td>LC-SC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell attachment scaffold</td>
			<td>CN Bio innovations</td>
			<td>LC-SC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retaining ring</td>
			<td>CN Bio innovations</td>
			<td>LC-SC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile plunger</td>
			<td>CN Bio innovations</td>
			<td>LC-ST</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dneasy blood &#38; tissue kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rneasy mini kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Magnetic Luminex assay</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-Step Ultra TMB-ELISA Substrate Solution</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>34028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>4368814</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAamp Viral RNA Mini Accessory Set</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>1048147</td>
			<td>Containing RNA carrier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millicell HY 5-layer cell culture flask, T-1000, sterile</td>
			<td>Millipore (Merck)</td>
			<td>PFHYS1008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Optical 384-Well Reaction Plate with Barcode</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>4309849</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Optical Adhesive Film</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>4311971</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear Flat-Bottom Immuno Nonsterile 96-Well Plates</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>442404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sealing Tape for 96-Well Plates</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene Rapid-Flow Sterile Disposable Bottle Top Filters with PES Membrane</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>295-3345</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand&#160;Microscopic Slides with Ground Edges, Twin Frost</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB58628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube, Thinwall, Ultra-Clear, 38.5 mL, 25 x 89 mm</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>344058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary cells / Cell lines</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Plateable Hepatocytes, Transporter Qualified</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>HMCPTS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryopreserved Human Kupffer Cells</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>HUKCCS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HepDE19 cell line</td>
			<td>Haitao Guo (Indiana University, IN, USA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primers/Probes/Standards</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBV DNA forward primer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td>5&#39;-GTGTCTGCGGCGTTTTATCA-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBV DNA reverse primer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td>5&#39;-GACAAACGGGCAACATACCTT-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBV DNA probe</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td>5&#39;FAM-CCTCTKCATCCTGCTGCTATGCCTCATC-3&#39;TAMRA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pgRNA forward primer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td>5&#39;-GAGTGTGGATTCGCACTCC-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pgRNA reverse primer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td>5&#39;-GAGGCGAGGGAGTTCTTCT-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPS11 forward primer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td>5&#39;-GCCGAGACTATCTGCACTAC-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPS11 reverse primer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td>5&#39;-ATGTCCAGCCTCAGAACTTC-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCMV-HBV</td>
			<td>Professor Christoph Seeger (Fox Chase Cancer Centre, PA, USA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Hepatitis B virus core antigen IgG fraction (polyclonal)</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>discontinued</td>
			<td>Lot 10102505</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Albumin Antibody, A80-129A</td>
			<td>Bethyl Laboratories. inc</td>
			<td>A80-129A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Albumin cross-adsorbed Antibody, A80-229P</td>
			<td>Bethyl Laboratories. inc</td>
			<td>A80-229P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 594</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>#&#160;A-11072</td>
			<td>Lot 1431810</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LiverChip Vacuum pump</td>
			<td>CN Bio innovations</td>
			<td>LC-PN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LiverChip Pneumatic Hookup</td>
			<td>CN Bio innovations</td>
			<td>LC-PN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LiverChip platform</td>
			<td>CN Bio innovations</td>
			<td>LC-PN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LiverChip plate washing dock</td>
			<td>CN Bio innovations</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclavable metal forceps</td>
			<td>VWR</td>
			<td>232-0106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex Genie 2</td>
			<td>Scientific industries</td>
			<td>SKU: SI-0236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima XPN-80 Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A95765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heraeus Multifuge X3R Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75004500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SAM-12 Medical Suction High Vacuum High Flow</td>
			<td>MGE worldwide</td>
			<td colspan="2">&#160;SAM12/01010101</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NUAIRE 5800 SERIES incubator</td>
			<td>NUAIRE</td>
			<td>NU-5841</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated precision torgue</td>
			<td>CN Bio innovations</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manual torque</td>
			<td>CN Bio innovations</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LiverChip compressor</td>
			<td>CN Bio innovations</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminex LX-200 Instrument with xPONENT 3.1</td>
			<td>Luminex</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millipore Hand-Held Magnetic Separator Block</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Millipore&#8482; 40-285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoStar Optima Plate Reader</td>
			<td>BMG Labtech</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOLVER Precision electric screwdrivers</td>
			<td>VTECH ltd</td>
			<td>FAB10RE/FR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOLVER Power supply</td>
			<td>VTECH ltd</td>
			<td>EDU1FR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BAMBI VTS75D</td>
			<td>Air Equipment</td>
			<td>Discontinued</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Integra Vacuboy</td>
			<td>INTEGRA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ViiA 7 Real-Time PCR System with 384-Well Block</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>4453536</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

"liver-on-a-chip" cultures of primary hepatocytes and kupffer cells for hepatitis b virus infection

Malgré l’infectivité exceptionnelle du virus de l’hépatite B (VHB) in vivo, où seulement trois génomes viraux peuvent entraîner une chronicité des chimpanzés infectés expérimentalement, plus les modèles in vitro nécessitent plusieurs centaines de milliers de génomes viraux par cellule chez afin d’initier une infection transitoire. En outre, les cultures d’hépatocytes humains primaires (PHH) 2D statiques permettent uniquement les études à court terme en raison de leur rapide dédifférenciation. Nous décrivons ici 3D cultures de foie-on-a-chip de PHH, soit en monocultures cocultures avec d’autres cellules de foie-résident parenchymateuses. Ceux-ci offrent une amélioration significative à l’étude des infections à HBV à long terme avec les réponses des cellules hôtes physiologiques. En plus de faciliter les études de l’efficacité des médicaments, analyses toxicologiques et enquêtes sur la pathogenèse, ces systèmes microfluidiques permettent l’évaluation des thérapies curatives visant à éliminer par covalence fermé, infection par le VHB circulaire (ccc) ADN. Ceci présente méthode décrit la mise en place de PHH monocultures et les cultures de cellules co PHH/Kupffer, leur infection par le VHB purifiée et l’analyse des réponses de l’hôte. Cette méthode s’applique à l’évaluation des effets à long terme de l’infection à VHB, combinaisons de traitements et pathogenèse.

Nous décrivons une plateforme simple et versatile pour la culture à long terme de leur infection par le VHB et/ou les hépatocytes et les cellules de Kupffer humaines primaires. Des cellules humaines primaires sont ensemencées sur des échafaudages en polystyrène enduit de collagène au sein d’un assemblage de plaque de microfluidique, qui alimente en continu les cellules avec le milieu de croissance (Figure 1 a).
PHH, qui sont habituellement seulement stable pour un temps limité dans les systèmes de culture conventionnels, peut être maintenue sur le plan fonctionnel pendant de longues périodes de temps. L’albumine humaine, qui est sécrétée par les hépatocytes fonctionnels et est considéré comme le meilleur marqueur pour l’évaluation du métabolisme hépatique, est stable et hautement exprimé par cultures 3D jusqu’au jour 40 après ensemencement (Figure 2). Pour les cocultures, viabilité et fonctionnalités de cellules de Kupffer peuvent être évaluées par la sécrétion de cytokines spécifiques (p. ex., IL6 et TNFα). Pour mesurer la production de cytokines, l’utilisation de moyens de détection basée sur les captures par LPS-stimulation des cocultures est recommandée (Figure 3).
Les cellules forment microtissues hépatique, habituellement dans les 3 jours des semis de PHH, démontrant les canalicules biliaires fonctionnels et polarisation cellulaire complet (Figure 2). En plus de retenir leur métabolisme cellulaire physiologique, ces cultures deviennent exceptionnellement sensibles à l’infection par le VHB. L’ADN du VHB et autres marqueurs viraux, contrairement aux autres systèmes de culture deviennent facilement détectables post-d’infection jour 2 (Figure 4). En plus sécrétées marqueurs d’infection virale, hépatocytes contenant les échafaudages peuvent être provient de cultures et utilisés pour la détection par immunofluorescence des antigènes viraux (par exemple, AgHBs, AgHBc) (Figure 4). Où les cultures d’hépatocytes conventionnels exigent l’inoculation avec au moins 500 GE de VHB par cellule et par l’ajout de 2 % DMSO et 4 % PEG, aussi peu que 0,05 VHB GE sont capables de déclencher l’infection dans les cultures 3D sans avoir besoin de DMSO ou PEG (Figure 4).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58333/58333fig1.jpg"> Figure 1 : mise en place de cultures de foie-on-a-chip 3-d. (un) c’est une présentation schématique pour le montage de la plaque de culture afin d’assurer la mise en place de la circulation de la microfluidique. (b) ce panneau montre une vue rapprochée des puits de culture, y compris le papier filtre, échafaudage et bague de retenue. (c) ce panneau montre le processus d’équilibration de la plaque avant le semis des cultures. Les deux panneaux montrent le processus d’ensemencement des monocultures d’hépatocytes (d) et (e) hépatocytes/Kupffer cell cocultures. (f) ce panneau montre les étapes de lavage moyen changements apportés. (g) ce panneau montre le montage infection VHB, y compris la suppression de l’inoculum. S.M. = moyen de semis, M.M. = entretien moyen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58333/58333fig1large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58333/58333fig2.jpg"> Figure 2 : viabilité de formation et des hépatocytes hépatique micro-culture. (un) ce panneau montre des images de fond clair longitudinale de monocultures d’hépatocytes 3D démontrant micro-culture formation après l’ensemencement. (b) ce panneau montre l’imagerie immunofluorescence des cultures pour les noyaux (bleu) et l’albumine humaine (vert). (c) ce panneau montre albumine total longitudinale, ainsi que par cellule ajusté production d’albumine, pendant 40 jours de monocultures d’hépatocytes, tel que déterminé par ELISA. Les données présentées sont moyenne ± SD Ce chiffre est une adaptation d’Ortega-Prieto et al.,4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58333/58333fig2large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58333/58333fig3.jpg"> Figure 3 : fonctionnalités de cellules de Kupffer dans cocultures 3-d. Ces panneaux montrent la sécrétion de (un) IL6 et (b) TNFα dans les monocultures d’hépatocytes et cellules hépatocytes/Kupffer cocultures 11 jours après l’ensemencement en réponse au LPS exogène au jour 9 post semis, tel que déterminé à l’aide humaine magnétique Luminex dosage. Ce chiffre est une adaptation d’Ortega-Prieto et al.,4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58333/58333fig3large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58333/58333fig4.jpg"> Figure 4 : infection par le VHB dans les cultures de foie-on-a-chip. (a) ce panneau montre la détection de microscopie d’immunofluorescence AgHBc (rouge), Ag HBs (vert) et noyaux (bleu) 10 jours après l’infection des cultures par le VHB. (b) ce panneau montre la sensibilité des cultures à l’infection par le VHB à l’aide des multiplicités différentes d’infection, tel que déterminé par une quantification de l’ADN du VHB dans les surnageants de culture. (c) ce panneau montre la quantification de l’accumulation longitudinale de Pan-RPGAA VHB par rapport à la gène de ménage RPS11. Les données présentées sont moyenne ± SD Ce chiffre est une adaptation d’Ortega-Prieto et al.,4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58333/58333fig4large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>

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"Liver-on-a-Chip" Cultures of Primary Hepatocytes and Kupffer Cells for Hepatitis B Virus Infection

« Foie-on-a-Chip » Cultures d’hépatocytes primaires et des cellules de Kupffer pour Infection de Virus de l’hépatite B

Le but du présent protocole est de fournir un guide étape par étape pour réaliser des expériences 3D « foie-on-a-chip » infection par le virus de l’hépatite B.

Despite the exceptional infectivity of the hepatitis B virus (HBV) in vivo, where only three viral genomes can result in a chronicity of experimentally ...

Cette méthode peut aider à répondre aux questions clés dans les infections hépatotropiques et les maladies du foie. Comme la contribution des populations cellulaires résidentes du foie à la pathogénie virale, à la cinétique longitudinale des infections, aux mécanismes de réplication virale, à l’invasion immunitaire, dans un système modèle physiologique et aux études de dépistage des drogues. Le principal avantage de cette technique est la capacité de récapituler un microenvironnement hépatique.Qui peut être maintenu pendant de longues périodes de temps et est naturellement sensible à l’infection à l’hépatite B à des niveaux physiologiquement pertinents. Cela a déjà été une contrainte fondamentale dans le domaine de l’hépatite B. Les implications de cette technique s’étendent vers la thérapie ou le diagnostic de l’infection par le VHB parce que des études de dépistage de drogues peuvent être effectuées dans une plate-forme physiologique pendant de longues durées.Cela permet l’évaluation des traitements médicamenteux séquentiels ainsi que l’analyse de l’efficacité des stratégies de traitement existantes et nouvelles. Cette méthode peut fournir la compréhension dans l’hépatite B, et peut également être appliquée à d’autres études de la maladie, y compris d’autres infections hépatotropiques, les maladies du foie, ou des études de métabolisme de drogue. En général, les personnes nouvelles à cette méthode auront du mal, car il faut une attention particulière à des détails particuliers pour permettre le maintien réussi des tissus hépatiques pendant de longues périodes de temps.Et aussi la familiarisation avec les outils et l’équipement spécialisés. La démonstration visuelle de cette méthode est critique. Y compris l’assemblage des plaques, ainsi que le dégel et l’ensemencement des cellules.Étant donné que les étapes impliquées dans la culture à long terme des cellules dérivées du foie sont difficiles lors de l’utilisation d’un nouveau système de culture. Tout d’abord, allumez à la fois le compresseur et la pompe à vide associées à la plate-forme de copeaux de foie. Procéder à une armoire à tubes en verre pour assembler et équilibrer les plaques.Placez une membrane stérile sur la base de la plaque pour commencer à assembler aseptiquement les plaques microfluidiques. S’assurer que la membrane stérile repose en douceur sur les deux broches de la plaque de base. Ajouter ensuite la plaque supérieure bien contenant.Ajouter un couvercle de plaque stérile. Et utilisez un couple de précision automatisé, réglé à 33 livres. À l’aide d’une séquence de serrage en spirale pour serrer les vis à la base de la plaque.À l’aide d’un couple manuel, assurez-vous que toutes les vis sont serrées à 35 livres. Ensuite, préchauffer l’ensemencement des hépatocytes à 37 degrés Celsius avant l’amorçage. Placez la plaque entièrement assemblée dans le quai de lavage.Et assurez-vous que la plaque s’enclenche complètement. Ajouter 400 microlitres de milieu d’ensemencement d’hépatocytes au côté réservoir de chaque puits pour amorcer la plaque. Après cela, lancer le flux dans la direction ascendante pendant 3,5 minutes à un microlitre par seconde.Les indicateurs rouges sur le côté de la plaque indiqueront si la circulation microfluidique fonctionne correctement. Une fois que le milieu est pompé sur le côté croissance cellulaire de la plaque, ajouter 1,2 millilitres supplémentaires de milieu d’ensemencement des hépatocytes. Transférez soigneusement la plaque dans la station d’amarrage à l’intérieur d’un incubateur humidifié à 37 degrés Celsius et 5 % de CO2.Lancez le débit vers le haut à un débit d’un microlitre par seconde pendant 16 heures. Après cela, transférer la plaque sur un quai de lavage. Pipette doucement de haut en bas pour éliminer les bulles.À l’aide d’un forceps stérile, ajouter un papier filtre rond stérile à chaque puits. Ajoutez ensuite un échafaudage de fixation cellulaire et un anneau de soutoutage à chaque puits. Utilisez un piston stérile pour pousser chaque puits et verrouiller les anneaux de soutine et les échafaudages en place.Ensuite, aspirez tout le milieu. Et ajouter délicatement 400 microlitres de milieu d’ensemencement d’hépatocytes préchauffé sur l’échafaudage. Lancer le débit dans une direction descendante à un microlitre par seconde pendant 3 1/2 minutes.Aspirer tous les moyens pompés du côté réservoir de la plaque. Ajouter 1,4 millilitres de milieu d’ensemencement d’hépatocytes à chaque puits. Retournez ensuite la plaque au quai pour porter le volume total par puits jusqu’à 1,6 millilitre.Tout d’abord, préchauffer le milieu de décongélation des hépatocytes et l’ensemencement des hépatocytes moyen à 37 degrés Celsius. Ensuite, décongelez un flacon d’hépatocytes humains primaires selon les instructions du fournisseur. Dans une armoire à tube de verre, resuspendre les cellules en un millilitre de milieu d’ensemencement d’hépatocytes.Ensuite, placez les cellules résuspendées sur la glace. À l’aide du bleu trypan, comptez les cellules pour vous assurer que la viabilité des cellules est supérieure à 90 % Transférez la plaque entièrement assemblée au quai de lavage. Et aspirer tous les médiums des puits.Récupérez les cellules de la glace, et ajoutez 600 000 hépatocytes à chaque puits dans un volume de 500 microlitres de milieu d’ensemencement d’hépatocytes. Lancez le débit dans la direction descendante à un débit d’un microlitre par seconde. Ajouter 900 microlitres de milieu d’ensemencement d’hépatocytes à chaque puits pour porter le volume total de chacun à 1,6 millilitres.Transférer la plaque à la station d’amarrage dans un incubateur humidifié à 37 degrés Celsius et avec 5 % de CO2. Lancer le débit dans la direction descendante à un débit d’un microlitre par seconde pendant huit heures. Après cela, inverser le flux vers la direction ascendante à un débit d’un microlitre par seconde pendant huit heures.Ensuite, transférez la plaque à la cale de lavage, et aspirez tous les moyens des puits. Ajouter 400 microlitres de milieu d’entretien des hépatocytes à chaque puits. Et lancer le flux dans la direction descendante à un débit d’un microlitre par seconde pendant 3 1/2 minutes.Ensuite, aspirez tous les moyens du réservoir et ajoutez 1,4 millilitres de milieu d’entretien des hépatocytes. Transférer la plaque dans la station d’amarrage dans un incubateur humidifié à 37 degrés Celsius et 5 % de CO2. Lancez le débit dans la direction ascendante à un débit d’un microlitre par seconde pendant 48 heures.Après 48 heures, laver la plaque en la transférant au quai de lavage. Aspirer tous les médiums des puits. Et ajouter 400 microlitres de support d’entretien.Et lancer le flux dans la direction descendante à un microlitre par seconde pendant 3,5 minutes. Ensuite, aspirez tous les médiums apparaissant dans le côté réservoir des puits. Ajouter 1,4 millilitres de milieu d’entretien des hépatocytes.Ensuite, transférez la plaque à la station d’amarrage dans l’incubateur humidifié. Lancez le débit dans la direction ascendante à un débit d’un microlitre par seconde pendant 48 heures. Remplacez le milieu à l’aide de ce procédé de lavage et de remplacement toutes les 48 heures.Les hépatocytes humains primaires ne sont généralement stables que pendant une période limitée lorsqu’ils utilisent des systèmes de culture conventionnels. Toutefois, en utilisant le protocole décrit ici, ils peuvent être maintenus fonctionnellement pendant de longues périodes de temps. L’albumine humaine est sécrété par des hépatocytes fonctionnels, et est considéré comme le meilleur marqueur pour évaluer la fonctionnalité hépatique.Albumin est considéré comme stably et fortement exprimé par les cultures 3D jusqu’au jour au moins 40 post-ensemencement. Pour les co-cultures, la fonctionnalité et la viabilité des cellules Kupffer sont évaluées en mesurant la sécrétion de cytokines spécifiques. Comme on le voit ici, les niveaux mesurés d’IL-6 et de TNF alpha indiquent que les cellules ont été fonctionnellement maintenues et viables.En plus de conserver leur métabolisme cellulaire physiologique, ces cultures sont devenues exceptionnellement sensibles à l’infection par le VHB. L’ADN du VHB et d’autres marqueurs viraux sont facilement détectables dès le deuxième jour après l’infection. Alors que les cultures conventionnelles nécessitent une inoculation avec au moins 500 équivalents génomiques du VHB complétés par le DMSO et le PEG, ces cultures 3D sont infectées par aussi peu que 05 équivalents génomiques non complémentaires.En plus des marqueurs sécrétés de l’infection virale, des échafaudages contenant des hépatocytes sont récupérés de ces cultures. La microscopie immunofluorescence révèle que ces échafaudages contiennent des antigènes viraux. Tout en essayant cette procédure, il est important de se rappeler d’être doux lors de la manipulation des hépatocytes avant l’ensemencement pour éviter la mort cellulaire.En outre, il est essentiel de s’assurer que les plaques sont correctement assemblées et que tous les canaux d’écoulement permettent une circulation correcte des médias avant l’ensemencement des hépatocytes. Après cette procédure, d’autres méthodes comme l’immunofluorescence peuvent être effectuées afin de répondre à d’autres questions. Y compris l’emplacement et la fréquence des cellules infectées dans le tissu.L’état physiologique des hépatocytes peut également être évalué en souinant pour l’albumine ou les structures hépatiques, y compris la protéine de jonction serrée ZO-1. Après ce développement, cette technique ouvre la voie à des chercheurs dans le domaine de la virologie pour explorer l’infection à l’hépatite B et les réponses immunitaires dans un système modèle 3D physiologique. N’oubliez pas que le travail avec le virus de l’hépatite B peut être dangereux, et des précautions telles que la vaccination précédente, l’utilisation d’EPI appropriées et le travail selon les lignes directrices appropriées en matière de biosécurité devraient toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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Research on B cells has shown that CD40 activation improves their antigen presentation capacity. When stimulated with interleukin-4 and CD40 ligand ...

Recherche

Immunologie et infection

Recombinant Retroviral Production and Infection of B Cells

Recombinante de production et infection rétrovirale des cellules B

The transgenic expression of genes in eukaryotic cells is a powerful reverse genetic approach in which a gene of interest is expressed under the control ...

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Isolation par cytométrie en flux des cellules primaires murins épithéliales alvéolaires de type II pour les études fonctionnelles et moléculaires

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Un protocole pour l&#39;analyse de l&#39;hépatite C de réplication

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Kupffer cellule d&#39;isolement pour les essais de toxicité des nanoparticules

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Détection de faibles copies numéro ADN Viral intégré formé par In Vitro l’infection par l’hépatite B

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