Name: isolation of f1-atpase from the parasitic protist trypanosoma brucei
Uploaded: 2019-01-22T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of F1-ATPase from the Parasitic Protist Trypanosoma brucei at JoVE.com

تم تمويل هذا العمل من قبل وزارة "التعليم منسق الإغاثة الطارئة تشيكوسلوفاكيا" منح LL1205، منحة "وكالة المنح من الجمهورية التشيكية" 18-17529S، والتي سيطلب/كلية العلوم التربوية مشروع مركز البحوث الإمراضية وضراوة الطفيليات (رقم CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_019/0000759).

1-المخازن المؤقتة والحلول
<ol><li>إعداد الحلول المدرجة أدناه. ديغا كافة المخازن المؤقتة للفصل اللوني للسوائل. إضافة مثبطات ADP، بينزاميديني، وحوزتي فقط قبل الاستخدام.<ol>
<li>إعداد المخزن المؤقت ج: 50 مم تريس المخزن المؤقت مع حمض الهيدروكلوريك (تريس-HCl) pH 8.0، السكروز 0.25 م، بينزاميديني 5 مم، 5 مم أمين?...

<ol>
	<li>Walker, J. E., Wikstr&#246;m, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure,+mechanism+and+regulation+of+ATP+synthases.">Structure, mechanism and regulation of ATP synthases.</a> Mechanisms of Primary Energy Transduction in Biology. , 338-373 (2017).</li><li>Pullman, M. E., Penefsky, H. S., Datta, A., Racker, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partial+resolution+of+the+enzymes+catalyzing+oxidative+phosphorylation.+I.+Purification+and+properties+of+soluble+dinitrophenol-stimulated+adenosine+triphosphatase.">Partial resolution of the enzymes catalyzing oxidative phosphorylation. I. Purification and properties of soluble dinitrophenol-stimulated adenosine triphosphatase.</a> The Journal of Biological Chemistry. 235, 3322-3329 (1960).</li><li>Schatz, G., Penefsky, H. S., Racker, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partial+resolution+of+the+enzymes+catalyzing+oxidative+phosphorylation.">Partial resolution of the enzymes catalyzing oxidative phosphorylation.</a> XIV. The Journal of Biological Chemistry. 242 (10), 2552-2560 (1967).</li><li>Racker, E., Horstman, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partial+resolution+of+the+enzymes+catalyzing+oxidative+phosphorylation.+13.+Structure+and+function+of+submitochondrial+particles+completely+resolved+with+respect+to+coupling+factor.">Partial resolution of the enzymes catalyzing oxidative phosphorylation. 13. Structure and function of submitochondrial particles completely resolved with respect to coupling factor.</a> The Journal of Biological Chemistry. 242 (10), 2547-2551 (1967).</li><li>Senior, A. E., Brooks, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+the+mitochondrial+oligomycin-insensitive+ATPase.+I.+An+improved+method+of+purification+and+the+behavior+of+the+enzyme+in+solutions+of+various+depolymerizing+agents.">Studies on the mitochondrial oligomycin-insensitive ATPase. I. An improved method of purification and the behavior of the enzyme in solutions of various depolymerizing agents.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 140 (1), 257-266 (1970).</li><li>Tzagoloff, A., Meagher, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+the+mitochondrial+membrane+system.+V.+Properties+of+a+dispersed+preparation+of+the+rutamycin-sensitive+adenosine+triphosphatase+of+yeast+mitochondria.">Assembly of the mitochondrial membrane system. V. Properties of a dispersed preparation of the rutamycin-sensitive adenosine triphosphatase of yeast mitochondria.</a> The Journal of Biological Chemistry. 246 (23), 7328-7336 (1971).</li><li>Beechey, R. B., Hubbard, S. A., Linnett, P. E., Mitchell, A. D., Munn, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+rapid+method+for+the+preparation+of+adenosine+triphosphatase+from+submitochondrial+particles.">A simple and rapid method for the preparation of adenosine triphosphatase from submitochondrial particles.</a> Biochemical Journal. 148 (3), 533-537 (1975).</li><li>Tyler, D. D., Webb, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+properties+of+the+adenosine+triphosphatase+released+from+the+liver+mitochondrial+membrane+by+chloroform.">Purification and properties of the adenosine triphosphatase released from the liver mitochondrial membrane by chloroform.</a> Biochemical Journal. 178 (2), 289-297 (1979).</li><li>Hack, E., Leaver, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+alpha-subunit+of+the+maize+F1-ATPase+is+synthesised+in+the+mitochondrion.">The alpha-subunit of the maize F1-ATPase is synthesised in the mitochondrion.</a> The EMBO Journal. 2 (10), 1783-1789 (1983).</li><li>Dunn, P. P., Slabas, A. R., Moore, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+F1-ATPase+from+cuckoo-pint+(Arum+maculatum)+mitochondria.+A+comparison+of+subunit+composition+with+that+of+rat+liver+F1-ATPase.">Purification of F1-ATPase from cuckoo-pint (Arum maculatum) mitochondria. A comparison of subunit composition with that of rat liver F1-ATPase.</a> Biochemical Journal. 225 (3), 821-824 (1985).</li><li>Satre, M., Bof, M., Vignais, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+Escherichia+coli+adenosine+triphosphatase+with+aurovertin+and+citreoviridin:+inhibition+and+fluorescence+studies.">Interaction of Escherichia coli adenosine triphosphatase with aurovertin and citreoviridin: inhibition and fluorescence studies.</a> Journal of Bacteriology. 142 (3), 768-776 (1980).</li><li>Abrahams, J. P., Leslie, A. G., Lutter, R., Walker, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+at+2.8+&#197;+resolution+of+F1ATPase+from+bovine+heart+mitochondria.">Structure at 2.8 &#197; resolution of F1ATPase from bovine heart mitochondria.</a> Nature. 370 (6491), 621-628 (1994).</li><li>Lutter, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallization+of+F1-ATPase+from+bovine+heart+mitochondria.">Crystallization of F1-ATPase from bovine heart mitochondria.</a> Journal of Molecular Biology. 229 (3), 787-790 (1993).</li><li>Kabaleeswaran, V., Puri, N., Walker, J. E., Leslie, A. G., Mueller, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+features+of+the+rotary+catalytic+mechanism+revealed+in+the+structure+of+yeast+F1-ATPase.">Novel features of the rotary catalytic mechanism revealed in the structure of yeast F1-ATPase.</a> The EMBO Journal. 25 (22), 5433-5442 (2006).</li><li>Shirakihara, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+a+thermophilic+F1-ATPase+inhibited+by+an+epsilon-subunit:+deeper+insight+into+the+epsilon-inhibition+mechanism.">Structure of a thermophilic F1-ATPase inhibited by an epsilon-subunit: deeper insight into the epsilon-inhibition mechanism.</a> The FEBS Journal. 282 (15), 2895-2913 (2015).</li><li>Stocker, A., Keis, S., Cook, G. M., Dimroth, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification,+crystallization,+and+properties+of+F1-ATPase+complexes+from+the+thermoalkaliphilic+Bacillus+sp.+strain+TA2.A1.">Purification, crystallization, and properties of F1-ATPase complexes from the thermoalkaliphilic Bacillus sp. strain TA2.A1.</a> Journal of Structural Biology. 152 (2), 140-145 (2005).</li><li>Ferguson, S. A., Cook, G. M., Montgomery, M. G., Leslie, A. G., Walker, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+thermoalkaliphilic+F1-ATPase+from+Caldalkalibacillus+thermarum.">Regulation of the thermoalkaliphilic F1-ATPase from Caldalkalibacillus thermarum.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (39), 10860-10865 (2016).</li><li>Cataldi de Flombaum, M. A., Frasch, A. C. C., Stoppani, A. O. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenosine+triphosphatase+from+Trypanosoma+cruzi:+purification+and+properties.">Adenosine triphosphatase from Trypanosoma cruzi: purification and properties.</a> Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Comparative Biochemistry. 65 (1), 103-109 (1980).</li><li>Williams, N., Frank, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrial+ATP+synthase+of+Trypanosoma+brucei:+isolation+and+characterization+of+the+intact+F1+moiety.">The mitochondrial ATP synthase of Trypanosoma brucei: isolation and characterization of the intact F1 moiety.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. 43 (1), 125-132 (1990).</li><li>Higa, A. I., Cazzulo, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mg2+-activated+adenosine+triphosphatase+from+Crithidia+fasciculata:+purification+and+inhibition+by+suramin+and+efrapeptin.">Mg2+-activated adenosine triphosphatase from Crithidia fasciculata: purification and inhibition by suramin and efrapeptin.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. 3 (6), 357-367 (1981).</li><li>Walker, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+structure+and+subunit+stoichiometry+of+F1-ATPase+from+bovine+mitochondria.">Primary structure and subunit stoichiometry of F1-ATPase from bovine mitochondria.</a> Journal of Molecular Biology. 184 (4), 677-701 (1985).</li><li>Mueller, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ni-chelate-affinity+purification+and+crystallization+of+the+yeast+mitochondrial+F1-ATPase.">Ni-chelate-affinity purification and crystallization of the yeast mitochondrial F1-ATPase.</a> Protein Expression and Purification. 37 (2), 479-485 (2004).</li><li>Gahura, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+F1-ATPase+from+Trypanosoma+brucei+is+elaborated+by+three+copies+of+an+additional+p18-subunit.">The F1-ATPase from Trypanosoma brucei is elaborated by three copies of an additional p18-subunit.</a> The FEBS Journal. 285 (3), 614-628 (2018).</li><li>Montgomery, M. G., Gahura, O., Leslie, A. G. W., Zikova, A., Walker, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATP+synthase+from+Trypanosoma+brucei+has+an+elaborated+canonical+F1-domain+and+conventional+catalytic+sites.">ATP synthase from Trypanosoma brucei has an elaborated canonical F1-domain and conventional catalytic sites.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (9), 2102-2107 (2018).</li><li>Schneider, A., Charriere, F., Pusnik, M., Horn, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+mitochondria+from+procyclic+Trypanosoma+brucei.">Isolation of mitochondria from procyclic Trypanosoma brucei.</a> Methods in Molecular Biology. 372, 67-80 (2007).</li><li>Smith, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+protein+using+bicinchoninic+acid.">Measurement of protein using bicinchoninic acid.</a> Analytical Biochemistry. 150 (1), 76-85 (1985).</li><li>Wirtz, E., Leal, S., Ochatt, C., Cross, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tightly+regulated+inducible+expression+system+for+conditional+gene+knock-outs+and+dominant-negative+genetics+in+Trypanosoma+brucei.">A tightly regulated inducible expression system for conditional gene knock-outs and dominant-negative genetics in Trypanosoma brucei.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. 99 (1), 89-101 (1999).</li><li>Speijer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+respiratory+chain+from+cultured+Crithidia+fasciculata.">Characterization of the respiratory chain from cultured Crithidia fasciculata.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. 85 (2), 171-186 (1997).</li><li>Nelson, R. E., Aphasizheva, I., Falick, A. M., Nebohacova, M., Simpson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+I-complex+in+Leishmania+tarentolae+is+an+uniquely-structured+F1-ATPase.">The I-complex in Leishmania tarentolae is an uniquely-structured F1-ATPase.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. 135 (2), 221-224 (2004).</li><li>Carbajo, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+the+N-terminal+domain+of+the+OSCP+subunit+of+bovine+F1Fo-ATP+synthase+interacts+with+the+N-terminal+region+of+an+alpha+subunit.">How the N-terminal domain of the OSCP subunit of bovine F1Fo-ATP synthase interacts with the N-terminal region of an alpha subunit.</a> Journal of Molecular Biology. 368 (2), 310-318 (2007).</li><li>Bowler, M. W., Montgomery, M. G., Leslie, A. G., Walker, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ground+state+structure+of+F1-ATPase+from+bovine+heart+mitochondria+at+1.9+&#197;+resolution.">Ground state structure of F1-ATPase from bovine heart mitochondria at 1.9 &#197; resolution.</a> The Journal of Biological Chemistry. 282 (19), 14238-14242 (2007).</li></ol>

بروتوكول إف1-تنقية ATPase من البروسية ت. وقد وضعت استناداً إلى أساليب نشرها مسبقاً لعزل و1-مجمعات ATPase من13،الأنواع الأخرى14. الأسلوب لا يتطلب أي التعديل الوراثي (مثلاً، وضع علامات) وينتج مجمع نشط بشكل كامل مع جميع الوحدات الفرعية الحالية. ال?...

سينثاسيس و من نوع ATP الملازمين للغشاء تناوب مجمعات مولتيبروتين إزفاء بروتون أن الزوجين عبر أغشية ترانسدوسينج الطاقة من البكتيريا، الميتوكوندريا، والمعايشة مع تشكيل ATP. التفاصيل الجزيئية إليه التناوب من التوليف ATP معروفة أساسا بسبب الدراسات الهيكلية لتنقية البكتيرية والمتقدريه ATP سينثاسيس و سوبكومبليكسيس1. ونوع ATP synthase ينقسم إلى مويتيس غشاء الجوهرية والأغشية الخارجية. الجزء الأغشية الخارجية، المعروفة باسم إف1-ATPase، يحتوي على ثلاثة مواقع الحفاز، حيث تحدث الفسفرة diphosphate الأدينوزين (ADP) إلى ATP أو رد فعل عكسي. إف1-يمكن إصدار ATPase تجريبيا من مجموعة الأغشية الغير مضمنة مع احتفاظها بقدرتها على يتحلل، لكن لا توليف، ATP. قطاع غشاء زمنياً، تسمى وo، يتوسط إزفاء البروتين، مما يدفع تناوب الجزء المركزي من الإنزيم. و1 و Fo قطاعات متصلة بواسطة سيقان المركزية والطرفية.
الأول محاولات لتنقية و1-ATPase من الخميرة مهدها والقلب البقري الميتوكوندريا تاريخ العودة إلى الستينات. استخراج هذه البروتوكولات تستخدم الميتوكوندريا، التي تعطلت بفعل سونيكيشن، مجزأ بترسيب كبريتات الأمونيوم أو البروتامين، متبوعاً بدرجات اللوني الاختياري والمعالجة بالحرارة2،3،4 ،،من56. التنقية تحسنت إلى حد كبير والمبسطة باستخدام كلوروفورم، مما يسهل النشرات و1-ATPase من غشاء الميتوكوندريا شظايا7. استخراج كلوروفورم ثم استخدم لاستخراج و1-أتباسيس من مختلف الحيوانات والنباتات ومصادر البكتيرية (مثلاً، الجرذ الكبد8، الذرة9 والابقع قلقاس10و الإشريكيّة القولونية 11). المزيد من تنقية صدر كلوروفورم و1-ATPase التي تقارب أو حجم الاستبعاد اللوني (SEC) أسفرت عن بروتين عالية نقية معقدة، التي كانت مناسبة لتصميم هيكل عالي الاستبانة بعلم البلورات بالأشعة السينية، كما موثقة من قبل هياكل إف1-ATPase من القلب البقري12،13 و14من Saccharomyces cerevisiae. إف1-هياكل ATPase وحددت أيضا من الكائنات الحية التي يصعب زراعتها، وهكذا، كانت كمية المواد البيولوجية الأولية محدودة. في هذه الحالة، و1-أعرب عن مفارز ATPase وتجميعها في المجمع في كولايمصطنع، وتمت تنقية الإنزيم مغايرة كلياً بالتقارب اللوني عن طريق وحدة فرعية للمعلمة. مثل هذا النهج أدى إلى تحديد و1-هياكل ATPase من نوعين من أنواع البكتيريا لاسخدام، ستيروثيرموفيلوس جيوباسيلوس15 و16 ثيرماروم كالدالكاليباسيلوس، 17. ومع ذلك، هذه المنهجية غير مناسب بدلاً من التوكسينات و1-أتباسيس حيث أنها تعتمد على جهاز بروثيوسينثيتيك بدائية والتجهيز بوستترانسلاشونال، والجمعية المعقدة.
استخراج كلوروفورم القائم كان يستخدم لعزل و1-أتباسيس من ثنائيهالعائل أحادي الخلية الطفيليات مثقبيه الكروزية18 والبروسية ت.19، أهمية العوامل الممرضة الثدييات مما تسبب في أمريكا و تريبانوسومياسيس الأفريقية، على التوالي، ومن الطفيليات الحشرات مونوجينيك فاسسيكولاتا كريثيديا20. تنقية هذه أدت فقط إلى وصف بسيط و1-أتباسيس، حيث استخدمت أية تطبيقات المصب تماما وصف تكوين وهيكل، وخصائص الانزيمية للمجمع. توضح هذه المقالة أسلوب أمثل إف1-تنقية ATPase من مرحلة دورة حياة الحشرات مثقف البروسية ت. الأسلوب هو وضعت استناداً إلى البروتوكولات المعمول بها لعزل الأبقار والخميرة و1-أتباسيس،من2122. الإجراء غلة عالية نقية ومتجانسة توصيف مفصل البروتين الكتلي23، و تصميم هيكل24إنزيم مناسب في المختبر الانزيمية والمثبطة فحوصات،. البروتوكول تنقية والمعرفة و1-هيكل ATPase على المستوى الذري يفتح إمكانية تصميم شاشات لتحديد مثبطات جزيء صغير، والمساعدة في تطوير عقاقير جديدة ضد تريبانوسومياسيس الأفريقية. وعلاوة على ذلك، البروتوكول يمكن تكييفها لتنقية و1-ATPase من الكائنات الحية الأخرى.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosin Diphosphate Disodium Salt (ADP)</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A0948</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amastatin Hydrochloride</td>
			<td>Glantham Life Sciences</td>
			<td>GA1330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aminocaproic Acid</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A2266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>ThermoFischer Scientific/Pierce</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzamidine Hydrochloride</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>199001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bestatin Hydrochloride</td>
			<td>Sigma Aldrich/Merck</td>
			<td>B8385</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete Tablets, Mini EDTA-free</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4693159001</td>
			<td>Protease inhibitor cocktail tablets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic Acid (EDTA)</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td></td>
			<td>For pH adjustment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ile-Pro-Ile</td>
			<td>Sigma Aldrich/Merck</td>
			<td>I9759</td>
			<td>Alias Diprotin A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leupeptin</td>
			<td>Sigma Aldrich/Merck</td>
			<td>L2884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate Heptahydrate</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pepstatin A</td>
			<td>Sigma Aldrich/Merck</td>
			<td>P5318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Electrophoresis System</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Consumables</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Tubes for SW60Ti, Polyallomer</td>
			<td>Beckman Coulture</td>
			<td>328874</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DounceTissues Homogenizer 2 mL</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Vacuum Filtration Device</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>516-7017</td>
			<td>Degasing solutions for liquid chromatography</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiTrap Q HP, 5 mL</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>17115401</td>
			<td>Anion exchange chromatography column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Regenaretad Cellulose Membrane Filters, pore size 0.45 &#956;m, diameter 47 mm</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>18406--47------N</td>
			<td>Degasing solutions for liquid chromatography</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superdex 200 Increase 10/300 GL</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>29091596</td>
			<td>Size-exclusion chromatography column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vivaspin 6 MWCO 100 kDa PES</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>VS0641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AKTA Pure 25</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>29018224</td>
			<td>Or similar FPLC system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer Shimadzu UV-1601</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td></td>
			<td>Or similar spectrophotometer with kinetic assay mode</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge Beckman Optima with SW60Ti Rotor</td>
			<td>Beckman Coulture</td>
			<td></td>
			<td>Or similar ultracentrifuge and rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic Homogenizer with Thin Probe, Model 3000</td>
			<td>BioLogics</td>
			<td>0-127-0001</td>
			<td>Or similar ultrasonic homogenizer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of f1-atpase from the parasitic protist trypanosoma brucei

إف1-ATPase هو سوبكومبليكس حفاز الأغشية خارجية من نوع F ATP synthase، إنزيم يستخدم القوة الدافعة بروتون عبر الأغشية البيولوجية لإنتاج أدينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP). عزل و سليمة1-ATPase من مصدرها الأصلي شرط أساسي لتحديد خصائص تكوين البروتين ومعلمات الحركية حساسية لمثبطات للانزيم. نقية للغاية ومتجانسة و1-يمكن استخدام أتباسي للدراسات الهيكلية، التي توفر نظرة ثاقبة الآليات الجزيئية لتوليف ATP والتحلل المائي. توضح هذه المقالة إجراء لتنقية و1-ATPase من المثقبيات البروسية، المسبّب تريبانوسومياسيس الأفريقية. و1-ATPase يتم عزل من الحويصلات الميتوكوندريا، التي يتم الحصول عليها من تفسخ ناقص التوتر من المثقبيات في المختبر مثقف. ميكانيكيا مجزأة الحويصلات sonication واف1-ATPase يتم تحريرها من غشاء الميتوكوندريا الداخلية باستخراج كلوروفورم. كذلك هو تنقية المجمع الانزيمية بتبادل شاردة متتالية وحجم الاستبعاد اللوني. التقنيات الحساسة الكتلي أظهر أن المجمع المنقي خاليا من أي ملوثات البروتين، ولذلك يمثل مادة مناسبة لتحديد بنية البلورات بالأشعة السينية أو المجهر الإلكتروني cryo. و معزولة1-ATPase معارض النشاط هيدروليكي ATP، التي يمكن أن تحول دون تماما بأزيد الصوديوم، مثبط قوية من ATP و من نوع سينثاسيس. ويظل المجمع المنقي مستقرة ونشطة لمدة ثلاثة أيام على الأقل في درجة حرارة الغرفة. هطول الأمطار بسلفات الأمونيوم يستخدم للتخزين على المدى الطويل. وقد استخدمت إجراءات مماثلة لتنقية و1-أتباسيس من أنسجة الثدييات والنباتات، والخمائر، أو البكتيريا. وهكذا، يمكن أن تخدم البروتوكول المقدم كمبدأ توجيهي لل و1-ATPase في معزل عن غيرها من الكائنات.

تنقية نموذجية (الشكل 1) يبدأ مع حويصلات المتقدرية (ميتوبلاستس) المعزولة على التدرج بركل من 1 × 10 هيبوتونيكالي تفكيك11 إلى 2 × 1011 بروسيكليك البروسية ت. الخلايا25 مثقف في المعيار 27الغنية الجلوكوز SDM-79 المتوسطة. مجزأة مي...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of F1-ATPase from the Parasitic Protist Trypanosoma brucei at JoVE.com

Isolation of F1-ATPase from the Parasitic Protist Trypanosoma brucei

يصف هذا البروتوكول تنقية إف1-ATPase من مرحلة الحشرات مثقف المثقبيات البروسية. الإجراء غلة معقدة جداً نقية ومتجانسة ونشط مناسبة لدراسات هيكلية والانزيميه.

عزل و1-ATPase من "طلائعيات طفيلية" المثقبيات البروسية

F1-ATPase is a membrane-extrinsic catalytic subcomplex of F-type ATP synthase, an enzyme that uses the proton motive force across biological membranes to ...

ويستند تنقية F1-ATPase على الطرق الكيميائية الحيوية الكلاسيكية التي ثبت أن تكون حاسمة لفهمنا لآلية إنتاج ATP من قبل synthases ATP الأخرى. والميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تنتج إنزيما نقيا للغاية ومناسبا لتحديد الهيكل عن طريق التصوير البلوري بالأشعة السينية أو المجهر الإلكتروني المبرد. على الرغم من أن هذا البروتوكول هو الأمثل لعزل F1-ATPase من المثقبيات، فإنه يمكن تكييفها لمصادر أخرى، مثل الأنسجة أو الخلايا الثقافية، وإلى مختلف ضمائر المسببة للأمراض.وقد تؤدي هذه التقنية إلى تحديد أدوية جديدة لعلاج الأمراض البشرية الحادة. على سبيل المثال، مرض السل الميكوبتريا F-ATPase هو هدف المخدرات الموثقة لعلاج السل. لبدء البروتوكول، ذوبان وتجميل بلطف الحويصلات الميتوكوندريا، والمعروف أيضا باسم البلاستك، معزولة سابقا من قبل تحلل هابوتوني من مرة واحدة 10 إلى 11 إلى مرتين 10 إلى الخلايا 11 من procyclic Trypanosoma بروسي في خمس ملليلتر من الجليد الباردة العازلة A.Keep العينة المبردة.المقبل, تحديد تركيز البروتين في التعليق من قبل حمض bicinchoninic, أو BCA, تحليل البروتين وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. قم بإجراء سلسلة تخفيف BSA في المياه النقية للغاية لبناء المنحنى القياسي. تخفيف كمية صغيرة من العينة 20 إلى 100 مرة مع المياه النقية جدا لتناسب مجموعة من معايير BSA.بعد حساب كمية البروتين الإجمالية في العينة، وجلب تركيز البروتين إلى 16 ملليغرام لكل ملليلتر عن طريق تمييع ذلك مع المخزن المؤقت A.Then جزء من العيّنات إلى vesicles مقلوب وقطع الغشاء عن طريق سونيكيشن سبع مرات لمدة 15 ثانية لكل منهما، مع طاقة إجمالية من 70 إلى 100 جول لكل دفعة مع ميكروتيب بقطر 3.9 ملليمتر. أثناء التفتت، احتضان العينة على الجليد لمدة 30 ثانية بين النبضات. بعد سونيكيشن، قد يبدو التعليق أغمق قليلا.ترسب شظايا الغشاء عن طريق الطرد فوق المركز في 54، 000 غرام لمدة 16 ساعة أو في 98،000 غرام لمدة خمس ساعات في أربع درجات مئوية. Decant المابير والمضي قدما في استخراج الكلوروفورم. حساب حجم المخزن المؤقت B استناداً إلى إجمالي مقدار المخزن المؤقت A المستخدمة.نقل الرواسب المجمدة من أنبوب الطرد المركزي إلى المهيج. Resuspend بيليه من الأغشية الميتوكوندريا في العازلة B بمساعدة من التجانس Dounce الصغيرة. نقل تعليق إلى أنبوب مخروطي 50 ملليلتر.إزالة العينة من الجليد، والحفاظ على العينة وجميع الحلول في درجة حرارة الغرفة للخطوات المتبقية. ثم إضافة الكلوروفورم المشبعة مع اثنين من تريس الضرس تعديلها مع حمض الهيدروكلوريك إلى 8.5 pH، واحد إلى واحد. أغلق الغطاء بإحكام، واهز العينة بقوة لمدة 20 ثانية بالضبط.فورا الطرد المركزي الخليط في 8، 400 غرام لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك، قم بنقل المرحلة العلوية المائعة الغائمة إلى 1.6 ملليلتر من الأنابيب الدقيقة. إضافة مثبطات البروتياز إلى العينة لتحل محل مثبطات إزالة العلاج الكلوروفورم.أجهزة الطرد المركزي العينات في 13، 000 غرام لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد الدوران، نقل supernatant إلى الأنابيب الدقيقة الطازجة، وتكرار الطرد المركزي لإزالة أي مادة غير قابلة للذوبان المتبقية. اكويبيرت في تبادل أنيون خمسة ملليلتر Q العمود تعلق على نظام كروماتوغرافيا السائلة البروتينية السريعة مع 50 ملليلتر من Q عمود العازلة بمعدل تدفق من خمسة ملليلتر في الدقيقة حتى امتصاص في 280 نانومتر واستقرار الموصلية.قم بتحميل المُنَافق فوق العمود المُعدل بمعدل تدفق قدره ملليلتر واحد في الدقيقة. انتظر حتى الامتصاص في 280 نانومتر يستقر في الخلفية. تطبيق تدرج خطي 25 ملليلتر من عمود Q العازلة من 0٪ إلى 100٪ بمعدل تدفق 0.5 ملليلتر في الدقيقة وجمع الكسور ملليلتر واحد.مقايسة 10 ميكرولترات من كل كسر الفردية المقابلة لذروة elution الرئيسية ل ATP النشاط المائي في المليلتر من خليط التفاعل من قبل مقايسة ATPase بولمان في درجة PH 8.0. تجمّع الكسور التي تعرض نشاط ATPase. تركيز العينة المجمعة عن طريق الترشيح الفائق الغشاء باستخدام عمود تدور مع 100،000 الجزيئية خفض الوزن PES مرشح إلى 200 إلى 500 ميكرولترات.ثم انتقل إلى حجم استبعاد الكروماتوغرافيا. اكويبير العمود زيادة 6 سوبروز تعلق على نظام الكروماتوغرافيا السائل مع ما لا يقل عن 48 ملليلتر من العازلة SEC بمعدل تدفق 0.5 ملليلتر في الدقيقة الواحدة. تطبيق النموذج إلى العمود.تشغيل الكروماتوغرافيا بمعدل تدفق 0.25 ملليلتر في الدقيقة الواحدة، مع جمع 0.25 ملليلتر الكسور. بعد ذلك، تشغيل 10 ميكرولترات من الكسور التي تتوافق مع قمم الأشعة فوق البنفسجية 280 نانومتر امتصاص تتبع على SDS-PAGE. ثم وصمة العينات مع Coomassie الأزرق.مقايسة الكسور المقابلة لأول قمة رئيسية تحتوي على ذروة F1 للنشاط ATP الهيدرولوجي وحساسية الأزيدية من قبل تحليل بولمان ATPase. ثم إجراء فحص BCA لتحديد تركيز البروتين. وأخيرا، والحفاظ على F1-ATPase تنقية في درجة حرارة الغرفة، واستخدامها في غضون ثلاثة أيام بعد تنقية لتطبيقات المصب.يعرض هذا الملف الجانبي للتصوير اللوني لـ Anion Exchange امتصاص الأشعة فوق البنفسجية عند 280 نانومتر وتركيز كلوريد الصوديوم في عازلة الاستيرويد. تم فصل الكسور المختارة على هلام SDS-PAGE وملطخة بصبغة Coomassie Blue. تم تجميع الكسور التي تتوافق مع ذروة elution الرئيسية من الكروماتوغرافيا التبادل anion وتحتوي على F1-ATPase، وركزت، واستخدمت كمدخلات ل اللوني اقصاها حجم.الملوثات الرئيسية هي ديهيدرولبوليل ديهيدروجيناز، الذي يسيل من العمود الكروموغرافيا الحجم استبعاد كذروة منفصلة. وF1-ATPase elutes في أول قمة مهيمنة، إلى حد كبير متماثل. يظهر تلطيخ Coomassie Blue لنمط نطاق نموذجي بعد فصل F1-ATPase المنقى عبر SDS-PAGE نطاقات ضعيفة متفرقة مرئية فوق نقطة بيتا الفرعية ، والتي تمثل مجموعات فرعية من ألفا ثلاثة قطع رأس بيتا ثلاثة ، وخافترات وأوليجومرات من الوحدات الفرعية ألفا وبيتا ، وخالية من أي ملوثات يمكن اكتشافها بواسطة الطيف الكتلي.أثناء إجراء استخراج الكلوروفورم ، وهي الخطوة الحاسمة للبروتوكول ، من الضروري أن تهز العينة بقوة وتمضي قدماً في فصل الطرد المركزي للمراحل العضوية والمائية على الفور. بعد هذا الإجراء، يمكن أن تتميز F1-ATPase المعزولة بالتفصيل بواسطة قياس الطيف الشامل. علاوة على ذلك، يمكن استخدامه في مقايسات النشاط أو للدراسات الهيكلية، إما من تلقاء نفسها أو في وجود مثبطات مختلفة أو التناظرية الركيزة.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biochemistry

Isolation of F1-ATPase from the Parasitic Protist Trypanosoma brucei

Unit 1

Membrane Transport and Active Transporters

SCIENTISTS IN ACTION

Isolation of Cognate RNA-protein Complexes from Cells Using Oligonucleotide-directed Elution

عزل مجمعات RNA والبروتينات وما شابه ذلك من الخلايا عن طريق شطف موجهة قليل النوكليوتيد-

Ribonucleoprotein particles direct the biogenesis and post-transcriptional regulation of all mRNAs through distinct combinations of RNA binding proteins. ...

An Efficient Method for the Isolation of Highly Purified RNA from Seeds for Use in Quantitative Transcriptome Analysis

وسيلة فعالة لعزل الحمض النووي الريبي العالية النقاء من بذور للاستخدام في التحليل الكمي Transcriptome على

Plant seeds accumulate large amounts of storage reserves comprising biodegradable organic matter. Humans rely on seed storage reserves for food and as ...

Tandem Affinity Purification of Protein Complexes from Eukaryotic Cells

جنبا إلى جنب تقارب تنقية البروتين المجمعات من خلايا حقيقية النواة

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo ...

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

والعزلة وقياسات الجهاز التنفسي من الميتوكوندريا من التمويل نبات

Mitochondria are essential organelles involved in numerous metabolic pathways in plants, most notably the production of adenosine triphosphate (ATP) from ...

Protein Digestion, Ultrafiltration, and Size Exclusion Chromatography to Optimize the Isolation of Exosomes from Human Blood Plasma and Serum

هضم البروتين، أولترافيلتراتيون، وحجم الاستبعاد اللوني لتحسين عزل اكسوسوميس من بلازما الدم البشري والمصل

Exosomes, a type of nanovesicle released from all cell types, can be isolated from any bodily fluid. The contents of exosomes, including proteins and ...

Rapid Isolation of the Mitoribosome from HEK Cells

عزل ميتوريبوسومي من الخلايا HEK السريع

The human mitochondria possess a dedicated set of ribosomes (mitoribosomes) that translate 13 essential protein components of the oxidative ...

Isolation of Tissue Extracellular Vesicles from the Liver

عزل الحويصلات خارج الخلية الأنسجة من الكبد

Extracellular vesicles (EVs) can be released from many different cell types and detected in most, if not all, body fluids. EVs can participate in ...

Isolation of Lipoprotein Particles from Chicken Egg Yolk for the Study of Bacterial Pathogen Fatty Acid Incorporation into Membrane Phospholipids

عزل جزيئات البروتين الدهني من صفار بيض الدجاج لدراسة دمج الأحماض الدهنية المسببة للأمراض البكتيرية في الدهون الفوسفاتية الغشاء

Staphylococcus aureus and other Gram-positive pathogens incorporate fatty acids from the environment into membrane phospholipids. During infection, the ...

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

Translating Ribosome Affinity Purification TRAP for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

ترجمة تنقية التقارب الريبوسم (TRAP) لعزل الحمض النووي الريبي عن الخلايا البطانية في الجسم الحي

Many studies have been limited to using in vitro cellular assays and whole tissues or isolating of specific cell types from animals for in vitro analysis ...

Ready-To-Use qPCR for Detection of DNA from Trypanosoma cruzi or Other Pathogenic Organisms

Ready-To-Use qPCR for Detection of DNA from Trypanosoma cruzi or Other Pathogenic Organisms

qPCR جاهز للاستخدام للكشف عن الحمض النووي من المثقبية الكروزية أو الكائنات المسببة للأمراض الأخرى

Real-time PCR (qPCR) is a remarkably sensitive and precise technique&#160;that allows for amplifying&#160;minute amounts of nucleic acid targets from a ...