Name: isolation of f1-atpase from the parasitic protist trypanosoma brucei
Uploaded: 2019-01-22T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of F1-ATPase from the Parasitic Protist Trypanosoma brucei at JoVE.com

Dette arbejde blev finansieret af Ministeriet for uddannelse ERC CZ give LL1205, Grant agenturet af Tjekkiet grant 18-17529S, og ved EFRU/ESF projekt Centre for forskning af patogenicitet og virulens af parasitter (nr. CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_019/0000759).

1. buffere og løsninger
<ol><li>Forberede de løsninger, der er anført nedenfor. Degas alle buffere for væskekromatografi. Tilføje ADP, benzamidine og protease-hæmmere lige før brug.<ol>
<li>Forberede buffer A: 50 mM Tris buffer med saltsyre (Tris-HCl) pH 8,0, 0,25 M saccharose, 5 mM benzamidine, 5 mM aminokapronsyre syre (ACA) og protease-hæmmere (10 µM amastatin 50 µM bestatin, 50 µM pepstatin, 50 µM leupeptin og 50 µM diprotin A).</li>
		<li>Forberede buffer B: 50 mM Tris-HCl pH 8.0, 0,25 M saccharose, 4...

<ol>
	<li>Walker, J. E., Wikstr&#246;m, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure,+mechanism+and+regulation+of+ATP+synthases.">Structure, mechanism and regulation of ATP synthases.</a> Mechanisms of Primary Energy Transduction in Biology. , 338-373 (2017).</li><li>Pullman, M. E., Penefsky, H. S., Datta, A., Racker, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partial+resolution+of+the+enzymes+catalyzing+oxidative+phosphorylation.+I.+Purification+and+properties+of+soluble+dinitrophenol-stimulated+adenosine+triphosphatase.">Partial resolution of the enzymes catalyzing oxidative phosphorylation. I. Purification and properties of soluble dinitrophenol-stimulated adenosine triphosphatase.</a> The Journal of Biological Chemistry. 235, 3322-3329 (1960).</li><li>Schatz, G., Penefsky, H. S., Racker, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partial+resolution+of+the+enzymes+catalyzing+oxidative+phosphorylation.">Partial resolution of the enzymes catalyzing oxidative phosphorylation.</a> XIV. The Journal of Biological Chemistry. 242 (10), 2552-2560 (1967).</li><li>Racker, E., Horstman, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partial+resolution+of+the+enzymes+catalyzing+oxidative+phosphorylation.+13.+Structure+and+function+of+submitochondrial+particles+completely+resolved+with+respect+to+coupling+factor.">Partial resolution of the enzymes catalyzing oxidative phosphorylation. 13. Structure and function of submitochondrial particles completely resolved with respect to coupling factor.</a> The Journal of Biological Chemistry. 242 (10), 2547-2551 (1967).</li><li>Senior, A. E., Brooks, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+the+mitochondrial+oligomycin-insensitive+ATPase.+I.+An+improved+method+of+purification+and+the+behavior+of+the+enzyme+in+solutions+of+various+depolymerizing+agents.">Studies on the mitochondrial oligomycin-insensitive ATPase. I. An improved method of purification and the behavior of the enzyme in solutions of various depolymerizing agents.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 140 (1), 257-266 (1970).</li><li>Tzagoloff, A., Meagher, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+the+mitochondrial+membrane+system.+V.+Properties+of+a+dispersed+preparation+of+the+rutamycin-sensitive+adenosine+triphosphatase+of+yeast+mitochondria.">Assembly of the mitochondrial membrane system. V. Properties of a dispersed preparation of the rutamycin-sensitive adenosine triphosphatase of yeast mitochondria.</a> The Journal of Biological Chemistry. 246 (23), 7328-7336 (1971).</li><li>Beechey, R. B., Hubbard, S. A., Linnett, P. E., Mitchell, A. D., Munn, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+rapid+method+for+the+preparation+of+adenosine+triphosphatase+from+submitochondrial+particles.">A simple and rapid method for the preparation of adenosine triphosphatase from submitochondrial particles.</a> Biochemical Journal. 148 (3), 533-537 (1975).</li><li>Tyler, D. D., Webb, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+properties+of+the+adenosine+triphosphatase+released+from+the+liver+mitochondrial+membrane+by+chloroform.">Purification and properties of the adenosine triphosphatase released from the liver mitochondrial membrane by chloroform.</a> Biochemical Journal. 178 (2), 289-297 (1979).</li><li>Hack, E., Leaver, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+alpha-subunit+of+the+maize+F1-ATPase+is+synthesised+in+the+mitochondrion.">The alpha-subunit of the maize F1-ATPase is synthesised in the mitochondrion.</a> The EMBO Journal. 2 (10), 1783-1789 (1983).</li><li>Dunn, P. P., Slabas, A. R., Moore, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+F1-ATPase+from+cuckoo-pint+(Arum+maculatum)+mitochondria.+A+comparison+of+subunit+composition+with+that+of+rat+liver+F1-ATPase.">Purification of F1-ATPase from cuckoo-pint (Arum maculatum) mitochondria. A comparison of subunit composition with that of rat liver F1-ATPase.</a> Biochemical Journal. 225 (3), 821-824 (1985).</li><li>Satre, M., Bof, M., Vignais, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+Escherichia+coli+adenosine+triphosphatase+with+aurovertin+and+citreoviridin:+inhibition+and+fluorescence+studies.">Interaction of Escherichia coli adenosine triphosphatase with aurovertin and citreoviridin: inhibition and fluorescence studies.</a> Journal of Bacteriology. 142 (3), 768-776 (1980).</li><li>Abrahams, J. P., Leslie, A. G., Lutter, R., Walker, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+at+2.8+&#197;+resolution+of+F1ATPase+from+bovine+heart+mitochondria.">Structure at 2.8 &#197; resolution of F1ATPase from bovine heart mitochondria.</a> Nature. 370 (6491), 621-628 (1994).</li><li>Lutter, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallization+of+F1-ATPase+from+bovine+heart+mitochondria.">Crystallization of F1-ATPase from bovine heart mitochondria.</a> Journal of Molecular Biology. 229 (3), 787-790 (1993).</li><li>Kabaleeswaran, V., Puri, N., Walker, J. E., Leslie, A. G., Mueller, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+features+of+the+rotary+catalytic+mechanism+revealed+in+the+structure+of+yeast+F1-ATPase.">Novel features of the rotary catalytic mechanism revealed in the structure of yeast F1-ATPase.</a> The EMBO Journal. 25 (22), 5433-5442 (2006).</li><li>Shirakihara, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+a+thermophilic+F1-ATPase+inhibited+by+an+epsilon-subunit:+deeper+insight+into+the+epsilon-inhibition+mechanism.">Structure of a thermophilic F1-ATPase inhibited by an epsilon-subunit: deeper insight into the epsilon-inhibition mechanism.</a> The FEBS Journal. 282 (15), 2895-2913 (2015).</li><li>Stocker, A., Keis, S., Cook, G. M., Dimroth, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification,+crystallization,+and+properties+of+F1-ATPase+complexes+from+the+thermoalkaliphilic+Bacillus+sp.+strain+TA2.A1.">Purification, crystallization, and properties of F1-ATPase complexes from the thermoalkaliphilic Bacillus sp. strain TA2.A1.</a> Journal of Structural Biology. 152 (2), 140-145 (2005).</li><li>Ferguson, S. A., Cook, G. M., Montgomery, M. G., Leslie, A. G., Walker, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+thermoalkaliphilic+F1-ATPase+from+Caldalkalibacillus+thermarum.">Regulation of the thermoalkaliphilic F1-ATPase from Caldalkalibacillus thermarum.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (39), 10860-10865 (2016).</li><li>Cataldi de Flombaum, M. A., Frasch, A. C. C., Stoppani, A. O. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenosine+triphosphatase+from+Trypanosoma+cruzi:+purification+and+properties.">Adenosine triphosphatase from Trypanosoma cruzi: purification and properties.</a> Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Comparative Biochemistry. 65 (1), 103-109 (1980).</li><li>Williams, N., Frank, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrial+ATP+synthase+of+Trypanosoma+brucei:+isolation+and+characterization+of+the+intact+F1+moiety.">The mitochondrial ATP synthase of Trypanosoma brucei: isolation and characterization of the intact F1 moiety.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. 43 (1), 125-132 (1990).</li><li>Higa, A. I., Cazzulo, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mg2+-activated+adenosine+triphosphatase+from+Crithidia+fasciculata:+purification+and+inhibition+by+suramin+and+efrapeptin.">Mg2+-activated adenosine triphosphatase from Crithidia fasciculata: purification and inhibition by suramin and efrapeptin.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. 3 (6), 357-367 (1981).</li><li>Walker, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+structure+and+subunit+stoichiometry+of+F1-ATPase+from+bovine+mitochondria.">Primary structure and subunit stoichiometry of F1-ATPase from bovine mitochondria.</a> Journal of Molecular Biology. 184 (4), 677-701 (1985).</li><li>Mueller, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ni-chelate-affinity+purification+and+crystallization+of+the+yeast+mitochondrial+F1-ATPase.">Ni-chelate-affinity purification and crystallization of the yeast mitochondrial F1-ATPase.</a> Protein Expression and Purification. 37 (2), 479-485 (2004).</li><li>Gahura, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+F1-ATPase+from+Trypanosoma+brucei+is+elaborated+by+three+copies+of+an+additional+p18-subunit.">The F1-ATPase from Trypanosoma brucei is elaborated by three copies of an additional p18-subunit.</a> The FEBS Journal. 285 (3), 614-628 (2018).</li><li>Montgomery, M. G., Gahura, O., Leslie, A. G. W., Zikova, A., Walker, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATP+synthase+from+Trypanosoma+brucei+has+an+elaborated+canonical+F1-domain+and+conventional+catalytic+sites.">ATP synthase from Trypanosoma brucei has an elaborated canonical F1-domain and conventional catalytic sites.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (9), 2102-2107 (2018).</li><li>Schneider, A., Charriere, F., Pusnik, M., Horn, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+mitochondria+from+procyclic+Trypanosoma+brucei.">Isolation of mitochondria from procyclic Trypanosoma brucei.</a> Methods in Molecular Biology. 372, 67-80 (2007).</li><li>Smith, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+protein+using+bicinchoninic+acid.">Measurement of protein using bicinchoninic acid.</a> Analytical Biochemistry. 150 (1), 76-85 (1985).</li><li>Wirtz, E., Leal, S., Ochatt, C., Cross, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tightly+regulated+inducible+expression+system+for+conditional+gene+knock-outs+and+dominant-negative+genetics+in+Trypanosoma+brucei.">A tightly regulated inducible expression system for conditional gene knock-outs and dominant-negative genetics in Trypanosoma brucei.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. 99 (1), 89-101 (1999).</li><li>Speijer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+respiratory+chain+from+cultured+Crithidia+fasciculata.">Characterization of the respiratory chain from cultured Crithidia fasciculata.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. 85 (2), 171-186 (1997).</li><li>Nelson, R. E., Aphasizheva, I., Falick, A. M., Nebohacova, M., Simpson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+I-complex+in+Leishmania+tarentolae+is+an+uniquely-structured+F1-ATPase.">The I-complex in Leishmania tarentolae is an uniquely-structured F1-ATPase.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. 135 (2), 221-224 (2004).</li><li>Carbajo, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+the+N-terminal+domain+of+the+OSCP+subunit+of+bovine+F1Fo-ATP+synthase+interacts+with+the+N-terminal+region+of+an+alpha+subunit.">How the N-terminal domain of the OSCP subunit of bovine F1Fo-ATP synthase interacts with the N-terminal region of an alpha subunit.</a> Journal of Molecular Biology. 368 (2), 310-318 (2007).</li><li>Bowler, M. W., Montgomery, M. G., Leslie, A. G., Walker, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ground+state+structure+of+F1-ATPase+from+bovine+heart+mitochondria+at+1.9+&#197;+resolution.">Ground state structure of F1-ATPase from bovine heart mitochondria at 1.9 &#197; resolution.</a> The Journal of Biological Chemistry. 282 (19), 14238-14242 (2007).</li></ol>

Protokol for F1-ATPase rensning fra T. brucei blev udviklet baseret på tidligere udgivne metoder til isolering af F1-ATPase komplekser fra andre arter13,14. Metoden kræver ikke nogen genetisk modifikation (f.eks.kodning) og giver et fuldt aktivt kompleks med alle underenheder stede. Det afgørende skridt er chloroform-faciliteret udgivelsen af F1-ATPase fra den membran-attached del af enzymet. Den frigivne subc...

F-type ATP synthases er membran-bundet roterende multiprotein komplekser at par proton translokation over energi-transducing membraner af bakterier, mitokondrier og kloroplaster med dannelsen af ATP. Molekylær detaljer af den roterende mekanisme for ATPsyntesen er kendt primært på grund af strukturelle undersøgelser af renset bakteriel og mitokondriel ATP synthases og deres subcomplexes1. F-type ATPsyntase er organiseret i membran-iboende og membran-ydre fraspaltning. Den membran-ydre del, kendt som F1-ATPase, indeholder tre katalytiske steder, hvor fosforylering af adenosin ud (ADP) til ATP eller den modsatte reaktion opstår. F1-ATPase eksperimentelt kan frigøres fra den membran-iboende gruppe samtidig bevare sin evne til at hydrolysere, men ikke syntetisere, ATP. Membran-bundet sektor, kaldet Fo, medierer protein translokation, som drev rotation af den centrale del af enzymet. F1 og Fo sektorer er forbundet med de centrale og perifere stilke.
Først forsøg på at rense F1-ATPase fra spirende gær og kvæg hjerte mitokondrier dato tilbage til i 1960 ' erne. Disse protokoller bruges udvundet mitokondrier, som blev afbrudt ved hjælp af sonikering, fraktioneret af ammonium eller protamine sulfat nedbør, efterfulgt af valgfri kromatografi trin og varmebehandling2,3,4 ,5,6. Rensning blev stærkt forbedret og forenklet ved brug af chloroform, som let frigiver F1-ATPase fra den mitokondrielle membran fragmenter7. Chloroform udvinding blev derefter brugt til at udtrække F1- ATPases fra forskellige dyr, plante og bakteriel kilder (f.eks., rotte lever8, majs9, Arum maculatum10og Escherichia coli 11). Yderligere rensning af chloroform-udgivet F1-ATPase ved affinitet eller størrelse-udelukkelse kromatografi (SEC) givet en meget ren protein kompleks, som var egnet til høj opløsning struktur bestemmelse af røntgenkrystallografi, som dokumenteret af strukturer af F1-ATPase fra kvæg hjerte12,13 og Saccharomyces cerevisiae14. F1-ATPase strukturer blev også bestemt ud fra organismer, der er vanskelige at dyrke, og mængden af den oprindelige biologiske materiale var således begrænset. I dette tilfælde, F1-ATPase underenheder blev kunstigt udtrykt og samles til kompleks i E. coli, og hele heterolog enzymet blev renset af affinitet kromatografi via en mærket underenhed. Sådan tilgang har ført til bestemmelse af F1-ATPase strukturer fra to termofile bakteriearter, Geobacillus stearothermophilus15 og Caldalkalibacillus thermarum16, 17. denne metode er dog temmelig uegnede til eukaryote F1- ATPases da det afhængig af prokaryote protheosynthetic apparater, posttranslationelle forarbejdning og komplekse forsamling.
Chloroform-baseret udvinding blev tidligere brugt til at isolere F1- ATPases fra encellede digenetic parasitter Trypanosoma cruzi18 og T. brucei19, vigtige pattedyr patogener forårsager amerikanske og Afrikanske trypanosomiases, henholdsvis, og fra monogene insekt parasit Crithidia fasciculata20. Disse purifications førte kun til en simpel beskrivelse af F1- ATPases, da ingen downstream programmer blev anvendt til fuldt ud at beskrive sammensætning, struktur og enzymatiske egenskaber af komplekset. Denne artikel beskriver en optimeret metode til F1-ATPase rensning fra stadiet kulturperler insekt livscyklus af T. brucei. Metoden er udviklet baseret på de fastlagte protokoller til isolation af kvæg og gær F1- ATPases21,22. Proceduren, der giver meget rene og homogen enzym velegnet til in vitro- enzymatisk og hæmmende assays, detaljerede proteom karakterisering af massespektrometri23og struktur bestemmelse24. Rensning-protokollen og kendskab til F1-ATPase strukturen på det atomare niveau åbner mulighed for at designe skærme til at identificere små-molekyle hæmmere, og støtte i udviklingen af nye lægemidler mod afrikanske trypanosomiases. Derudover protokollen kan tilpasses til at rense F1-ATPase fra andre organismer.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosin Diphosphate Disodium Salt (ADP)</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A0948</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amastatin Hydrochloride</td>
			<td>Glantham Life Sciences</td>
			<td>GA1330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aminocaproic Acid</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A2266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>ThermoFischer Scientific/Pierce</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzamidine Hydrochloride</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>199001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bestatin Hydrochloride</td>
			<td>Sigma Aldrich/Merck</td>
			<td>B8385</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete Tablets, Mini EDTA-free</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4693159001</td>
			<td>Protease inhibitor cocktail tablets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic Acid (EDTA)</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td></td>
			<td>For pH adjustment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ile-Pro-Ile</td>
			<td>Sigma Aldrich/Merck</td>
			<td>I9759</td>
			<td>Alias Diprotin A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leupeptin</td>
			<td>Sigma Aldrich/Merck</td>
			<td>L2884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate Heptahydrate</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pepstatin A</td>
			<td>Sigma Aldrich/Merck</td>
			<td>P5318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Electrophoresis System</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Consumables</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Tubes for SW60Ti, Polyallomer</td>
			<td>Beckman Coulture</td>
			<td>328874</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DounceTissues Homogenizer 2 mL</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Vacuum Filtration Device</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>516-7017</td>
			<td>Degasing solutions for liquid chromatography</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiTrap Q HP, 5 mL</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>17115401</td>
			<td>Anion exchange chromatography column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Regenaretad Cellulose Membrane Filters, pore size 0.45 &#956;m, diameter 47 mm</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>18406--47------N</td>
			<td>Degasing solutions for liquid chromatography</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superdex 200 Increase 10/300 GL</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>29091596</td>
			<td>Size-exclusion chromatography column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vivaspin 6 MWCO 100 kDa PES</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>VS0641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AKTA Pure 25</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>29018224</td>
			<td>Or similar FPLC system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer Shimadzu UV-1601</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td></td>
			<td>Or similar spectrophotometer with kinetic assay mode</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge Beckman Optima with SW60Ti Rotor</td>
			<td>Beckman Coulture</td>
			<td></td>
			<td>Or similar ultracentrifuge and rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic Homogenizer with Thin Probe, Model 3000</td>
			<td>BioLogics</td>
			<td>0-127-0001</td>
			<td>Or similar ultrasonic homogenizer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of f1-atpase from the parasitic protist trypanosoma brucei

F1-ATPase er en membran-extrinsic katalytiske subcomplex af F-typen ATPsyntase, et enzym, der bruger proton drivkraft over biologiske membraner til fremstilling adenosin trifosfat (ATP). Isolering af de intakte F1-ATPase fra dens oprindelige kilde er en væsentlig forudsætning at karakterisere enzymet protein sammensætning, kinetiske parametre og følsomhed over for hæmmere. En meget ren og homogen F1-ATPase kan bruges til strukturelle studier, der giver indsigt i molekylære mekanismer i ATPsyntesen og hydrolyse. I denne artikel beskrives en procedure til rensning af F1-ATPase fra Trypanosoma brucei, det agens af afrikanske trypanosomiases. F1-ATPase er isoleret fra mitokondrie blærer, som er fremstillet af hypotonic lysis fra in vitro- kulturperler trypanosomes. Vesikler er mekanisk opsplittet af sonikering og F1-ATPase er frigivet fra den indre mitokondrielle membran af chloroform udvinding. Enzymatisk komplekset er yderligere renset af på hinanden følgende anion exchange og størrelse-udelukkelse kromatografi. Følsomme massespektrometri teknikker viste at renset komplekset er blottet for næsten alle protein forurenende stoffer, og derfor repræsenterer egnet materiale til struktur bestemmelse af røntgenkrystallografi eller kryo-elektronmikroskopi. Den isolerede F1-ATPase udstiller ATP hydrolytisk aktivitet, som kan hæmmes fuldt af natriumazid, en potent hæmmer af F-typen ATP synthases. Renset komplekset forbliver stabil og aktive i mindst tre dage ved stuetemperatur. Udfældning af ammonium sulfat bruges til langtidsopbevaring. Lignende procedurer er blevet brugt til rensning af F1- ATPases fra pattedyr og plante væv, gær eller bakterier. Således præsenteret protokollen kan tjene som retningslinje for F1-ATPase isolation fra andre organismer.

En typisk rensning (figur 1) starter med mitokondrie vesikler (mitoplasts) isoleret på Percoll forløbet fra hypotonically mængden 1 x 1011 til 2 x 1011 procyklisk T. brucei celler25 kulturperler i standard glukose-rige SDM-79 medium27. Mitoplasts er fragmenterede ved hjælp af sonikering, spundet, og matrix-holdige supernatanten er kasseret. Mitokondrie membraner er behandlet me...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of F1-ATPase from the Parasitic Protist Trypanosoma brucei at JoVE.com

Isolation of F1-ATPase from the Parasitic Protist Trypanosoma brucei

Denne protokol beskriver rensning af F1-ATPase fra den kulturperle insekt fase af Trypanosoma brucei. Proceduren, der giver en meget ren, ensartet og aktive kompleks egnet til strukturelle og enzymatiske undersøgelser.

Isolering af F1-ATPase fra parasitære Protist Trypanosoma brucei

F1-ATPase is a membrane-extrinsic catalytic subcomplex of F-type ATP synthase, an enzyme that uses the proton motive force across biological membranes to ...

Rensningen af F1-ATPase er baseret på en klassisk biokemiske metoder, som viste sig at være afgørende for vores forståelse af mekanismen for ATP-produktion af andre ATP syntase. Den største fordel ved denne teknik er, at det producerer et meget rent enzym egnet til struktur bestemmelse ved X-ray krystallografi eller kryo-elektron mikroskopi. Selv om denne protokol er optimeret til isolering af F1-ATPase fra trypanosoms, det kan tilpasses til andre kilder, såsom væv eller kulturceller, og til forskellige patogene protists.Denne teknik kan føre til identifikation af nye lægemidler til behandling af alvorlige sygdomme hos mennesker. For eksempel, Mycobacterium tuberkulose F-ATPase er et godkendt lægemiddel mål for behandling af tuberkulose. For at begynde protokollen, tø og forsigtigt resuspend mitokondrielle vesikler, også kendt som mitoplast, tidligere isoleret af hypotoniske lysis fra en gange 10 til 11 til to gange 10 til de 11 celler af procykliske Trypanosoma brucei i fem milliliter iskold Buffer A.Hold prøven kølet.Dernæst bestemme proteinkoncentrationen i suspensionen af bicinchoninic syre, eller BCA, protein assay i henhold til producentens anvisninger. Udfør en BSA fortyndingsserie i ultra rent vand for at konstruere standardkurven. En lille mængde af prøven fortyndes 20 til 100 gange med ultra rent vand, så den passer ind i BSA-standarderne.Efter beregning af den samlede protein mængde i prøven, bringe proteinkoncentrationen til 16 mg pr. milliliter ved at fortynde det med yderligere Buffer A.Derefter fragmentere mitoplasterne i omvendte vesikler og membran stykker ved sonikering syv gange i 15 sekunder hver, med en samlet energi på 70 til 100 joule per impuls med en mikrotip med en diameter på 3,9 millimeter. Under fragmentering inkuberes prøven på is i 30 sekunder mellem impulserne. Efter sonikeringen kan suspensionen forekomme lidt mørkere.Afsaltning af membranfragmenterne ved ultracentrifugering ved 54.000 g i 16 timer eller ved 98.000 g i fem timer ved fire grader Celsius. Supernatanten dekanteres, og chloroformekstraktionen fortsættes. Beregn mængden af buffer B baseret på den samlede mængde buffer A, der er brugt.Det frosne sediment overføres fra centrifugerøret til homogenisatoren. Opslæmning pellet af mitokondrielle membraner i Buffer B ved hjælp af en lille Dounce homogenisator. Suspensionen overføres til et konisk rør på 50 milliliter.Tag prøven ud af isen, og hold prøven og alle opløsningerne ved stuetemperatur i de resterende trin. Derefter tilsættes chloroform mættet med to kindtand tris justeret med HCl til pH 8,5, en til en. Luk hætten tæt, og ryst prøven kraftigt i nøjagtig 20 sekunder.Straks centrifuge blandingen ved 8, 400 g i fem minutter ved stuetemperatur. Dernæst overføre den øvre, overskyede vandige fase til 1,6 milliliter mikrorør. Der tilsættes proteasehæmmere til prøven for at erstatte de inhibitorer, der fjernes ved chloroformbehandlingen.Centrifuge prøverne ved 13,000 g i 30 minutter ved stuetemperatur. Efter spin, overføre supernatant til friske mikrorør, og gentag centrifugering for at fjerne eventuelle resterende uopløselige materiale. Ligevægt af den fem milliliter anionbytte Q kolonne fastgjort til et hurtigt protein flydende kromatografi system med 50 milliliter Q kolonne buffer ved en strømningshastighed på fem milliliter i minuttet, indtil absorbansen ved 280 nanometer og ledningsevne stabilisere.Supernatanten læsses på den ligevægtede kolonne med en strømningshastighed på 1 milliliter pr. minut. Vent, indtil absorbansen ved 280 nanometer stabiliserer sig i baggrunden. Der anvendes en lineær forløb på 25 milliliter af Elution bufferen Q fra 0% til 100% ved en strømningshastighed på 0,5 milliliter pr. minut, og der indsamles en milliliterfraktion.Assay 10 mikroliter af hver enkelt fraktion svarende til den største elution peak for ATP hydrolytisk aktivitet pr på milliliter reaktion blanding af Pullman ATPase assay ved pH 8,0. Pool de brøker, der udviser ATPase-aktivitet. Koncentrat den samlede prøve ved membran ultrafiltrering ved hjælp af en spin kolonne med en 100, 000 molekylvægt cutoff PES filter til 200 til 500 mikroliter.Fortsæt derefter til størrelse udelukkelse kromatografi. Udjævn af Superose 6 Forøg kolonnen, der er fastgjort til et flydende kromatografisystem, med mindst 48 milliliter SEC-buffer ved en strømningshastighed på 0,5 milliliter pr. minut. Anvend eksemplet på kolonnen.Kromatografien køres med en strømningshastighed på 0,25 milliliter pr. minut, mens der indsamles 0,25 milliliterfraktioner. Dernæst køre 10 mikroliter af de fraktioner, der svarer til toppene af UV 280 nanometer absorbance spor på SDS-PAGE. Derefter pletter prøverne med Coomassie Blue.Analysere de fraktioner, der svarer til den første større top, der indeholder F1-toppen for ATP-hydrolytisk aktivitet og azide følsomhed ved Pullman ATPase-analysen. Derefter udføre en BCA analyse til at bestemme proteinkoncentrationen. Endelig skal du holde den rensede F1-ATPase ved stuetemperatur og bruge den inden for tre dage efter rensning til downstream-applikationer.Denne elution profil af en anionbytterkromatografi viser UV-absorbansen ved 280 nanometer og koncentration af natriumchlorid i elution bufferen. De valgte fraktioner blev adskilt på SDS-PAGE gel og farves med Coomassie Blue farvestof. De fraktioner, der svarer til den største elution peak fra anion udveksling kromatografi og indeholder F1-ATPase blev grupperet, koncentreret, og anvendes som input til størrelse-udelukkelse kromatografi.Det største forurenende stof er dihydrolipoyldehydrogenase, som elutes fra størrelse-eksklusion kromatografi kolonne som en diskret top. F1-ATPase elutes i den første dominerende, stort set symmetrisk peak. Den Coomassie Blå farvning af en typisk bånd mønster efter adskillelsen af den rensede F1-ATPase via SDS-PAGE viser sporadiske svage bånd synlige over beta underenhed, som repræsenterer subcomplexes af alfa tre beta tre medaljon, dimers og oligomerer af alfa og beta underenheder, og er blottet for eventuelle forurenende stoffer påviselige ved massespektrometri.Under udførelsen af chloroformekstraktionen, som er protokollens kritiske trin, er det vigtigt at ryste prøven kraftigt og straks gå videre til centrifugaladskillelsen af de organiske og vandige faser. Efter denne procedure kan den isolerede F1-ATPase karakteriseres i detaljer ved massespektrometri. Endvidere kan det anvendes i aktivitetsanalyser eller til strukturelle undersøgelser, enten alene eller i nærvær af forskellige inhibitorer eller substratanatanas.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biochemistry

Isolation of F1-ATPase from the Parasitic Protist Trypanosoma brucei

Unit 1

Membrane Transport and Active Transporters

SCIENTISTS IN ACTION

Isolation of Cognate RNA-protein Complexes from Cells Using Oligonucleotide-directed Elution

Isolering af sammenhørende RNA-protein-komplekser fra celler under anvendelse Oligonucleotid-rettet Eluering

Ribonucleoprotein particles direct the biogenesis and post-transcriptional regulation of all mRNAs through distinct combinations of RNA binding proteins. ...

An Efficient Method for the Isolation of Highly Purified RNA from Seeds for Use in Quantitative Transcriptome Analysis

En effektiv metode til isolering af stærkt Renset RNA fra Frø til brug i Kvantitative Transkriptomet Analysis

Plant seeds accumulate large amounts of storage reserves comprising biodegradable organic matter. Humans rely on seed storage reserves for food and as ...

Tandem Affinity Purification of Protein Complexes from Eukaryotic Cells

Tandem affinitetsoprensning af proteinkomplekser fra eukaryote celler

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo ...

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolation og respiratoriske målinger af mitokondrier fra Arabidopsis thaliana

Mitochondria are essential organelles involved in numerous metabolic pathways in plants, most notably the production of adenosine triphosphate (ATP) from ...

Protein Digestion, Ultrafiltration, and Size Exclusion Chromatography to Optimize the Isolation of Exosomes from Human Blood Plasma and Serum

Protein fordøjelse, ultrafiltrering og størrelse udstødelse kromatografi at optimere Isolation af Exosomes fra humant blod Plasma og Serum

Exosomes, a type of nanovesicle released from all cell types, can be isolated from any bodily fluid. The contents of exosomes, including proteins and ...

Rapid Isolation of the Mitoribosome from HEK Cells

Hurtig Isolation af Mitoribosome fra HEK celler

The human mitochondria possess a dedicated set of ribosomes (mitoribosomes) that translate 13 essential protein components of the oxidative ...

Isolation of Tissue Extracellular Vesicles from the Liver

Isolering af vævs Ekstrudulære vesikler fra leveren

Extracellular vesicles (EVs) can be released from many different cell types and detected in most, if not all, body fluids. EVs can participate in ...

Isolation of Lipoprotein Particles from Chicken Egg Yolk for the Study of Bacterial Pathogen Fatty Acid Incorporation into Membrane Phospholipids

Isolering af lipoprotein partikler fra hønseæg æggeblomme til undersøgelse af bakteriel Patogenchlorid fedtsyre inkorporering i membran Fosfolipids

Staphylococcus aureus and other Gram-positive pathogens incorporate fatty acids from the environment into membrane phospholipids. During infection, the ...

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

Translating Ribosome Affinity Purification TRAP for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

Oversættelse af Ribosome affinitets rensning (TRAP) for RNA-isolation fra endotelceller in vivo

Many studies have been limited to using in vitro cellular assays and whole tissues or isolating of specific cell types from animals for in vitro analysis ...

Ready-To-Use qPCR for Detection of DNA from Trypanosoma cruzi or Other Pathogenic Organisms

Ready-To-Use qPCR for Detection of DNA from Trypanosoma cruzi or Other Pathogenic Organisms

Klar til brug qPCR til påvisning af DNA fra Trypanosoma cruzi eller andre patogene organismer

Real-time PCR (qPCR) is a remarkably sensitive and precise technique&#160;that allows for amplifying&#160;minute amounts of nucleic acid targets from a ...