Name: isolation of f1-atpase from the parasitic protist trypanosoma brucei
Uploaded: 2019-01-22T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of F1-ATPase from the Parasitic Protist Trypanosoma brucei at JoVE.com

Dit werk werd gefinancierd door het ministerie van onderwijs ERC CZ verlenen van LL1205, de toekenning van de subsidie Agentschap van Tsjechië 18-17529S, en door het EFRO/ESF project centrum voor onderzoek van de pathogeniteit en de virulentie van parasieten (nr. CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_019/0000759).

1. buffers en oplossingen
<ol><li>Het bereiden van de oplossingen die hieronder vermeld. Ontgas alle buffers voor vloeistofchromatografie. Toevoegen van ADP, benzamidine en protease remmers vlak voor gebruik.<ol>
<li>Bereiden buffer A: 50 mM Tris buffer met zoutzuur (Tris-HCl) pH 8.0, 0,25 M sacharose, benzamidine 5 mM, 5 mM aminocaproic zuur (ACA) en protease remmers (10 µM amastatin, 50 µM bestatin 50 µM pepstatin, 50 µM leupeptin en 50 µM diprotin A).</li>
		<li>Buffer B: 50 mM Tris-HCl pH 8.0, 0,25 M sacharose...

<ol>
	<li>Walker, J. E., Wikstr&#246;m, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure,+mechanism+and+regulation+of+ATP+synthases.">Structure, mechanism and regulation of ATP synthases.</a> Mechanisms of Primary Energy Transduction in Biology. , 338-373 (2017).</li><li>Pullman, M. E., Penefsky, H. S., Datta, A., Racker, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partial+resolution+of+the+enzymes+catalyzing+oxidative+phosphorylation.+I.+Purification+and+properties+of+soluble+dinitrophenol-stimulated+adenosine+triphosphatase.">Partial resolution of the enzymes catalyzing oxidative phosphorylation. I. Purification and properties of soluble dinitrophenol-stimulated adenosine triphosphatase.</a> The Journal of Biological Chemistry. 235, 3322-3329 (1960).</li><li>Schatz, G., Penefsky, H. S., Racker, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partial+resolution+of+the+enzymes+catalyzing+oxidative+phosphorylation.">Partial resolution of the enzymes catalyzing oxidative phosphorylation.</a> XIV. The Journal of Biological Chemistry. 242 (10), 2552-2560 (1967).</li><li>Racker, E., Horstman, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partial+resolution+of+the+enzymes+catalyzing+oxidative+phosphorylation.+13.+Structure+and+function+of+submitochondrial+particles+completely+resolved+with+respect+to+coupling+factor.">Partial resolution of the enzymes catalyzing oxidative phosphorylation. 13. Structure and function of submitochondrial particles completely resolved with respect to coupling factor.</a> The Journal of Biological Chemistry. 242 (10), 2547-2551 (1967).</li><li>Senior, A. E., Brooks, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+the+mitochondrial+oligomycin-insensitive+ATPase.+I.+An+improved+method+of+purification+and+the+behavior+of+the+enzyme+in+solutions+of+various+depolymerizing+agents.">Studies on the mitochondrial oligomycin-insensitive ATPase. I. An improved method of purification and the behavior of the enzyme in solutions of various depolymerizing agents.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 140 (1), 257-266 (1970).</li><li>Tzagoloff, A., Meagher, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+the+mitochondrial+membrane+system.+V.+Properties+of+a+dispersed+preparation+of+the+rutamycin-sensitive+adenosine+triphosphatase+of+yeast+mitochondria.">Assembly of the mitochondrial membrane system. V. Properties of a dispersed preparation of the rutamycin-sensitive adenosine triphosphatase of yeast mitochondria.</a> The Journal of Biological Chemistry. 246 (23), 7328-7336 (1971).</li><li>Beechey, R. B., Hubbard, S. A., Linnett, P. E., Mitchell, A. D., Munn, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+rapid+method+for+the+preparation+of+adenosine+triphosphatase+from+submitochondrial+particles.">A simple and rapid method for the preparation of adenosine triphosphatase from submitochondrial particles.</a> Biochemical Journal. 148 (3), 533-537 (1975).</li><li>Tyler, D. D., Webb, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+properties+of+the+adenosine+triphosphatase+released+from+the+liver+mitochondrial+membrane+by+chloroform.">Purification and properties of the adenosine triphosphatase released from the liver mitochondrial membrane by chloroform.</a> Biochemical Journal. 178 (2), 289-297 (1979).</li><li>Hack, E., Leaver, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+alpha-subunit+of+the+maize+F1-ATPase+is+synthesised+in+the+mitochondrion.">The alpha-subunit of the maize F1-ATPase is synthesised in the mitochondrion.</a> The EMBO Journal. 2 (10), 1783-1789 (1983).</li><li>Dunn, P. P., Slabas, A. R., Moore, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+F1-ATPase+from+cuckoo-pint+(Arum+maculatum)+mitochondria.+A+comparison+of+subunit+composition+with+that+of+rat+liver+F1-ATPase.">Purification of F1-ATPase from cuckoo-pint (Arum maculatum) mitochondria. A comparison of subunit composition with that of rat liver F1-ATPase.</a> Biochemical Journal. 225 (3), 821-824 (1985).</li><li>Satre, M., Bof, M., Vignais, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+Escherichia+coli+adenosine+triphosphatase+with+aurovertin+and+citreoviridin:+inhibition+and+fluorescence+studies.">Interaction of Escherichia coli adenosine triphosphatase with aurovertin and citreoviridin: inhibition and fluorescence studies.</a> Journal of Bacteriology. 142 (3), 768-776 (1980).</li><li>Abrahams, J. P., Leslie, A. G., Lutter, R., Walker, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+at+2.8+&#197;+resolution+of+F1ATPase+from+bovine+heart+mitochondria.">Structure at 2.8 &#197; resolution of F1ATPase from bovine heart mitochondria.</a> Nature. 370 (6491), 621-628 (1994).</li><li>Lutter, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallization+of+F1-ATPase+from+bovine+heart+mitochondria.">Crystallization of F1-ATPase from bovine heart mitochondria.</a> Journal of Molecular Biology. 229 (3), 787-790 (1993).</li><li>Kabaleeswaran, V., Puri, N., Walker, J. E., Leslie, A. G., Mueller, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+features+of+the+rotary+catalytic+mechanism+revealed+in+the+structure+of+yeast+F1-ATPase.">Novel features of the rotary catalytic mechanism revealed in the structure of yeast F1-ATPase.</a> The EMBO Journal. 25 (22), 5433-5442 (2006).</li><li>Shirakihara, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+a+thermophilic+F1-ATPase+inhibited+by+an+epsilon-subunit:+deeper+insight+into+the+epsilon-inhibition+mechanism.">Structure of a thermophilic F1-ATPase inhibited by an epsilon-subunit: deeper insight into the epsilon-inhibition mechanism.</a> The FEBS Journal. 282 (15), 2895-2913 (2015).</li><li>Stocker, A., Keis, S., Cook, G. M., Dimroth, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification,+crystallization,+and+properties+of+F1-ATPase+complexes+from+the+thermoalkaliphilic+Bacillus+sp.+strain+TA2.A1.">Purification, crystallization, and properties of F1-ATPase complexes from the thermoalkaliphilic Bacillus sp. strain TA2.A1.</a> Journal of Structural Biology. 152 (2), 140-145 (2005).</li><li>Ferguson, S. A., Cook, G. M., Montgomery, M. G., Leslie, A. G., Walker, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+thermoalkaliphilic+F1-ATPase+from+Caldalkalibacillus+thermarum.">Regulation of the thermoalkaliphilic F1-ATPase from Caldalkalibacillus thermarum.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (39), 10860-10865 (2016).</li><li>Cataldi de Flombaum, M. A., Frasch, A. C. C., Stoppani, A. O. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenosine+triphosphatase+from+Trypanosoma+cruzi:+purification+and+properties.">Adenosine triphosphatase from Trypanosoma cruzi: purification and properties.</a> Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Comparative Biochemistry. 65 (1), 103-109 (1980).</li><li>Williams, N., Frank, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrial+ATP+synthase+of+Trypanosoma+brucei:+isolation+and+characterization+of+the+intact+F1+moiety.">The mitochondrial ATP synthase of Trypanosoma brucei: isolation and characterization of the intact F1 moiety.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. 43 (1), 125-132 (1990).</li><li>Higa, A. I., Cazzulo, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mg2+-activated+adenosine+triphosphatase+from+Crithidia+fasciculata:+purification+and+inhibition+by+suramin+and+efrapeptin.">Mg2+-activated adenosine triphosphatase from Crithidia fasciculata: purification and inhibition by suramin and efrapeptin.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. 3 (6), 357-367 (1981).</li><li>Walker, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+structure+and+subunit+stoichiometry+of+F1-ATPase+from+bovine+mitochondria.">Primary structure and subunit stoichiometry of F1-ATPase from bovine mitochondria.</a> Journal of Molecular Biology. 184 (4), 677-701 (1985).</li><li>Mueller, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ni-chelate-affinity+purification+and+crystallization+of+the+yeast+mitochondrial+F1-ATPase.">Ni-chelate-affinity purification and crystallization of the yeast mitochondrial F1-ATPase.</a> Protein Expression and Purification. 37 (2), 479-485 (2004).</li><li>Gahura, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+F1-ATPase+from+Trypanosoma+brucei+is+elaborated+by+three+copies+of+an+additional+p18-subunit.">The F1-ATPase from Trypanosoma brucei is elaborated by three copies of an additional p18-subunit.</a> The FEBS Journal. 285 (3), 614-628 (2018).</li><li>Montgomery, M. G., Gahura, O., Leslie, A. G. W., Zikova, A., Walker, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATP+synthase+from+Trypanosoma+brucei+has+an+elaborated+canonical+F1-domain+and+conventional+catalytic+sites.">ATP synthase from Trypanosoma brucei has an elaborated canonical F1-domain and conventional catalytic sites.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (9), 2102-2107 (2018).</li><li>Schneider, A., Charriere, F., Pusnik, M., Horn, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+mitochondria+from+procyclic+Trypanosoma+brucei.">Isolation of mitochondria from procyclic Trypanosoma brucei.</a> Methods in Molecular Biology. 372, 67-80 (2007).</li><li>Smith, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+protein+using+bicinchoninic+acid.">Measurement of protein using bicinchoninic acid.</a> Analytical Biochemistry. 150 (1), 76-85 (1985).</li><li>Wirtz, E., Leal, S., Ochatt, C., Cross, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tightly+regulated+inducible+expression+system+for+conditional+gene+knock-outs+and+dominant-negative+genetics+in+Trypanosoma+brucei.">A tightly regulated inducible expression system for conditional gene knock-outs and dominant-negative genetics in Trypanosoma brucei.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. 99 (1), 89-101 (1999).</li><li>Speijer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+respiratory+chain+from+cultured+Crithidia+fasciculata.">Characterization of the respiratory chain from cultured Crithidia fasciculata.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. 85 (2), 171-186 (1997).</li><li>Nelson, R. E., Aphasizheva, I., Falick, A. M., Nebohacova, M., Simpson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+I-complex+in+Leishmania+tarentolae+is+an+uniquely-structured+F1-ATPase.">The I-complex in Leishmania tarentolae is an uniquely-structured F1-ATPase.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. 135 (2), 221-224 (2004).</li><li>Carbajo, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+the+N-terminal+domain+of+the+OSCP+subunit+of+bovine+F1Fo-ATP+synthase+interacts+with+the+N-terminal+region+of+an+alpha+subunit.">How the N-terminal domain of the OSCP subunit of bovine F1Fo-ATP synthase interacts with the N-terminal region of an alpha subunit.</a> Journal of Molecular Biology. 368 (2), 310-318 (2007).</li><li>Bowler, M. W., Montgomery, M. G., Leslie, A. G., Walker, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ground+state+structure+of+F1-ATPase+from+bovine+heart+mitochondria+at+1.9+&#197;+resolution.">Ground state structure of F1-ATPase from bovine heart mitochondria at 1.9 &#197; resolution.</a> The Journal of Biological Chemistry. 282 (19), 14238-14242 (2007).</li></ol>

Het protocol voor F1-ATPase zuivering van T. brucei werd ontwikkeld op basis van eerder gepubliceerde maatregelen voor de isolering van F1-ATPase complexen van andere soorten13,14. De methode vereist geen genetische wijzigingen (bijvoorbeeld, tagging) en levert een volledig actieve complex met alle subeenheden aanwezig. De cruciale stap is de chloroform-vergemakkelijkt release van de F-1-ATPase uit het membraan-i...

De F-type ATP synthases zijn membraan-gebonden roterende multiprotein complexen die paar proton translocatie over energie-transducing membranen van bacteriën, mitochondria en chloroplasten met de vorming van ATP. Moleculaire gegevens van het roterende mechanisme van de ATP-synthese bekend zijn voornamelijk vanwege structurele studies van gezuiverde bacteriële en mitochondriale ATP synthases en hun subcomplexes1. F-type ATP-synthase is onderverdeeld in de membraan-intrinsieke en extrinsieke membraan wordt. Het membraan-extrinsieke deel, bekend als F1-ATPase, bevat drie katalytische sites, waar de fosforylatie van adenosinedifosfaat (ADP) naar ATP of de omgekeerde reactie optreedt. F1-ATPase kan worden vrijgegeven experimenteel van de membraan-intrinsieke groep met behoud van haar vermogen om te hydrolyseren, maar niet synthetiseren, ATP. De sector van de membraan-gebonden, genaamd Fo, bemiddelt eiwit translocatie, die de rotatie van het centrale deel van het enzym drijft. De F-1 en Fo sectoren zijn verbonden door de centrale en perifere stengels.
De eerste pogingen om te zuiveren van de F-1-ATPase van ontluikende gist en boviene hart mitochondriën datum terug naar de jaren 1960. Deze protocollen gebruikt geëxtraheerd mitochondriën, die werden verstoord door ultrasoonapparaat, gespreide door ammonium of tijdje sulfaat neerslag, gevolgd door een optionele chromatografie stappen en warmtebehandeling2,3,4 ,5,6. De zuivering is sterk verbeterd en vereenvoudigd door het gebruik van chloroform, die gemakkelijk de versies van de F-1-ATPase van de mitochondriale membraan fragmenten7. De chloroform winning werd vervolgens gebruikt om te uittreksel van F1- ATPasen van diverse dier, plant en bacteriële bronnen (bijvoorbeeld, rat lever8, maïs9, Gevlekte aronskelk10en Escherichia coli 11). Verdere zuivering van de chloroform-vrijgegeven F1-ATPase door affiniteit of grootte-uitsluiting chromatography (SEC) leverde een zeer zuivere eiwit complex, die geschikt voor hoge resolutie structuurbepaling door middel van röntgendiffractie was, als gedocumenteerd door de structuren van F1-ATPase van boviene hart12,13 en14van de Saccharomyces cerevisiae. F1-ATPase structuren werden ook bepaald op basis van organismen die moeilijk te cultiveren en, dus, het bedrag van het eerste biologisch materiaal was beperkt. In dit geval, de F-1-ATPase subeenheden kunstmatig werden uitgedrukt en samengevoegd tot het complex in E. coli, en het hele heterologe enzym werd gezuiverd door affiniteit chromatografie via een gecodeerde subeenheid. Dergelijke aanpak heeft geleid tot de vaststelling van F1-ATPase structuren uit twee thermofiele bacteriesoorten, Geobacillus stearothermophilus15 en Caldalkalibacillus thermarum16, 17. deze methode is echter nogal ongeschikt voor eukaryotische F1- ATPasen aangezien zij beroept zich op de prokaryote protheosynthetic toestellen, posttranslationele verwerking en complexe assemblage.
De winning van chloroform gebaseerde werd eerder gebruikt om te isoleren F1- ATPasen van digenetic van eencellige parasieten Trypanosoma cruzi18 en T. brucei19, belangrijke zoogdieren ziekteverwekkers, waardoor Amerikaanse en Afrikaanse trypanosomiasen, respectievelijk, en van monogeen insect-parasiet Crithidia fasciculata20. Deze zuivering leidde slechts tot een eenvoudige beschrijving van de F-1- ATPasen, aangezien geen downstream toepassingen werden gebruikt om de samenstelling, structuur en enzymatische eigenschappen van het complex volledig te karakteriseren. Dit artikel beschrijft een geoptimaliseerde methode voor F1-ATPase zuivering van de fase van de levenscyclus van de gekweekte insecten van T. brucei. De methode is ontwikkeld op basis van de vastgestelde protocollen voor isolatie van runderen en gist F1- ATPasen21,22. De procedure levert zeer zuiver en homogene enzym geschikt voor in vitro enzymatische en remmende testen, gedetailleerde proteomic karakterisering door massaspectrometrie23en structuur vastberadenheid24. Het protocol van de reiniging en de kennis van de F-1-ATPase structuur op het atomaire niveau opent een mogelijkheid voor het ontwerpen van de schermen te identificeren kleine-molecuul remmers, steun bij de ontwikkeling van nieuwe medicijnen tegen Afrikaanse trypanosomiasen. Bovendien, het protocol kan worden aangepast aan het zuiveren van F1-ATPase van andere organismen.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosin Diphosphate Disodium Salt (ADP)</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A0948</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amastatin Hydrochloride</td>
			<td>Glantham Life Sciences</td>
			<td>GA1330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aminocaproic Acid</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A2266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>ThermoFischer Scientific/Pierce</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzamidine Hydrochloride</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>199001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bestatin Hydrochloride</td>
			<td>Sigma Aldrich/Merck</td>
			<td>B8385</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete Tablets, Mini EDTA-free</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4693159001</td>
			<td>Protease inhibitor cocktail tablets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic Acid (EDTA)</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td></td>
			<td>For pH adjustment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ile-Pro-Ile</td>
			<td>Sigma Aldrich/Merck</td>
			<td>I9759</td>
			<td>Alias Diprotin A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leupeptin</td>
			<td>Sigma Aldrich/Merck</td>
			<td>L2884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate Heptahydrate</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pepstatin A</td>
			<td>Sigma Aldrich/Merck</td>
			<td>P5318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Electrophoresis System</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Consumables</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Tubes for SW60Ti, Polyallomer</td>
			<td>Beckman Coulture</td>
			<td>328874</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DounceTissues Homogenizer 2 mL</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Vacuum Filtration Device</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>516-7017</td>
			<td>Degasing solutions for liquid chromatography</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiTrap Q HP, 5 mL</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>17115401</td>
			<td>Anion exchange chromatography column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Regenaretad Cellulose Membrane Filters, pore size 0.45 &#956;m, diameter 47 mm</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>18406--47------N</td>
			<td>Degasing solutions for liquid chromatography</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superdex 200 Increase 10/300 GL</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>29091596</td>
			<td>Size-exclusion chromatography column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vivaspin 6 MWCO 100 kDa PES</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>VS0641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AKTA Pure 25</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>29018224</td>
			<td>Or similar FPLC system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer Shimadzu UV-1601</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td></td>
			<td>Or similar spectrophotometer with kinetic assay mode</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge Beckman Optima with SW60Ti Rotor</td>
			<td>Beckman Coulture</td>
			<td></td>
			<td>Or similar ultracentrifuge and rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic Homogenizer with Thin Probe, Model 3000</td>
			<td>BioLogics</td>
			<td>0-127-0001</td>
			<td>Or similar ultrasonic homogenizer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of f1-atpase from the parasitic protist trypanosoma brucei

F1-ATPase is een membraan-extrinsieke katalytische subcomplex van F-type ATP-synthase, een enzym dat de proton motive force over biologische membranen gebruikt voor de productie van adenosine trifosfaat (ATP). Het isolement van de intact F1-ATPase van de inheemse bron is een essentiële voorwaarde voor het karakteriseren van het enzym eiwit samenstelling, kinetische parameters en gevoeligheid voor inhibitoren. Een zeer zuivere en homogene F1-ATPase kan worden gebruikt voor structurele studies, die inzicht geven in de moleculaire mechanismen van de ATP-synthese en hydrolyse. Dit artikel beschrijft een procedure voor de zuivering van de F-1-ATPase van Trypanosoma brucei, de verwekker van Afrikaanse trypanosomiasen. De F-1-ATPase is geïsoleerd van mitochondriale blaasjes, die zijn verkregen door hypotone lysis van trypanosomen in vitro gekweekt. De blaasjes zijn mechanisch gefragmenteerd door ultrasoonapparaat en de F-1-ATPase vrijkomt uit het binnenste van de mitochondriale membraan door de chloroform extractie. De enzymatische complex wordt verder gezuiverd door opeenvolgende anion uitwisseling en grootte-uitsluiting chromatografie. Gevoelige massaspectrometrie technieken bleek dat het gezuiverde complex verstoken van vrijwel elk eiwit contaminanten is en daarom geschikt materiaal voor structuurbepaling door middel van röntgendiffractie of cryo-elektronenmicroscopie vertegenwoordigt. De geïsoleerde F1-ATPase vertoont ATP Hydrolytische activiteit, die volledig kan worden geremd door natriumazide, een krachtige remmer van F-type ATP synthases. Het gezuiverde complex blijft stabiel en actief gedurende ten minste drie dagen bij kamertemperatuur. Neerslag door ammonium sulfaat wordt gebruikt voor langetermijnopslag. Soortgelijke procedures zijn gebruikt voor de zuivering van F1- ATPasen van zoogdier- en plantaardige weefsels, gisten of bacteriën. Dus, het voorgestelde protocol kan dienen als richtsnoer voor de F-1-ATPase los van andere organismen.

Een typische zuivering (Figuur 1) begint met mitochondriale blaasjes (mitoplasts), geïsoleerd op het verloop van de Percoll van hypotonically lysed 1 x 1011 moet 2 x 1011 procyclische T. brucei cellen25 gekweekt in standaard glucose-rijke SDM-79 middellange27. De mitoplasts met het ultrasoonapparaat, gesponnen, zijn gefragmenteerd en wordt het matrix-bevattende supernatant verwijd...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of F1-ATPase from the Parasitic Protist Trypanosoma brucei at JoVE.com

Isolation of F1-ATPase from the Parasitic Protist Trypanosoma brucei

Dit protocol beschrijft de zuivering van F1-ATPase van de gekweekte insecten fase van Trypanosoma brucei. De procedure levert een zeer zuivere, homogene en actieve complex geschikt voor structurele en enzymatische studies.

Isolatie van F1-ATPase van de parasitaire Protist Trypanosoma brucei

F1-ATPase is a membrane-extrinsic catalytic subcomplex of F-type ATP synthase, an enzyme that uses the proton motive force across biological membranes to ...

De zuivering van F1-ATPase is gebaseerd op een klassieke biochemische methode die cruciaal bleek te zijn voor ons begrip van het mechanisme van ATP-productie door andere ATP-synthases. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een zeer zuiver enzym produceert dat geschikt is voor structuurbepaling door röntgenkristallografie of cryo-elektronenmicroscopie. Hoewel dit protocol is geoptimaliseerd voor de isolatie van F1-ATPase van trypanosomen, kan het worden aangepast aan andere bronnen, zoals weefsel- of kweekcellen, en aan verschillende pathogene protisten.Deze techniek kan leiden tot de identificatie van nieuwe geneesmiddelen voor de behandeling van ernstige ziekten bij de mens. Mycobacterium tuberculosis F-ATPase is bijvoorbeeld een geverifieerd medicijn doelwit voor de behandeling van tuberculose. Om te beginnen met het protocol, ontdooien en voorzichtig resuspend mitochondriale aluikels, ook bekend als mitoplasten, eerder geïsoleerd door hypotonische lyse van een keer 10 tot de 11 tot twee keer 10 tot de 11 cellen van procyclische Trypanosoma brucei in vijf milliliter ijs-koude Buffer A.Houd het monster gekoeld.Bepaal vervolgens de eiwitconcentratie in de suspensie door het bicinchoninic zuur, of BCA, eiwittest volgens de instructies van de fabrikant. Voer een BSA verdunningsreeks uit in ultra zuiver water om de standaardcurve te construeren. Verdun een kleine hoeveelheid van het monster 20 tot 100 keer met ultra zuiver water om in het bereik van de BSA-normen te passen.Na het berekenen van de totale eiwithoeveelheid in het monster, breng de eiwitconcentratie tot 16 milligram per milliliter door het te verdunnen met extra Buffer A.Dan fragment de mitoplasten in omgekeerde vesikels en membraanstukken door sonicatie zeven keer gedurende 15 seconden elk, met een totale energie van 70 tot 100 joules per impuls met een microtip met een diameter van 3,9 millimeter. Tijdens het fragmenteren, incubeer het monster op ijs gedurende 30 seconden tussen impulsen. Na de sonicatie kan de vering iets donkerder lijken.Sediment de membraanfragmenten door ultracentrifugatie op 54, 000 g gedurende 16 uur of bij 98,000 g gedurende vijf uur bij vier graden Celsius. Decanteer de supernatant en ga verder met de chloroform extractie. Bereken het volume van Buffer B op basis van de totale hoeveelheid gebruikte buffer A.Breng het bevroren sediment uit de centrifugebuis over in de homogenisator. Resuspend de pellet van mitochondriale membranen in Buffer B met behulp van een kleine Dounce homogenisator. Breng de ophanging over op een conische buis van 50 milliliter.Haal het monster uit het ijs en houd het monster en alle oplossingen op kamertemperatuur voor de resterende stappen. Voeg vervolgens chloroform verzadigd met twee molaire tris aangepast met HCl aan pH 8.5, een op een. Sluit de dop goed en schud het monster precies 20 seconden krachtig.Onmiddellijk centrifugeren het mengsel op 8, 400 g gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Breng vervolgens de bovenste, troebele waterige fase over op 1,6 milliliter microbuisjes. Voeg proteaseremmers toe aan het monster ter vervanging van de remmers die door de chloroforme behandeling worden verwijderd.Verheerlijk de monsters op 13.000 g gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Breng na de spin de supernatant over op verse microbuisjes en herhaal de centrifugatie om het resterende onoplosbare materiaal te verwijderen. Equiliber de vijf milliliter anion uitwisseling Q kolom bevestigd aan een snelle eiwit vloeibare chromatografie systeem met 50 milliliter Q kolom buffer met een stroomsnelheid van vijf milliliter per minuut tot de absorptie op 280 nanometer en de geleidbaarheid te stabiliseren.Laad de supernatant op de geëquilibreerde kolom met een stroomsnelheid van één milliliter per minuut. Wacht tot de absorptie op 280 nanometer stabiliseert op de achtergrond. Breng een lineaire gradiënt van 25 milliliter van de Q-kolom elutiebuffer aan van 0%tot 100%bij een stroomsnelheid van 0,5 milliliter per minuut en verzamel één milliliterfracties.Test 10 microliter van elke afzonderlijke fractie die overeenkomt met de belangrijkste elutiepiek voor ATP-hydrolytische activiteit per milliliter reactiemengsel door de Pullman ATPase-test bij pH 8.0. Pool de fracties die ATPase-activiteit vertonen. Concentreer het gepoolde monster door membraan ultrafiltratie met behulp van een spinkolom met een 100.000 moleculair gewicht cutoff PES filter tot 200 tot 500 microliters.Ga dan verder met de grootte uitsluiting chromatografie. Equilibrate de Superose 6 Verhoging kolom bevestigd aan een vloeibare chromatografie systeem met ten minste 48 milliliter SEC buffer met een stroomsnelheid van 0,5 milliliter per minuut. Pas het monster toe op de kolom.Voer de chromatografie uit met een stroomsnelheid van 0,25 milliliter per minuut, terwijl u 0,25 milliliterfracties verzamelt. Voer vervolgens 10 microliter uit van de breuken die overeenkomen met de pieken van het UV 280 nanometer-absorptiespoor op SDS-PAGE. Bevlek de monsters dan met Coomassie Blue.Test de breuken die overeenkomen met de eerste grote piek met de F1-piek voor de ATP hydrolytische activiteit en azide gevoeligheid door de Pullman ATPase test. Voer vervolgens een BCA-test uit om de eiwitconcentratie te bepalen. Tot slot, houd de gezuiverde F1-ATPase op kamertemperatuur, en gebruik het binnen drie dagen na de zuivering voor downstream-toepassingen.Dit elutieprofiel van een anionuitwisselingschromatografie geeft de UV-absorptie op 280 nanometer en concentratie natriumchloride in de elutiebuffer weer. De geselecteerde breuken werden gescheiden op de SDS-PAGE gel en gekleurd met Coomassie Blue kleurstof. De breuken die overeenkomen met de belangrijkste elutiepiek van anionuitwisseling chromatografie en bevatten de F1-ATPase werden samengevoegd, geconcentreerd, en gebruikt als de input voor grootte-uitsluiting chromatografie.De belangrijkste verontreiniging is dihydrolipoyl dehydrogenase, die elutes van de grootte-uitsluiting chromatografie kolom als een discrete piek. De F1-ATPase elutes in de eerste dominante, grotendeels symmetrische piek. De Coomassie Blue kleuring van een typisch bandpatroon na de scheiding van de gezuiverde F1-ATPase via SDS-PAGE toont sporadische zwakke banden zichtbaar boven de bèta-subunit, die subcomplexen van de alfa drie bèta drie hoofddeksel, dimers en oligomers van de alfa-en bèta-subunits vertegenwoordigen, en zijn verstoken van eventuele verontreinigingen detecteerbaar door massaspectrometrie.Tijdens het uitvoeren van de chloroforme extractie, de kritieke stap van het protocol, is het essentieel om het monster krachtig te schudden en onmiddellijk over te gaan tot de centrifugale scheiding van de organische en waterige fasen. Na deze procedure kan de geïsoleerde F1-ATPase in detail worden gekenmerkt door massaspectrometrie. Verder kan het worden gebruikt in activiteitstesten of voor structurele studies, hetzij op zichzelf, hetzij in aanwezigheid van verschillende remmers of substraatanalogieën.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biochemistry

Isolation of F1-ATPase from the Parasitic Protist Trypanosoma brucei

Unit 1

Membrane Transport and Active Transporters

SCIENTISTS IN ACTION

Isolation of Cognate RNA-protein Complexes from Cells Using Oligonucleotide-directed Elution

Isolatie van Cognate RNA-eiwitcomplexen van cellen met behulp van oligonucleotide-gerichte Elution

Ribonucleoprotein particles direct the biogenesis and post-transcriptional regulation of all mRNAs through distinct combinations of RNA binding proteins. ...

An Efficient Method for the Isolation of Highly Purified RNA from Seeds for Use in Quantitative Transcriptome Analysis

Een efficiënte methode voor het isoleren van zeer gezuiverde RNA uit zaden voor gebruik in Quantitative Analysis Transcriptome

Plant seeds accumulate large amounts of storage reserves comprising biodegradable organic matter. Humans rely on seed storage reserves for food and as ...

Tandem Affinity Purification of Protein Complexes from Eukaryotic Cells

Tandem affiniteitszuivering van eiwitcomplexen van eukaryote cellen

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo ...

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolatie en respiratoire metingen van Mitochondria van Arabidopsis thaliana

Mitochondria are essential organelles involved in numerous metabolic pathways in plants, most notably the production of adenosine triphosphate (ATP) from ...

Protein Digestion, Ultrafiltration, and Size Exclusion Chromatography to Optimize the Isolation of Exosomes from Human Blood Plasma and Serum

Vertering van eiwitten, ultrafiltratie en Size Exclusion Chromatography voor het optimaliseren van het isolement van Exosomes uit menselijk bloed Plasma en Serum

Exosomes, a type of nanovesicle released from all cell types, can be isolated from any bodily fluid. The contents of exosomes, including proteins and ...

Rapid Isolation of the Mitoribosome from HEK Cells

Snelle isolatie van de Mitoribosome van HEK cellen

The human mitochondria possess a dedicated set of ribosomes (mitoribosomes) that translate 13 essential protein components of the oxidative ...

Isolation of Tissue Extracellular Vesicles from the Liver

Isolatie van weefsel extracellulaire vesicles uit de lever

Extracellular vesicles (EVs) can be released from many different cell types and detected in most, if not all, body fluids. EVs can participate in ...

Isolation of Lipoprotein Particles from Chicken Egg Yolk for the Study of Bacterial Pathogen Fatty Acid Incorporation into Membrane Phospholipids

Isolatie van lipoproteïne deeltjes uit kippenei dooier voor de studie van bacteriële pathogeen vetzuur opname in membraan fosfolipiden

Staphylococcus aureus and other Gram-positive pathogens incorporate fatty acids from the environment into membrane phospholipids. During infection, the ...

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

Translating Ribosome Affinity Purification TRAP for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

Het vertalen van ribosome Affiniteits zuivering (TRAP) voor RNA-isolatie van endotheel cellen in vivo

Many studies have been limited to using in vitro cellular assays and whole tissues or isolating of specific cell types from animals for in vitro analysis ...

Ready-To-Use qPCR for Detection of DNA from Trypanosoma cruzi or Other Pathogenic Organisms

Ready-To-Use qPCR for Detection of DNA from Trypanosoma cruzi or Other Pathogenic Organisms

Kant-en-klare qPCR voor detectie van DNA van Trypanosoma cruzi of andere pathogene organismen

Real-time PCR (qPCR) is a remarkably sensitive and precise technique&#160;that allows for amplifying&#160;minute amounts of nucleic acid targets from a ...