Name: isolation of f1-atpase from the parasitic protist trypanosoma brucei
Uploaded: 2019-01-22T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of F1-ATPase from the Parasitic Protist Trypanosoma brucei at JoVE.com

Ce travail a été financé par le ministère de l’éducation ERC CZ accorder LL1205, l’octroi de subvention Agence de la République tchèque 18-17529S et par FEDER/FSE du projet Centre de recherche de la pathogénicité et la virulence des parasites (No. CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_019/0000759).

1. tampons et Solutions
<ol><li>Préparer les solutions énumérées ci-dessous. Une solution contenant toutes les mémoires tampons pour chromatographie en phase liquide. Ajouter juste avant l’utilisation des inhibiteurs de ADP, benzamidine et protéase.<ol>
<li>Préparer un tampon tampon A: 50 mM Tris avec l’acide chlorhydrique (Tris-HCl) pH 8,0, 0,25 M de sucrose, benzamidine 5 mM, 5 mM, inhibiteurs d’acide (ACA) et protéase aminocaproïque (10 µM amastatine 50 µM bestatine, 50 µM pepstatine, 50 µM leupep...

<ol>
	<li>Walker, J. E., Wikstr&#246;m, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure,+mechanism+and+regulation+of+ATP+synthases.">Structure, mechanism and regulation of ATP synthases.</a> Mechanisms of Primary Energy Transduction in Biology. , 338-373 (2017).</li><li>Pullman, M. E., Penefsky, H. S., Datta, A., Racker, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partial+resolution+of+the+enzymes+catalyzing+oxidative+phosphorylation.+I.+Purification+and+properties+of+soluble+dinitrophenol-stimulated+adenosine+triphosphatase.">Partial resolution of the enzymes catalyzing oxidative phosphorylation. I. Purification and properties of soluble dinitrophenol-stimulated adenosine triphosphatase.</a> The Journal of Biological Chemistry. 235, 3322-3329 (1960).</li><li>Schatz, G., Penefsky, H. S., Racker, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partial+resolution+of+the+enzymes+catalyzing+oxidative+phosphorylation.">Partial resolution of the enzymes catalyzing oxidative phosphorylation.</a> XIV. The Journal of Biological Chemistry. 242 (10), 2552-2560 (1967).</li><li>Racker, E., Horstman, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partial+resolution+of+the+enzymes+catalyzing+oxidative+phosphorylation.+13.+Structure+and+function+of+submitochondrial+particles+completely+resolved+with+respect+to+coupling+factor.">Partial resolution of the enzymes catalyzing oxidative phosphorylation. 13. Structure and function of submitochondrial particles completely resolved with respect to coupling factor.</a> The Journal of Biological Chemistry. 242 (10), 2547-2551 (1967).</li><li>Senior, A. E., Brooks, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+the+mitochondrial+oligomycin-insensitive+ATPase.+I.+An+improved+method+of+purification+and+the+behavior+of+the+enzyme+in+solutions+of+various+depolymerizing+agents.">Studies on the mitochondrial oligomycin-insensitive ATPase. I. An improved method of purification and the behavior of the enzyme in solutions of various depolymerizing agents.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 140 (1), 257-266 (1970).</li><li>Tzagoloff, A., Meagher, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+the+mitochondrial+membrane+system.+V.+Properties+of+a+dispersed+preparation+of+the+rutamycin-sensitive+adenosine+triphosphatase+of+yeast+mitochondria.">Assembly of the mitochondrial membrane system. V. Properties of a dispersed preparation of the rutamycin-sensitive adenosine triphosphatase of yeast mitochondria.</a> The Journal of Biological Chemistry. 246 (23), 7328-7336 (1971).</li><li>Beechey, R. B., Hubbard, S. A., Linnett, P. E., Mitchell, A. D., Munn, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+rapid+method+for+the+preparation+of+adenosine+triphosphatase+from+submitochondrial+particles.">A simple and rapid method for the preparation of adenosine triphosphatase from submitochondrial particles.</a> Biochemical Journal. 148 (3), 533-537 (1975).</li><li>Tyler, D. D., Webb, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+properties+of+the+adenosine+triphosphatase+released+from+the+liver+mitochondrial+membrane+by+chloroform.">Purification and properties of the adenosine triphosphatase released from the liver mitochondrial membrane by chloroform.</a> Biochemical Journal. 178 (2), 289-297 (1979).</li><li>Hack, E., Leaver, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+alpha-subunit+of+the+maize+F1-ATPase+is+synthesised+in+the+mitochondrion.">The alpha-subunit of the maize F1-ATPase is synthesised in the mitochondrion.</a> The EMBO Journal. 2 (10), 1783-1789 (1983).</li><li>Dunn, P. P., Slabas, A. R., Moore, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+F1-ATPase+from+cuckoo-pint+(Arum+maculatum)+mitochondria.+A+comparison+of+subunit+composition+with+that+of+rat+liver+F1-ATPase.">Purification of F1-ATPase from cuckoo-pint (Arum maculatum) mitochondria. A comparison of subunit composition with that of rat liver F1-ATPase.</a> Biochemical Journal. 225 (3), 821-824 (1985).</li><li>Satre, M., Bof, M., Vignais, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+Escherichia+coli+adenosine+triphosphatase+with+aurovertin+and+citreoviridin:+inhibition+and+fluorescence+studies.">Interaction of Escherichia coli adenosine triphosphatase with aurovertin and citreoviridin: inhibition and fluorescence studies.</a> Journal of Bacteriology. 142 (3), 768-776 (1980).</li><li>Abrahams, J. P., Leslie, A. G., Lutter, R., Walker, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+at+2.8+&#197;+resolution+of+F1ATPase+from+bovine+heart+mitochondria.">Structure at 2.8 &#197; resolution of F1ATPase from bovine heart mitochondria.</a> Nature. 370 (6491), 621-628 (1994).</li><li>Lutter, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallization+of+F1-ATPase+from+bovine+heart+mitochondria.">Crystallization of F1-ATPase from bovine heart mitochondria.</a> Journal of Molecular Biology. 229 (3), 787-790 (1993).</li><li>Kabaleeswaran, V., Puri, N., Walker, J. E., Leslie, A. G., Mueller, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+features+of+the+rotary+catalytic+mechanism+revealed+in+the+structure+of+yeast+F1-ATPase.">Novel features of the rotary catalytic mechanism revealed in the structure of yeast F1-ATPase.</a> The EMBO Journal. 25 (22), 5433-5442 (2006).</li><li>Shirakihara, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+a+thermophilic+F1-ATPase+inhibited+by+an+epsilon-subunit:+deeper+insight+into+the+epsilon-inhibition+mechanism.">Structure of a thermophilic F1-ATPase inhibited by an epsilon-subunit: deeper insight into the epsilon-inhibition mechanism.</a> The FEBS Journal. 282 (15), 2895-2913 (2015).</li><li>Stocker, A., Keis, S., Cook, G. M., Dimroth, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification,+crystallization,+and+properties+of+F1-ATPase+complexes+from+the+thermoalkaliphilic+Bacillus+sp.+strain+TA2.A1.">Purification, crystallization, and properties of F1-ATPase complexes from the thermoalkaliphilic Bacillus sp. strain TA2.A1.</a> Journal of Structural Biology. 152 (2), 140-145 (2005).</li><li>Ferguson, S. A., Cook, G. M., Montgomery, M. G., Leslie, A. G., Walker, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+thermoalkaliphilic+F1-ATPase+from+Caldalkalibacillus+thermarum.">Regulation of the thermoalkaliphilic F1-ATPase from Caldalkalibacillus thermarum.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (39), 10860-10865 (2016).</li><li>Cataldi de Flombaum, M. A., Frasch, A. C. C., Stoppani, A. O. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenosine+triphosphatase+from+Trypanosoma+cruzi:+purification+and+properties.">Adenosine triphosphatase from Trypanosoma cruzi: purification and properties.</a> Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Comparative Biochemistry. 65 (1), 103-109 (1980).</li><li>Williams, N., Frank, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrial+ATP+synthase+of+Trypanosoma+brucei:+isolation+and+characterization+of+the+intact+F1+moiety.">The mitochondrial ATP synthase of Trypanosoma brucei: isolation and characterization of the intact F1 moiety.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. 43 (1), 125-132 (1990).</li><li>Higa, A. I., Cazzulo, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mg2+-activated+adenosine+triphosphatase+from+Crithidia+fasciculata:+purification+and+inhibition+by+suramin+and+efrapeptin.">Mg2+-activated adenosine triphosphatase from Crithidia fasciculata: purification and inhibition by suramin and efrapeptin.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. 3 (6), 357-367 (1981).</li><li>Walker, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+structure+and+subunit+stoichiometry+of+F1-ATPase+from+bovine+mitochondria.">Primary structure and subunit stoichiometry of F1-ATPase from bovine mitochondria.</a> Journal of Molecular Biology. 184 (4), 677-701 (1985).</li><li>Mueller, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ni-chelate-affinity+purification+and+crystallization+of+the+yeast+mitochondrial+F1-ATPase.">Ni-chelate-affinity purification and crystallization of the yeast mitochondrial F1-ATPase.</a> Protein Expression and Purification. 37 (2), 479-485 (2004).</li><li>Gahura, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+F1-ATPase+from+Trypanosoma+brucei+is+elaborated+by+three+copies+of+an+additional+p18-subunit.">The F1-ATPase from Trypanosoma brucei is elaborated by three copies of an additional p18-subunit.</a> The FEBS Journal. 285 (3), 614-628 (2018).</li><li>Montgomery, M. G., Gahura, O., Leslie, A. G. W., Zikova, A., Walker, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATP+synthase+from+Trypanosoma+brucei+has+an+elaborated+canonical+F1-domain+and+conventional+catalytic+sites.">ATP synthase from Trypanosoma brucei has an elaborated canonical F1-domain and conventional catalytic sites.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (9), 2102-2107 (2018).</li><li>Schneider, A., Charriere, F., Pusnik, M., Horn, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+mitochondria+from+procyclic+Trypanosoma+brucei.">Isolation of mitochondria from procyclic Trypanosoma brucei.</a> Methods in Molecular Biology. 372, 67-80 (2007).</li><li>Smith, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+protein+using+bicinchoninic+acid.">Measurement of protein using bicinchoninic acid.</a> Analytical Biochemistry. 150 (1), 76-85 (1985).</li><li>Wirtz, E., Leal, S., Ochatt, C., Cross, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tightly+regulated+inducible+expression+system+for+conditional+gene+knock-outs+and+dominant-negative+genetics+in+Trypanosoma+brucei.">A tightly regulated inducible expression system for conditional gene knock-outs and dominant-negative genetics in Trypanosoma brucei.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. 99 (1), 89-101 (1999).</li><li>Speijer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+respiratory+chain+from+cultured+Crithidia+fasciculata.">Characterization of the respiratory chain from cultured Crithidia fasciculata.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. 85 (2), 171-186 (1997).</li><li>Nelson, R. E., Aphasizheva, I., Falick, A. M., Nebohacova, M., Simpson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+I-complex+in+Leishmania+tarentolae+is+an+uniquely-structured+F1-ATPase.">The I-complex in Leishmania tarentolae is an uniquely-structured F1-ATPase.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. 135 (2), 221-224 (2004).</li><li>Carbajo, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+the+N-terminal+domain+of+the+OSCP+subunit+of+bovine+F1Fo-ATP+synthase+interacts+with+the+N-terminal+region+of+an+alpha+subunit.">How the N-terminal domain of the OSCP subunit of bovine F1Fo-ATP synthase interacts with the N-terminal region of an alpha subunit.</a> Journal of Molecular Biology. 368 (2), 310-318 (2007).</li><li>Bowler, M. W., Montgomery, M. G., Leslie, A. G., Walker, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ground+state+structure+of+F1-ATPase+from+bovine+heart+mitochondria+at+1.9+&#197;+resolution.">Ground state structure of F1-ATPase from bovine heart mitochondria at 1.9 &#197; resolution.</a> The Journal of Biological Chemistry. 282 (19), 14238-14242 (2007).</li></ol>

Le protocole pour F1-purification de l’ATPase de T. brucei a été développé sur la base des méthodes publiées antérieurement pour l’isolement des F1-complexes de l’ATPase d’autres espèces13,14. La méthode ne requiert pas une modification génétique (p. ex., marquage) et conduit un complexe actif complet avec toutes les sous-unités présents. L’étape cruciale est la libération de chloroforme-facilité d...

Les type F ATP synthases sont membranaires tournantes complexes multiprotéiques que la translocation de protons couple à travers les membranes transduction de l’énergie des bactéries, des mitochondries et chloroplastes avec la formation d’ATP. Les détails moléculaires du mécanisme de rotation de la synthèse d’ATP sont connus principalement en raison des études structurales de purifiée bactérienne et mitochondrial ATP synthases et leurs subcomplexes1. F-type ATP synthase est organisé dans les fractions membranaires intrinsèques et extrinsèques à la membrane. La partie membranaire-extrinsèque, appelée F1-ATPase, contient trois sites catalytiques, où la phosphorylation de l’adénosine diphosphate (ADP) à ATP ou la réaction inverse se produit. F1-ATPase peut être libéré expérimentalement la portion membranaires intrinsèques tout en conservant sa capacité à hydrolyser, mais pas synthétiser, ATP. Le secteur de membrane-bondissent, dénommé Fo, intervient dans la translocation de la protéine, qui entraîne la rotation de la partie centrale de l’enzyme. Les secteurs deo F et de F1 sont reliés par des tiges centrales et périphériques.
La première tente de purifier le F1-ATPase de la levure de bière et de la date de mitochondries de coeur de boeuf vers les années 1960. Ces protocoles utilisés extraites des mitochondries, qui ont été perturbées par la sonication, fractionnée par précipitation au sulfate d’ammonium ou de protamine, suivie par chromatographie facultatif étapes et traitement thermique2,3,4 ,5,6. La purification a été grandement améliorée et simplifiée par l’utilisation du chloroforme, qui libère facilement le F1-ATPase de la membrane mitochondriale des fragments7. L’extraction de chloroforme a ensuite été utilisée pour extraire des F1- ATPases de divers animaux, végétaux et des sources bactériennes (p. ex., foie de rat8, maïs9, Arum maculatum10et Escherichia coli 11). Outre la purification du chloroforme-sortie F1-ATPase par chromatographie d’affinité ou exclusion stérique (SEC) a produit une protéine pure hautement complexe, qui convenait pour la détermination de la structure à haute résolution par cristallographie aux rayons x, comme documenté par les structures de F1-ATPase de coeur bovine12,13 et14de la Saccharomyces cerevisiae. F1-ATPase structures ont été également déterminées d’organismes qui sont difficiles à cultiver et, par conséquent, la quantité de la matière biologique initiale était limitée. Dans ce cas, le F1-ATPase sous-unités ont été artificiellement exprimées et assemblées dans le complexe chez e. coli, et l’ensemble hétérologue enzyme a été purifiée par affinité Chromatographie via une sous-unité étiquetée. Cette approche a conduit à la détermination de F1-structures de l’ATPase de deux espèces de bactéries thermophiles, Geobacillus stearothermophilus15 et thermarum Caldalkalibacillus16, 17. Toutefois, cette méthode est plutôt impropre à eucaryotes F1- ATPases puisqu’elle s’appuie sur l’appareil protheosynthetic procaryote, transformation post-traductionnelle et assemblage complexe.
L’extraction axée sur le chloroforme a été précédemment utilisée pour isoler F1- ATPases de digène unicellulaires parasites Trypanosoma cruzi18 et T. brucei19, importants pathogènes chez les mammifères d’Amérique et Les trypanosomiases africaines, respectivement et de monogénique insecte parasite Crithidia fasciculata20. Ces purifications conduit seulement à une simple description de la F1- ATPases, puisqu’aucune demande en aval ont été utilisées pour caractériser complètement la composition, structure et propriétés enzymatiques du complexe. Cet article décrit une méthode optimisée pour F1-purification de l’ATPase de l’étape de cycle de vie insectes cultivées de T. brucei. La méthode est élaborée selon les protocoles établis pour l’isolement de bovins et la levure F1- ATPases21,22. La procédure donne très pure et homogène enzyme appropriée pour in vitro enzymatiques et inhibiteur des dosages, protéomiques détaillées caractérisation par spectrométrie de masse23et de détermination de structure24. Le protocole de purification et de la connaissance de la F1-structure de l’ATPase au niveau atomique ouvre une possibilité pour la conception d’écrans pour identifier les inhibiteurs de petites molécules et aider au développement de nouveaux médicaments contre les trypanosomiases africaines. En outre, le protocole peut être adapté pour purifier F1-ATPase provenant d’autres organismes.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosin Diphosphate Disodium Salt (ADP)</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A0948</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amastatin Hydrochloride</td>
			<td>Glantham Life Sciences</td>
			<td>GA1330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aminocaproic Acid</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A2266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>ThermoFischer Scientific/Pierce</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzamidine Hydrochloride</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>199001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bestatin Hydrochloride</td>
			<td>Sigma Aldrich/Merck</td>
			<td>B8385</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete Tablets, Mini EDTA-free</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4693159001</td>
			<td>Protease inhibitor cocktail tablets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic Acid (EDTA)</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td></td>
			<td>For pH adjustment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ile-Pro-Ile</td>
			<td>Sigma Aldrich/Merck</td>
			<td>I9759</td>
			<td>Alias Diprotin A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leupeptin</td>
			<td>Sigma Aldrich/Merck</td>
			<td>L2884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate Heptahydrate</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pepstatin A</td>
			<td>Sigma Aldrich/Merck</td>
			<td>P5318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Electrophoresis System</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Consumables</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Tubes for SW60Ti, Polyallomer</td>
			<td>Beckman Coulture</td>
			<td>328874</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DounceTissues Homogenizer 2 mL</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Vacuum Filtration Device</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>516-7017</td>
			<td>Degasing solutions for liquid chromatography</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiTrap Q HP, 5 mL</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>17115401</td>
			<td>Anion exchange chromatography column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Regenaretad Cellulose Membrane Filters, pore size 0.45 &#956;m, diameter 47 mm</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>18406--47------N</td>
			<td>Degasing solutions for liquid chromatography</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superdex 200 Increase 10/300 GL</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>29091596</td>
			<td>Size-exclusion chromatography column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vivaspin 6 MWCO 100 kDa PES</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>VS0641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AKTA Pure 25</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>29018224</td>
			<td>Or similar FPLC system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer Shimadzu UV-1601</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td></td>
			<td>Or similar spectrophotometer with kinetic assay mode</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge Beckman Optima with SW60Ti Rotor</td>
			<td>Beckman Coulture</td>
			<td></td>
			<td>Or similar ultracentrifuge and rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic Homogenizer with Thin Probe, Model 3000</td>
			<td>BioLogics</td>
			<td>0-127-0001</td>
			<td>Or similar ultrasonic homogenizer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of f1-atpase from the parasitic protist trypanosoma brucei

F1-ATPase est un complexe catalytique membrane extrinsèques de type F ATP synthase, une enzyme qui utilise la force motrice de proton à travers les membranes biologiques pour produire de l’adénosine triphosphate (ATP). L’isolement de l’intact F1-ATPase de sa source native est une condition essentielle pour caractériser la composition en protéines, les paramètres cinétiques et sensibilité aux inhibiteurs de l’enzyme. Un très pure et homogène F1-ATPase peut être utilisé pour les études structurales, qui permettent de mieux comprendre les mécanismes moléculaires de la synthèse d’ATP et d’hydrolyse. Cet article décrit une procédure pour la purification de la F1-ATPase de Trypanosoma brucei, l’agent causal des trypanosomiases africaines. La F1-ATPase est isolée des vésicules mitochondriales, qui sont obtenus par lyse hypotonique de in vitro cultivée trypanosomes. Les vésicules sont mécaniquement fragmentées par sonication et le F1-ATPase est libéré de la membrane mitochondriale interne par l’extraction au chloroforme. Le complexe enzymatique est ensuite purifié par échange d’anions consécutives et chromatographie d’exclusion stérique. Techniques de spectrométrie de masse sensible montrent que le complexe purifié est dépourvue de pratiquement tout contaminant de protéine et représente donc un matériau approprié pour la détermination de la structure par diffraction des rayons x ou cryo-microscopie électronique. L’isolé F1-ATPase présente une activité hydrolytique ATP, qui peut être inhibée totalement de l’azide de sodium, un puissant inhibiteur de type F ATP synthases. Le complexe purifié reste stable et actif pendant au moins trois jours à température ambiante. Précipitation de sulfate d’ammonium est utilisée pour le stockage à long terme. Des procédures similaires ont été utilisées pour la purification de F1- ATPases de tissus de mammifères et de plantes, de levures ou de bactéries. Ainsi, le protocole présenté peut servir de modèle pour la F1-isolement ATPase provenant d’autres organismes.

Une purification typique (Figure 1) commence par des vésicules mitochondriales (mitoplasts) isolés sur le gradient de Percoll du mi-prophase lysé 1 x 1011 à 2 x 1011 procycliques de cellules de T. brucei 25 cultivés dans la norme riche en glucose moyen SDM-7927. Les mitoplasts sont fragmentées par sonication, filée, et le surnageant contenant de matrice est ignoré. Les memb...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of F1-ATPase from the Parasitic Protist Trypanosoma brucei at JoVE.com

Isolation of F1-ATPase from the Parasitic Protist Trypanosoma brucei

Ce protocole décrit la purification de la F1-ATPase de la scène des insecte de Trypanosoma brucei. La procédure donne un complexe très pur, homogène et actif adapté aux études structurales et enzymatiques.

Isolation de F1-ATPase de la protiste parasite Trypanosoma brucei

F1-ATPase is a membrane-extrinsic catalytic subcomplex of F-type ATP synthase, an enzyme that uses the proton motive force across biological membranes to ...

La purification de la F1-ATPase est basée sur une méthode biochimique classique qui s’est avérée cruciale pour notre compréhension du mécanisme de production d’ATP par d’autres synthases ATP. Le principal avantage de cette technique est qu’elle produit une enzyme très pure adaptée à la détermination de la structure par cristallographie aux rayons X ou microscopie cryo-électronique. Bien que ce protocole soit optimisé pour l’isolement de F1-ATPase des trypanosomes, il peut être adapté à d’autres sources, telles que les tissus ou les cellules de culture, et à divers protistes pathogènes.Cette technique peut conduire à l’identification de nouveaux médicaments pour traiter les maladies humaines graves. Par exemple, Mycobacterium tuberculosis F-ATPase est une cible de médicaments authentifiée pour le traitement de la tuberculose. Pour commencer le protocole, décongeler et résuspendre doucement les vésicules mitochondriales, également connues sous le nom de mitoplastes, précédemment isolées par lyse hypotonique d’une fois 10 à 11 à deux fois 10 à 11 cellules de trypanosoma brucei procyclique dans cinq millilitres de tampon glacé A.Gardez l’échantillon refroidi.Ensuite, déterminez la concentration de protéines dans la suspension par l’acide bicinchoninique, ou BCA, analyse des protéines selon les instructions du fabricant. Effectuez une série de dilution BSA dans de l’eau ultra pure pour construire la courbe standard. Diluer une petite quantité de l’échantillon 20 à 100 fois avec de l’eau ultra pure pour s’adapter à la gamme des normes BSA.Après avoir calculé la quantité totale de protéines dans l’échantillon, porter la concentration protéique à 16 milligrammes par millilitre en la diluant avec un tampon supplémentaire A.Puis fragmenter les mitoplastes en vésicules inversées et des morceaux de membrane par sonication sept fois pendant 15 secondes chacun, avec une énergie totale de 70 à 100 joules par impulsion avec un microtipe avec un diamètre de 3,9 millimètres. Pendant la fragmentation, incuber l’échantillon sur la glace pendant 30 secondes entre les impulsions. Après la sonication, la suspension peut sembler légèrement plus foncée.Sédimenter les fragments de membrane par ultracentrifugation à 54 000 g pendant 16 heures ou à 98 000 g pendant cinq heures à quatre degrés Celsius. Décanter le supernatant et procéder à l’extraction du chloroforme. Calculez le volume du tampon B en fonction de la quantité totale de tampon A utilisée.Transférer les sédiments gelés du tube de centrifugeuse dans l’homogénéiseur. Resuspendez la pastille des membranes mitochondriques dans le tampon B à l’aide d’un petit homogénéiseur Dounce. Transférer la suspension dans un tube conique de 50 millilitres.Retirez l’échantillon de la glace et conservez l’échantillon et toutes les solutions à température ambiante pour les étapes restantes. Ajouter ensuite le chloroforme saturé de deux tris molaire ajustés avec hcl au pH 8,5, un à un. Fermez le bouchon hermétiquement et secouez vigoureusement l’échantillon pendant exactement 20 secondes.Centrifuger immédiatement le mélange à 8 400 g pendant cinq minutes à température ambiante. Ensuite, transférez la phase aqueuse supérieure et nuageuse à des microtubes de 1,6 millilitre. Ajouter des inhibiteurs de la protéase à l’échantillon pour remplacer les inhibiteurs éliminés par le traitement au chloroforme.Centrifuger les échantillons à 13 000 g pendant 30 minutes à température ambiante. Après la rotation, transférer le supernatant sur des microtubes frais et répéter la centrifugation pour enlever tout matériau insoluble restant. Equilibrer la colonne Q d’échange d’anion de cinq millilitres attachée à un système de chromatographie liquide protéique rapide avec 50 millilitres de tampon de colonne Q à un débit de cinq millilitres par minute jusqu’à ce que l’absorption à 280 nanomètres et la conductivité se stabilisent.Chargez le supernatant sur la colonne équilibrée à un débit d’un millilitre par minute. Attendez que l’absorption à 280 nanomètres se stabilise à l’arrière-plan. Appliquez un gradient linéaire de 25 millilitres du tampon d’élitution de la colonne Q de 0 % à 100 % à un débit de 0,5 millilitres par minute et recueillez une fraction millilitre.Analyse de 10 microlitres de chaque fraction individuelle correspondant au pic d’élitution majeur pour l’activité hydrolytique ATP par millilitre de mélange de réaction par l’essai Pullman ATPase au pH 8.0. Mettre en commun les fractions qui présentent l’activité ATPase. Concentrez l’échantillon mis en commun par ultrafiltration membranaire à l’aide d’une colonne de spin avec un filtre PES de coupure de poids moléculaire de 100 000 à 200 à 500 microlitres.Ensuite, passez à la chromatographie d’exclusion de taille. Equilibrer la colonne Superose 6 Increase attachée à un système de chromatographie liquide avec au moins 48 millilitres de tampon SEC à un débit de 0,5 millilitres par minute. Appliquez l’échantillon sur la colonne.Exécutez la chromatographie à un débit de 0,25 millilitres par minute, tout en collectant des fractions de 0,25 millilitre. Ensuite, exécutez 10 microlitres des fractions qui correspondent aux pics de la trace d’absorption uv 280 nanomètres sur SDS-PAGE. Puis tacher les échantillons avec Coomassie Blue.Analysez les fractions correspondant au premier pic majeur contenant le pic de F1 pour l’activité hydrolytique ATP et la sensibilité à l’azide par l’essai Pullman ATPase. Effectuez ensuite un test BCA pour déterminer la concentration en protéines. Enfin, gardez le F1-ATPase purifié à température ambiante et utilisez-le dans les trois jours suivant la purification pour les applications en aval.Ce profil d’élitution d’une chromatographie d’échange d’anion affiche l’absorption UV à 280 nanomètres et la concentration de chlorure de sodium dans le tampon d’élitution. Les fractions sélectionnées ont été séparées sur le gel SDS-PAGE et tachées de colorant Coomassie Blue. Les fractions qui correspondent au pic majeur d’élitution de la chromatographie d’échange d’anion et contiennent le F1-ATPase ont été mis en commun, concentrés et utilisés comme entrée pour la chromatographie d’exclusion de taille.Le principal contaminant est la déshydrogénase dihydrolipoyle, qui s’échappe de la colonne chromatographie d’exclusion de taille comme un pic discret. La F1-ATPase s’élit dans le premier sommet dominant, largement symétrique. La coloration Bleue Coomassie d’un motif de bande typique après la séparation de la F1-ATPase purifiée via SDS-PAGE montre des bandes faibles sporadiques visibles au-dessus du sous-unité bêta, qui représentent des sous-complexes de l’alpha trois bêta trois casques, dimers et oligomers des sous-unités alpha et bêta, et sont dépourvus de tout contaminant détectable par spectrométrie de masse.Tout en effectuant l’extraction du chloroforme, l’étape critique du protocole, il est essentiel de secouer vigoureusement l’échantillon et de procéder immédiatement à la séparation centrifuge des phases organique et aqueuse. Suite à cette procédure, le F1-ATPase isolé peut être caractérisé en détail par spectrométrie de masse. En outre, il peut être utilisé dans les analyses d’activité ou pour les études structurelles, soit sur son propre ou en présence de divers inhibiteurs ou analogues substrat.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biochemistry

Isolation of F1-ATPase from the Parasitic Protist Trypanosoma brucei

Unit 1

Membrane Transport and Active Transporters

SCIENTISTS IN ACTION

Isolation of Cognate RNA-protein Complexes from Cells Using Oligonucleotide-directed Elution

L&#39;isolement des Cognate complexes ARN-protéine à partir des cellules en utilisant une élution Oligonucleotide-directed

Ribonucleoprotein particles direct the biogenesis and post-transcriptional regulation of all mRNAs through distinct combinations of RNA binding proteins. ...

Recherche

Biochimie

An Efficient Method for the Isolation of Highly Purified RNA from Seeds for Use in Quantitative Transcriptome Analysis

Une méthode efficace pour l&#39;isolement de l&#39;ARN hautement purifiées de semences pour une utilisation dans quantitative transcriptome Analyse

Plant seeds accumulate large amounts of storage reserves comprising biodegradable organic matter. Humans rely on seed storage reserves for food and as ...

Tandem Affinity Purification of Protein Complexes from Eukaryotic Cells

La purification d&#39;affinité en tandem de complexes protéiques à partir des cellules eucaryotes

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo ...

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolement et mesures respiratoire des mitochondries d’Arabidopsis thaliana

Mitochondria are essential organelles involved in numerous metabolic pathways in plants, most notably the production of adenosine triphosphate (ATP) from ...

Protein Digestion, Ultrafiltration, and Size Exclusion Chromatography to Optimize the Isolation of Exosomes from Human Blood Plasma and Serum

Digestion des protéines, Ultrafiltration et chromatographie d’Exclusion afin d’optimiser l’isolement des Exosomes de sérum et de Plasma sanguin humain

Exosomes, a type of nanovesicle released from all cell types, can be isolated from any bodily fluid. The contents of exosomes, including proteins and ...

Rapid Isolation of the Mitoribosome from HEK Cells

Isolation rapide de la Mitoribosome de cellules HEK

The human mitochondria possess a dedicated set of ribosomes (mitoribosomes) that translate 13 essential protein components of the oxidative ...

Isolation of Tissue Extracellular Vesicles from the Liver

Isolement des vésicules extracellulaires de tissu du foie

Extracellular vesicles (EVs) can be released from many different cell types and detected in most, if not all, body fluids. EVs can participate in ...

Isolation of Lipoprotein Particles from Chicken Egg Yolk for the Study of Bacterial Pathogen Fatty Acid Incorporation into Membrane Phospholipids

Isolement des particules de lipoprotéine du jaune d'oeuf de poulet pour l'étude de l'incorporation d'acide gras de pathogène bactérien dans les phospholipides de membrane

Staphylococcus aureus and other Gram-positive pathogens incorporate fatty acids from the environment into membrane phospholipids. During infection, the ...

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

Translating Ribosome Affinity Purification TRAP for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

Traduire Ribosome Affinity Purification (TRAP) pour l'isolement de l'ARN des cellules endothéliales in vivo

Many studies have been limited to using in vitro cellular assays and whole tissues or isolating of specific cell types from animals for in vitro analysis ...

Ready-To-Use qPCR for Detection of DNA from Trypanosoma cruzi or Other Pathogenic Organisms

Ready-To-Use qPCR for Detection of DNA from Trypanosoma cruzi or Other Pathogenic Organisms

qPCR prête à l’emploi pour la détection de l’ADN de Trypanosoma cruzi ou d’autres organismes pathogènes

Real-time PCR (qPCR) is a remarkably sensitive and precise technique&#160;that allows for amplifying&#160;minute amounts of nucleic acid targets from a ...