Name: isolation of f1-atpase from the parasitic protist trypanosoma brucei
Uploaded: 2019-01-22T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of F1-ATPase from the Parasitic Protist Trypanosoma brucei at JoVE.com

Diese Arbeit wurde gefördert durch das Ministerium für Bildung ERC CZ gewähren LL1205, Grant Agency Tschechien Grant 18-17529S, und vom EFRE/ESF Projekt Zentrum für die Erforschung der Pathogenität und Virulenz des Parasiten (No. CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_019/0000759).

1. Puffer und Lösungen
<ol><li>Bereiten Sie die unten aufgeführten Lösungsvorschläge. Entgasen Sie alle Puffer für Flüssigkeitschromatographie. Fügen Sie ADP, Benzamidine und Protease-Inhibitoren, kurz vor dem Einsatz.<ol>
<li>Bereiten Sie Puffer A: 50 mM Tris-Puffer mit Salzsäure (Tris-HCl) pH 8.0, 0,25 M Saccharose, 5 mM Benzamidine, 5 mM Aminocaproic Säure (ACA) und Protease-Inhibitoren (10 µM Amastatin, 50 µM Bestatin 50 µM Pepstatin, 50 µM Leupeptin und 50 µM Diprotin A).</li>
		<li>Bereiten Sie Puff...

<ol>
	<li>Walker, J. E., Wikstr&#246;m, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure,+mechanism+and+regulation+of+ATP+synthases.">Structure, mechanism and regulation of ATP synthases.</a> Mechanisms of Primary Energy Transduction in Biology. , 338-373 (2017).</li><li>Pullman, M. E., Penefsky, H. S., Datta, A., Racker, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partial+resolution+of+the+enzymes+catalyzing+oxidative+phosphorylation.+I.+Purification+and+properties+of+soluble+dinitrophenol-stimulated+adenosine+triphosphatase.">Partial resolution of the enzymes catalyzing oxidative phosphorylation. I. Purification and properties of soluble dinitrophenol-stimulated adenosine triphosphatase.</a> The Journal of Biological Chemistry. 235, 3322-3329 (1960).</li><li>Schatz, G., Penefsky, H. S., Racker, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partial+resolution+of+the+enzymes+catalyzing+oxidative+phosphorylation.">Partial resolution of the enzymes catalyzing oxidative phosphorylation.</a> XIV. The Journal of Biological Chemistry. 242 (10), 2552-2560 (1967).</li><li>Racker, E., Horstman, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partial+resolution+of+the+enzymes+catalyzing+oxidative+phosphorylation.+13.+Structure+and+function+of+submitochondrial+particles+completely+resolved+with+respect+to+coupling+factor.">Partial resolution of the enzymes catalyzing oxidative phosphorylation. 13. Structure and function of submitochondrial particles completely resolved with respect to coupling factor.</a> The Journal of Biological Chemistry. 242 (10), 2547-2551 (1967).</li><li>Senior, A. E., Brooks, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+the+mitochondrial+oligomycin-insensitive+ATPase.+I.+An+improved+method+of+purification+and+the+behavior+of+the+enzyme+in+solutions+of+various+depolymerizing+agents.">Studies on the mitochondrial oligomycin-insensitive ATPase. I. An improved method of purification and the behavior of the enzyme in solutions of various depolymerizing agents.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 140 (1), 257-266 (1970).</li><li>Tzagoloff, A., Meagher, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+the+mitochondrial+membrane+system.+V.+Properties+of+a+dispersed+preparation+of+the+rutamycin-sensitive+adenosine+triphosphatase+of+yeast+mitochondria.">Assembly of the mitochondrial membrane system. V. Properties of a dispersed preparation of the rutamycin-sensitive adenosine triphosphatase of yeast mitochondria.</a> The Journal of Biological Chemistry. 246 (23), 7328-7336 (1971).</li><li>Beechey, R. B., Hubbard, S. A., Linnett, P. E., Mitchell, A. D., Munn, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+rapid+method+for+the+preparation+of+adenosine+triphosphatase+from+submitochondrial+particles.">A simple and rapid method for the preparation of adenosine triphosphatase from submitochondrial particles.</a> Biochemical Journal. 148 (3), 533-537 (1975).</li><li>Tyler, D. D., Webb, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+properties+of+the+adenosine+triphosphatase+released+from+the+liver+mitochondrial+membrane+by+chloroform.">Purification and properties of the adenosine triphosphatase released from the liver mitochondrial membrane by chloroform.</a> Biochemical Journal. 178 (2), 289-297 (1979).</li><li>Hack, E., Leaver, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+alpha-subunit+of+the+maize+F1-ATPase+is+synthesised+in+the+mitochondrion.">The alpha-subunit of the maize F1-ATPase is synthesised in the mitochondrion.</a> The EMBO Journal. 2 (10), 1783-1789 (1983).</li><li>Dunn, P. P., Slabas, A. R., Moore, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+F1-ATPase+from+cuckoo-pint+(Arum+maculatum)+mitochondria.+A+comparison+of+subunit+composition+with+that+of+rat+liver+F1-ATPase.">Purification of F1-ATPase from cuckoo-pint (Arum maculatum) mitochondria. A comparison of subunit composition with that of rat liver F1-ATPase.</a> Biochemical Journal. 225 (3), 821-824 (1985).</li><li>Satre, M., Bof, M., Vignais, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+Escherichia+coli+adenosine+triphosphatase+with+aurovertin+and+citreoviridin:+inhibition+and+fluorescence+studies.">Interaction of Escherichia coli adenosine triphosphatase with aurovertin and citreoviridin: inhibition and fluorescence studies.</a> Journal of Bacteriology. 142 (3), 768-776 (1980).</li><li>Abrahams, J. P., Leslie, A. G., Lutter, R., Walker, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+at+2.8+&#197;+resolution+of+F1ATPase+from+bovine+heart+mitochondria.">Structure at 2.8 &#197; resolution of F1ATPase from bovine heart mitochondria.</a> Nature. 370 (6491), 621-628 (1994).</li><li>Lutter, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallization+of+F1-ATPase+from+bovine+heart+mitochondria.">Crystallization of F1-ATPase from bovine heart mitochondria.</a> Journal of Molecular Biology. 229 (3), 787-790 (1993).</li><li>Kabaleeswaran, V., Puri, N., Walker, J. E., Leslie, A. G., Mueller, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+features+of+the+rotary+catalytic+mechanism+revealed+in+the+structure+of+yeast+F1-ATPase.">Novel features of the rotary catalytic mechanism revealed in the structure of yeast F1-ATPase.</a> The EMBO Journal. 25 (22), 5433-5442 (2006).</li><li>Shirakihara, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+a+thermophilic+F1-ATPase+inhibited+by+an+epsilon-subunit:+deeper+insight+into+the+epsilon-inhibition+mechanism.">Structure of a thermophilic F1-ATPase inhibited by an epsilon-subunit: deeper insight into the epsilon-inhibition mechanism.</a> The FEBS Journal. 282 (15), 2895-2913 (2015).</li><li>Stocker, A., Keis, S., Cook, G. M., Dimroth, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification,+crystallization,+and+properties+of+F1-ATPase+complexes+from+the+thermoalkaliphilic+Bacillus+sp.+strain+TA2.A1.">Purification, crystallization, and properties of F1-ATPase complexes from the thermoalkaliphilic Bacillus sp. strain TA2.A1.</a> Journal of Structural Biology. 152 (2), 140-145 (2005).</li><li>Ferguson, S. A., Cook, G. M., Montgomery, M. G., Leslie, A. G., Walker, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+thermoalkaliphilic+F1-ATPase+from+Caldalkalibacillus+thermarum.">Regulation of the thermoalkaliphilic F1-ATPase from Caldalkalibacillus thermarum.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (39), 10860-10865 (2016).</li><li>Cataldi de Flombaum, M. A., Frasch, A. C. C., Stoppani, A. O. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenosine+triphosphatase+from+Trypanosoma+cruzi:+purification+and+properties.">Adenosine triphosphatase from Trypanosoma cruzi: purification and properties.</a> Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Comparative Biochemistry. 65 (1), 103-109 (1980).</li><li>Williams, N., Frank, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrial+ATP+synthase+of+Trypanosoma+brucei:+isolation+and+characterization+of+the+intact+F1+moiety.">The mitochondrial ATP synthase of Trypanosoma brucei: isolation and characterization of the intact F1 moiety.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. 43 (1), 125-132 (1990).</li><li>Higa, A. I., Cazzulo, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mg2+-activated+adenosine+triphosphatase+from+Crithidia+fasciculata:+purification+and+inhibition+by+suramin+and+efrapeptin.">Mg2+-activated adenosine triphosphatase from Crithidia fasciculata: purification and inhibition by suramin and efrapeptin.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. 3 (6), 357-367 (1981).</li><li>Walker, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+structure+and+subunit+stoichiometry+of+F1-ATPase+from+bovine+mitochondria.">Primary structure and subunit stoichiometry of F1-ATPase from bovine mitochondria.</a> Journal of Molecular Biology. 184 (4), 677-701 (1985).</li><li>Mueller, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ni-chelate-affinity+purification+and+crystallization+of+the+yeast+mitochondrial+F1-ATPase.">Ni-chelate-affinity purification and crystallization of the yeast mitochondrial F1-ATPase.</a> Protein Expression and Purification. 37 (2), 479-485 (2004).</li><li>Gahura, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+F1-ATPase+from+Trypanosoma+brucei+is+elaborated+by+three+copies+of+an+additional+p18-subunit.">The F1-ATPase from Trypanosoma brucei is elaborated by three copies of an additional p18-subunit.</a> The FEBS Journal. 285 (3), 614-628 (2018).</li><li>Montgomery, M. G., Gahura, O., Leslie, A. G. W., Zikova, A., Walker, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATP+synthase+from+Trypanosoma+brucei+has+an+elaborated+canonical+F1-domain+and+conventional+catalytic+sites.">ATP synthase from Trypanosoma brucei has an elaborated canonical F1-domain and conventional catalytic sites.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (9), 2102-2107 (2018).</li><li>Schneider, A., Charriere, F., Pusnik, M., Horn, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+mitochondria+from+procyclic+Trypanosoma+brucei.">Isolation of mitochondria from procyclic Trypanosoma brucei.</a> Methods in Molecular Biology. 372, 67-80 (2007).</li><li>Smith, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+protein+using+bicinchoninic+acid.">Measurement of protein using bicinchoninic acid.</a> Analytical Biochemistry. 150 (1), 76-85 (1985).</li><li>Wirtz, E., Leal, S., Ochatt, C., Cross, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tightly+regulated+inducible+expression+system+for+conditional+gene+knock-outs+and+dominant-negative+genetics+in+Trypanosoma+brucei.">A tightly regulated inducible expression system for conditional gene knock-outs and dominant-negative genetics in Trypanosoma brucei.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. 99 (1), 89-101 (1999).</li><li>Speijer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+respiratory+chain+from+cultured+Crithidia+fasciculata.">Characterization of the respiratory chain from cultured Crithidia fasciculata.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. 85 (2), 171-186 (1997).</li><li>Nelson, R. E., Aphasizheva, I., Falick, A. M., Nebohacova, M., Simpson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+I-complex+in+Leishmania+tarentolae+is+an+uniquely-structured+F1-ATPase.">The I-complex in Leishmania tarentolae is an uniquely-structured F1-ATPase.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. 135 (2), 221-224 (2004).</li><li>Carbajo, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+the+N-terminal+domain+of+the+OSCP+subunit+of+bovine+F1Fo-ATP+synthase+interacts+with+the+N-terminal+region+of+an+alpha+subunit.">How the N-terminal domain of the OSCP subunit of bovine F1Fo-ATP synthase interacts with the N-terminal region of an alpha subunit.</a> Journal of Molecular Biology. 368 (2), 310-318 (2007).</li><li>Bowler, M. W., Montgomery, M. G., Leslie, A. G., Walker, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ground+state+structure+of+F1-ATPase+from+bovine+heart+mitochondria+at+1.9+&#197;+resolution.">Ground state structure of F1-ATPase from bovine heart mitochondria at 1.9 &#197; resolution.</a> The Journal of Biological Chemistry. 282 (19), 14238-14242 (2007).</li></ol>

Das Protokoll für F1-ATPase Reinigung von T. Trypanosomen wurde entwickelt, basierende auf zuvor veröffentlichte Methoden für die Isolierung von F1-ATPase komplexe aus anderen Arten13,14. Die Methode erfordert keine genetische Änderungen (z. B.tagging) und ergibt einen vollaktiven Komplex mit allen Untereinheiten vorhanden. Der entscheidende Schritt ist die Chloroform erleichterte Version von F-1-ATPase aus d...

Die F-Typ-ATP-Synthasen sind Membrane-springen rotierende Multi-komplexe, dass paar Protonen-Translokation über Energie-transducing Membranen von Bakterien, Mitochondrien und Chloroplasten mit der Bildung von ATP. Molekularen Details des rotierenden Mechanismus der ATP-Synthese sind vor allem wegen der strukturellen Studien des gereinigten Bakterien- und mitochondrialen ATP-Synthasen und ihre Subcomplexes1bekannt. F-Typ-ATP-Synthase ist in Membran-intrinsische und extrinsische Membran Moieties unterteilt. Der Membran-extrinsische Teil, bekannt als F-1-ATPase, enthält drei katalytischen Standorte, wo die Phosphorylierung des Adenosin-diphosphat (ADP), ATP oder die umgekehrte Reaktion auftritt. F1-ATPase kann unter Beibehaltung seiner Fähigkeit, Hydrolyseneigung, aber nicht synthetisieren ATP experimentell aus der Membran-intrinsische glyko-freigesetzt werden. Die Membrane-springen-Sektor, genannt Fo, vermittelt Protein Translokation, die die Drehung des zentralen Teils des Enzyms antreibt. F1 und Fo Sektoren sind durch die zentrale und periphere Stiele verbunden.
Die ersten Versuche, die F-1zu reinigen-ATPase aus angehenden Hefe und Rinder Herz Mitochondrien Datum zurück bis in die 1960er Jahre. Diese Protokolle verwendet extrahiert Mitochondrien, die durch Ultraschallbehandlung, fraktioniert durch Ammonium oder Protamin Sulfat-Fällung, gefolgt von optionalen Chromatographie Schritte und Wärmebehandlung2,3,4 gestört wurden ,5,6. Die Reinigung wurde stark verbessert und vereinfacht durch die Verwendung von Chloroform, die bereitwillig die F-1frei-ATPase aus der mitochondrialen Membran Fragmente7. Die Chloroform-Extraktion wurde dann zur F1Auszug - ATPasen aus verschiedenen Tier-, Pflanzen- und bakteriellen Quellen (z.B., Ratte Leber8Mais9, Arum Maculatum10und Escherichia coli 11). Weitere Reinigung des Chloroform veröffentlicht F1-ATPase durch Affinität oder Größe-Exclusion Chromatography (SEC) ergab eine hochreine Proteinkomplex, der für hochauflösende Strukturaufklärung durch Röntgen-Kristallographie geeignet war, als dokumentiert von den Strukturen des F-1-ATPase aus bovine Herz12,13 und Saccharomyces Cerevisiae14. F1-ATPase Strukturen wurden auch von Organismen, die schwierig zu kultivieren sind bestimmt und somit beschränkte sich des Betrags des ursprünglichen biologischen Materials. In diesem Fall, die F-1-ATPase Untereinheiten wurden künstlich zum Ausdruck gebracht und montiert in den Komplex in E. Coli, und das ganze heterologe Enzym durch Affinität Chromatographie über einen tagged Untereinheit gereinigt wurde. Dieser Ansatz führte zu die Bestimmung des F-1-ATPase Strukturen aus zwei thermophile Bakterien-Spezies, Geobacillus Stearothermophilus15 und Caldalkalibacillus Thermarum16, 17. diese Methode ist jedoch eher ungeeignet für eukaryotische F1- ATPasen da es stützt sich auf die prokaryotische Protheosynthetic Apparat, posttranslationale Verarbeitung und aufwändige Montage.
Die Chloroform-basierte Extraktion war früher F1isolieren - ATPasen aus einzelligen Digenetic Parasiten Trypanosoma Trypanosomen18 und T. Trypanosomen19, wichtigen Säugetieren Krankheitserreger verursacht amerikanische und Afrikanische Trypanosomiases bzw. monogenen Insekten Parasiten Crithidia Fasciculata20. Diese Reinigungen führte nur eine einfache Beschreibung des F-1- ATPasen, da keine downstream-Anwendungen verwendet wurden, um vollständig zu charakterisieren, die Zusammensetzung, Struktur und enzymatischen Eigenschaften des Komplexes. Dieser Artikel beschreibt eine optimierte Methode für F1-ATPase Reinigung von der kultivierten Insekt Lebenszyklus von T. Trypanosomen. Die Methode ist basiert auf die etablierte Protokolle zur Isolation von Rindern und Hefe F1- ATPasen21,22entwickelt. Das Verfahren liefert sehr reine und homogene Enzym geeignet für in-vitro- enzymatische und hemmenden Assays, detaillierte Proteomic Charakterisierung durch Massenspektrometrie23und Struktur Entschlossenheit24. Die Reinigung-Protokoll und das Wissen um die F-1-ATPase-Struktur auf atomarer Ebene öffnet eine Möglichkeit zur Gestaltung von Bildschirme zu identifizieren Small-Molecule-Inhibitoren und Hilfe bei der Entwicklung neuer Medikamente gegen afrikanische Trypanosomiases. Darüber hinaus lässt sich das Protokoll anpassen, F1zu reinigen-ATPase aus anderen Organismen.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosin Diphosphate Disodium Salt (ADP)</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A0948</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amastatin Hydrochloride</td>
			<td>Glantham Life Sciences</td>
			<td>GA1330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aminocaproic Acid</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A2266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>ThermoFischer Scientific/Pierce</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzamidine Hydrochloride</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>199001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bestatin Hydrochloride</td>
			<td>Sigma Aldrich/Merck</td>
			<td>B8385</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete Tablets, Mini EDTA-free</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4693159001</td>
			<td>Protease inhibitor cocktail tablets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic Acid (EDTA)</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td></td>
			<td>For pH adjustment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ile-Pro-Ile</td>
			<td>Sigma Aldrich/Merck</td>
			<td>I9759</td>
			<td>Alias Diprotin A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leupeptin</td>
			<td>Sigma Aldrich/Merck</td>
			<td>L2884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate Heptahydrate</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pepstatin A</td>
			<td>Sigma Aldrich/Merck</td>
			<td>P5318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Electrophoresis System</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Consumables</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Tubes for SW60Ti, Polyallomer</td>
			<td>Beckman Coulture</td>
			<td>328874</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DounceTissues Homogenizer 2 mL</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Vacuum Filtration Device</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>516-7017</td>
			<td>Degasing solutions for liquid chromatography</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiTrap Q HP, 5 mL</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>17115401</td>
			<td>Anion exchange chromatography column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Regenaretad Cellulose Membrane Filters, pore size 0.45 &#956;m, diameter 47 mm</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>18406--47------N</td>
			<td>Degasing solutions for liquid chromatography</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superdex 200 Increase 10/300 GL</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>29091596</td>
			<td>Size-exclusion chromatography column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vivaspin 6 MWCO 100 kDa PES</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>VS0641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AKTA Pure 25</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>29018224</td>
			<td>Or similar FPLC system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer Shimadzu UV-1601</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td></td>
			<td>Or similar spectrophotometer with kinetic assay mode</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge Beckman Optima with SW60Ti Rotor</td>
			<td>Beckman Coulture</td>
			<td></td>
			<td>Or similar ultracentrifuge and rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic Homogenizer with Thin Probe, Model 3000</td>
			<td>BioLogics</td>
			<td>0-127-0001</td>
			<td>Or similar ultrasonic homogenizer</td>
		</tr>
	</tbody>
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isolation of f1-atpase from the parasitic protist trypanosoma brucei

F1-ATPase ist ein Membran-extrinsische katalytische Subcomplex von F-Typ-ATP-Synthase, ein Enzym, das die Proton Motor über Biologische Membranen verwendet, um Adenosintriphosphat (ATP) zu produzieren. Die Isolation der intakten F1-ATPase native entspringt ist eine wesentliche Voraussetzung für des Enzyms Proteinzusammensetzung, kinetische Parameter und Sensibilität für Inhibitoren zu charakterisieren. Ein hochreines, homogene F1-ATPase eignet sich für strukturelle Studien, die Einblick in die molekularen Mechanismen der ATP-Synthese und Hydrolyse. Dieser Artikel beschreibt ein Verfahren zur Reinigung von der F-1-ATPase aus Trypanosomen Trypanosomen, die Erreger der afrikanischen Trypanosomiases. Die F-1-ATPase ist isoliert von mitochondrialen Vesikel, die durch hypotone lyse von in Vitro kultivierten Trypanosomen gewonnen werden. Die Vesikel sind mechanisch fragmentiert, Beschallung und der F-1-ATPase ist durch die Chloroform-Extraktion aus der inneren mitochondrialen Membran befreit. Der enzymatische Komplex wird weiter durch aufeinanderfolgende Anion Austausch und Größe-Ausschluss Chromatographie gereinigt. Sensible Massenspektrometrie Techniken zeigte, dass die gereinigte Anlage frei von nahezu jedem Protein Verunreinigungen ist und daher, geeignetes Material zur Strukturaufklärung durch Röntgen-Kristallographie oder Kryo-Elektronenmikroskopie stellt. Die isolierte F1-ATPase Exponate ATP hydrolytische Aktivität, die voll von Natriumazid, ein potenter Inhibitor der F-Typ-ATP-Synthasen gehemmt werden kann. Die gereinigte Anlage bleibt stabil und aktiv für mindestens drei Tage bei Zimmertemperatur. Niederschlag von Ammoniumsulfat wird für die langfristige Lagerung verwendet. Ähnliche Verfahren werden für die Reinigung von F1- ATPasen aus Säugetieren und pflanzlichen Geweben, Hefen oder Bakterien. So kann die vorgestellte Protokoll dienen als Richtschnur für die F-1-ATPase isoliert von anderen Organismen.

Eine typische Reinigung (Abbildung 1) beginnt mit mitochondrialen Vesikel (Mitoplasts) isoliert auf die Percoll Steigung von hypotonically lysierten 1 x 10-11 , 2 x 1011 prozyklischen T. Trypanosomen Zellen25 kultiviert in standard Glukose-reiche SDM-79 mittlere27. Die Mitoplasts sind durch Ultraschallbehandlung, gesponnen, fragmentiert und der Matrix-haltigen Überstand wird verwo...

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Isolation of F1-ATPase from the Parasitic Protist Trypanosoma brucei

Dieses Protokoll beschreibt die Reinigung des F-1-ATPase aus dem kultivierten Insekt Stadium der Trypanosomen Trypanosomen. Das Verfahren ergibt einen sehr reinen, homogen und aktive Komplex für strukturelle und enzymatische Studien geeignet.

Isolierung der F1-ATPase aus der parasitären protiste Trypanosomen Trypanosomen

F1-ATPase is a membrane-extrinsic catalytic subcomplex of F-type ATP synthase, an enzyme that uses the proton motive force across biological membranes to ...

Die Reinigung von F1-ATPase basiert auf klassischen biochemischen Methoden, die sich als entscheidend für unser Verständnis des Mechanismus der ATP-Produktion durch andere ATP-Synthasen erwiesen haben. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie ein hochreines Enzym produziert, das sich durch Röntgenkristallographie oder Kryo-Elektronenmikroskopie zur Strukturbestimmung eignet. Obwohl dieses Protokoll für die Isolierung von F1-ATPase von Trypanosomen optimiert ist, kann es an andere Quellen, wie Gewebe- oder Kulturzellen, und an verschiedene pathogene Protisten angepasst werden.Diese Technik kann zur Identifizierung neuer Medikamente zur Behandlung schwerer menschlicher Krankheiten führen. Zum Beispiel ist Mycobacterium tuberculosis F-ATPase ein authentifiziertes Arzneimittelziel für die Behandlung von Tuberkulose. Um das Protokoll zu beginnen, tauen und sanft mitochondriale Vesikel, auch bekannt als Mitoplasten, früher durch hypotonische Lyse von ein mal 10 bis 11 bis zwei mal 10 bis zu den 11 Zellen der prozyklischen Trypanosoma brucei in fünf Millilitereiskaltepuffer A isoliert.Als nächstes bestimmen Sie die Proteinkonzentration in der Suspension durch die Bicinchoninsäure, oder BCA, Protein-Assay nach den Anweisungen des Herstellers. Führen Sie eine BSA-Verdünnungsserie in reinem Ultrawasser durch, um die Standardkurve zu konstruieren. Verdünnen Sie eine kleine Menge der Probe 20 bis 100 Mal mit reinem Ultrawasser, um in den Bereich der BSA-Standards zu passen.Nach der Berechnung der gesamten Proteinmenge in der Probe, bringen Sie die Proteinkonzentration auf 16 Milligramm pro Milliliter durch Verdünnung mit zusätzlichem Puffer A.Dann fragmentieren Sie die Mitoplasten in umgekehrte Vesikel und Membranstücke durch Beschallung sieben mal für jeweils 15 Sekunden, mit einer Gesamtenergie von 70 bis 100 Joule pro Impuls mit einer Mikrospitze mit einem Durchmesser von 3,9 Millimetern. Während der Fragmentierung, inkubieren Sie die Probe auf Eis für 30 Sekunden zwischen den Impulsen. Nach der Beschallung kann die Suspension etwas dunkler erscheinen.Sedimentieren Sie die Membranfragmente durch Ultrazentrifugation bei 54 000 g für 16 Stunden oder bei 98 000 g für fünf Stunden bei vier Grad Celsius. Dekantieren Sie den Überstand und fahren Sie mit der Chloroformextraktion fort. Berechnen Sie das Volumen von Puffer B basierend auf der Gesamtmenge des verwendeten Puffers A.Das gefrorene Sediment aus dem Zentrifugenrohr in den Homogenisator geben. Setzen Sie das Pellet der mitochondrialen Membranen in Puffer B mit Hilfe eines kleinen Dounce Homogenisators wieder auf. Übertragen Sie die Suspension in ein 50 Milliliter konisches Rohr.Entfernen Sie die Probe aus dem Eis, und halten Sie die Probe und alle Lösungen bei Raumtemperatur für die verbleibenden Schritte. Dann chloroform gesättigt mit zwei Molaren tris mit HCl auf pH 8,5, eins zu eins eingestellt. Schließen Sie die Kappe fest, und schütteln Sie die Probe genau 20 Sekunden lang kräftig.Die Mischung sofort bei 8, 400 g fünf Minuten bei Raumtemperatur zentrieren. Übertragen Sie als Nächstes die obere, trübe wässrige Phase auf 1,6 Milliliter Mikroröhren. Fügen Sie der Probe Proteaseinhibitoren hinzu, um die durch die Chloroform-Behandlung entfernten Inhibitoren zu ersetzen.Zentrifugieren Sie die Proben bei 13.000 g für 30 Minuten bei Raumtemperatur. Nach der Drehung den Überstand auf frische Mikroröhrchen übertragen und die Zentrifugation wiederholen, um das verbleibende unlösliche Material zu entfernen. Equilibrate die Fünf-Milliliter-Anionenaustausch Q-Säule, die an ein schnelles Proteinflüssigkeitschromatographiesystem mit 50 Millilitern Q-Säulenpuffer mit einer Durchflussrate von fünf Millilitern pro Minute befestigt ist, bis sich die Absorption bei 280 Nanometern stabilisiert und die Leitfähigkeit stabilisiert wird.Laden Sie den Überstand mit einer Durchflussrate von einem Milliliter pro Minute auf die ausgeglichene Säule. Warten Sie, bis sich die Absorption bei 280 Nanometern im Hintergrund stabilisiert. Wenden Sie einen linearen Gradienten der Q-Spalte von 0 % bis 100 % bei einer Durchflussrate von 0,5 Milliliter pro Minute auf und sammeln Sie einen Milliliter-Anteil.Assay 10 Mikroliter jeder einzelnen Fraktion entsprechend der Hauptelutionsspitze für DIE ATP-Hydrolytische Aktivität pro Milliliter Reaktionsmischung durch den Pullman ATPase-Assay bei pH 8,0. Poolen Sie die Brüche, die ATPase-Aktivität aufweisen. Konzentrieren Sie die gepoolte Probe durch Membran-Ultrafiltration mit einer Spinsäule mit einem 100.000 Molekulargewichts-Cutoff-PES-Filter auf 200 bis 500 Mikroliter.Fahren Sie dann mit der Größenausschlusschromatographie fort. Equilibrate die Superose 6 Erhöhen Spalte an einem flüssigen Chromatographie-System mit mindestens 48 Milliliter SEC Puffer bei einer Durchflussrate von 0,5 Milliliter pro Minute befestigt. Wenden Sie das Beispiel auf die Spalte an.Führen Sie die Chromatographie mit einer Durchflussrate von 0,25 Milliliterpro Minute aus und sammeln Sie dabei 0,25 Milliliter-Fraktionen. Als nächstes laufen 10 Mikroliter der Fraktionen, die den Spitzen der UV 280 Nanometer Absorptionsspur auf SDS-PAGE entsprechen. Dann färben Sie die Proben mit Coomassie Blue.Assay die Brüche, die dem ersten großen Peak entsprechen, der den F1-Peak für die ATP-Hydrolytische Aktivität und die Azidempfindlichkeit durch den Pullman ATPase-Assay enthält. Führen Sie dann einen BCA-Test durch, um die Proteinkonzentration zu bestimmen. Halten Sie schließlich die gereinigte F1-ATPase bei Raumtemperatur auf und verwenden Sie sie innerhalb von drei Tagen nach der Reinigung für nachgeschaltete Anwendungen.Dieses Elutionsprofil einer Anionenaustauschchromatographie zeigt die UV-Absorption bei 280 Nanometern und die Konzentration von Natriumchlorid im Elutionspuffer. Die ausgewählten Fraktionen wurden auf dem SDS-PAGE Gel abgetrennt und mit Coomassie Blue Farbstoff gefärbt. Die Fraktionen, die dem Hauptelutionsspitzen aus der Anionenaustauschchromatographie entsprechen und die F1-ATPase enthalten, wurden gepoolt, konzentriert und als Input für die Größenausschlusschromatographie verwendet.Der Hauptschadstoff ist die Dihydrolipoyldehydrogenase, die aus der Farbtonographiesäule größe-Ausschluss als diskreter Peak elutiert. Die F1-ATPase elutiert in der ersten dominanten, weitgehend symmetrischen Spitze. Die Coomassie Blue Färbung eines typischen Bandmusters nach der Trennung der gereinigten F1-ATPase über SDS-PAGE zeigt sporadische schwache Bänder, die über der Beta-Untereinheit sichtbar sind, die Unterkomplexe der alpha drei Beta-Dreikopfgeräte, Dimere und Oligomere der Alpha- und Beta-Untereinheiten darstellen und frei von Verunreinigungen sind, die durch Massenspektrometrie nachweisbar sind.Bei der Chloroformextraktion, dem entscheidenden Schritt des Protokolls, ist es wichtig, die Probe kräftig zu schütteln und sofort zur Zentrifugaltrennung der organischen und wässrigen Phasen überzugehen. Nach diesem Verfahren kann die isolierte F1-ATPase im Detail durch Massenspektrometrie charakterisiert werden. Darüber hinaus kann es in Aktivitätstests oder für Strukturstudien verwendet werden, entweder allein oder in Gegenwart von verschiedenen Inhibitoren oder Substratanaloga.

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Isolation of F1-ATPase from the Parasitic Protist Trypanosoma brucei

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Isolation of Cognate RNA-protein Complexes from Cells Using Oligonucleotide-directed Elution

Isolierung von Cognate RNA-Protein-Komplexe von Zellen unter Verwendung von Oligonukleotid-gerichtete Elution

Ribonucleoprotein particles direct the biogenesis and post-transcriptional regulation of all mRNAs through distinct combinations of RNA binding proteins. ...

Forschung

Biochemie

An Efficient Method for the Isolation of Highly Purified RNA from Seeds for Use in Quantitative Transcriptome Analysis

Eine effiziente Methode zur Isolierung von Highly Purified RNA aus Samen für die Verwendung in Quantitative Transkriptomanalyse

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Tandem Affinity Purification of Protein Complexes from Eukaryotic Cells

Tandem Affinity Purification von Proteinkomplexen aus eukaryotischen Zellen

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo ...

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolation und Atemwege Messungen der Mitochondrien von Arabidopsis thaliana

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Proteinverdauung, Ultrafiltration und Größe Ausgrenzung Chromatographie, die Isolation der Exosomen aus menschlichem Blutplasma und Serum zu optimieren

Exosomes, a type of nanovesicle released from all cell types, can be isolated from any bodily fluid. The contents of exosomes, including proteins and ...

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Isolierung von Lipoproteinpartikeln aus Hühnereigelb zur Untersuchung des bakteriellen Pathogens Fettsäure-Inkorporation in Membranphospholipide

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Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

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Übersetzen von Ribososomen-Affinitätsreinigung (TRAP) zur RNA-Isolierung von Endothelzellen In vivo

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Ready-To-Use qPCR for Detection of DNA from Trypanosoma cruzi or Other Pathogenic Organisms

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Gebrauchsfertige qPCR zum Nachweis von DNA aus Trypanosoma cruzi oder anderen pathogenen Organismen

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