Name: isolation of f1-atpase from the parasitic protist trypanosoma brucei
Uploaded: 2019-01-22T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of F1-ATPase from the Parasitic Protist Trypanosoma brucei at JoVE.com

עבודה זו מומן על ידי משרד החינוך ERC CZ הענק LL1205, המענק גרנט סוכנות של צ'כיה 18-17529S, ולא על ידי ERDF/ESF פרויקט מרכז לחקר פתוגניות, התקפה אלימה של טפילים (מס ' CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_019/0000759).

1. מאגרי ופתרונות
<ol><li>הכינו את הפתרונות המפורטים להלן. דגה כל מאגרים עבור כרומטוגרפיה נוזלית. מוסיפים מעכבי ADP benzamidine, פרוטאז רק לפני השימוש.<ol>
<li>להכין מאגר ת: 50 מ מ טריס מאגר עם חומצת מלח (HCl-טריס) pH 8.0, 0.25 M סוכרוז, benzamidine 5 מ"מ, 5 מ"מ אמינו קפרון מעכבי חומצה (ACA) ולאחר פרוטאז (10 מיקרומטר amastatin 50 מיק?...

<ol>
	<li>Walker, J. E., Wikstr&#246;m, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure,+mechanism+and+regulation+of+ATP+synthases.">Structure, mechanism and regulation of ATP synthases.</a> Mechanisms of Primary Energy Transduction in Biology. , 338-373 (2017).</li><li>Pullman, M. E., Penefsky, H. S., Datta, A., Racker, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partial+resolution+of+the+enzymes+catalyzing+oxidative+phosphorylation.+I.+Purification+and+properties+of+soluble+dinitrophenol-stimulated+adenosine+triphosphatase.">Partial resolution of the enzymes catalyzing oxidative phosphorylation. I. Purification and properties of soluble dinitrophenol-stimulated adenosine triphosphatase.</a> The Journal of Biological Chemistry. 235, 3322-3329 (1960).</li><li>Schatz, G., Penefsky, H. S., Racker, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partial+resolution+of+the+enzymes+catalyzing+oxidative+phosphorylation.">Partial resolution of the enzymes catalyzing oxidative phosphorylation.</a> XIV. The Journal of Biological Chemistry. 242 (10), 2552-2560 (1967).</li><li>Racker, E., Horstman, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partial+resolution+of+the+enzymes+catalyzing+oxidative+phosphorylation.+13.+Structure+and+function+of+submitochondrial+particles+completely+resolved+with+respect+to+coupling+factor.">Partial resolution of the enzymes catalyzing oxidative phosphorylation. 13. Structure and function of submitochondrial particles completely resolved with respect to coupling factor.</a> The Journal of Biological Chemistry. 242 (10), 2547-2551 (1967).</li><li>Senior, A. E., Brooks, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+the+mitochondrial+oligomycin-insensitive+ATPase.+I.+An+improved+method+of+purification+and+the+behavior+of+the+enzyme+in+solutions+of+various+depolymerizing+agents.">Studies on the mitochondrial oligomycin-insensitive ATPase. I. An improved method of purification and the behavior of the enzyme in solutions of various depolymerizing agents.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 140 (1), 257-266 (1970).</li><li>Tzagoloff, A., Meagher, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+the+mitochondrial+membrane+system.+V.+Properties+of+a+dispersed+preparation+of+the+rutamycin-sensitive+adenosine+triphosphatase+of+yeast+mitochondria.">Assembly of the mitochondrial membrane system. V. Properties of a dispersed preparation of the rutamycin-sensitive adenosine triphosphatase of yeast mitochondria.</a> The Journal of Biological Chemistry. 246 (23), 7328-7336 (1971).</li><li>Beechey, R. B., Hubbard, S. A., Linnett, P. E., Mitchell, A. D., Munn, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+rapid+method+for+the+preparation+of+adenosine+triphosphatase+from+submitochondrial+particles.">A simple and rapid method for the preparation of adenosine triphosphatase from submitochondrial particles.</a> Biochemical Journal. 148 (3), 533-537 (1975).</li><li>Tyler, D. D., Webb, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+properties+of+the+adenosine+triphosphatase+released+from+the+liver+mitochondrial+membrane+by+chloroform.">Purification and properties of the adenosine triphosphatase released from the liver mitochondrial membrane by chloroform.</a> Biochemical Journal. 178 (2), 289-297 (1979).</li><li>Hack, E., Leaver, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+alpha-subunit+of+the+maize+F1-ATPase+is+synthesised+in+the+mitochondrion.">The alpha-subunit of the maize F1-ATPase is synthesised in the mitochondrion.</a> The EMBO Journal. 2 (10), 1783-1789 (1983).</li><li>Dunn, P. P., Slabas, A. R., Moore, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+F1-ATPase+from+cuckoo-pint+(Arum+maculatum)+mitochondria.+A+comparison+of+subunit+composition+with+that+of+rat+liver+F1-ATPase.">Purification of F1-ATPase from cuckoo-pint (Arum maculatum) mitochondria. A comparison of subunit composition with that of rat liver F1-ATPase.</a> Biochemical Journal. 225 (3), 821-824 (1985).</li><li>Satre, M., Bof, M., Vignais, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+Escherichia+coli+adenosine+triphosphatase+with+aurovertin+and+citreoviridin:+inhibition+and+fluorescence+studies.">Interaction of Escherichia coli adenosine triphosphatase with aurovertin and citreoviridin: inhibition and fluorescence studies.</a> Journal of Bacteriology. 142 (3), 768-776 (1980).</li><li>Abrahams, J. P., Leslie, A. G., Lutter, R., Walker, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+at+2.8+&#197;+resolution+of+F1ATPase+from+bovine+heart+mitochondria.">Structure at 2.8 &#197; resolution of F1ATPase from bovine heart mitochondria.</a> Nature. 370 (6491), 621-628 (1994).</li><li>Lutter, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallization+of+F1-ATPase+from+bovine+heart+mitochondria.">Crystallization of F1-ATPase from bovine heart mitochondria.</a> Journal of Molecular Biology. 229 (3), 787-790 (1993).</li><li>Kabaleeswaran, V., Puri, N., Walker, J. E., Leslie, A. G., Mueller, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+features+of+the+rotary+catalytic+mechanism+revealed+in+the+structure+of+yeast+F1-ATPase.">Novel features of the rotary catalytic mechanism revealed in the structure of yeast F1-ATPase.</a> The EMBO Journal. 25 (22), 5433-5442 (2006).</li><li>Shirakihara, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+a+thermophilic+F1-ATPase+inhibited+by+an+epsilon-subunit:+deeper+insight+into+the+epsilon-inhibition+mechanism.">Structure of a thermophilic F1-ATPase inhibited by an epsilon-subunit: deeper insight into the epsilon-inhibition mechanism.</a> The FEBS Journal. 282 (15), 2895-2913 (2015).</li><li>Stocker, A., Keis, S., Cook, G. M., Dimroth, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification,+crystallization,+and+properties+of+F1-ATPase+complexes+from+the+thermoalkaliphilic+Bacillus+sp.+strain+TA2.A1.">Purification, crystallization, and properties of F1-ATPase complexes from the thermoalkaliphilic Bacillus sp. strain TA2.A1.</a> Journal of Structural Biology. 152 (2), 140-145 (2005).</li><li>Ferguson, S. A., Cook, G. M., Montgomery, M. G., Leslie, A. G., Walker, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+thermoalkaliphilic+F1-ATPase+from+Caldalkalibacillus+thermarum.">Regulation of the thermoalkaliphilic F1-ATPase from Caldalkalibacillus thermarum.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (39), 10860-10865 (2016).</li><li>Cataldi de Flombaum, M. A., Frasch, A. C. C., Stoppani, A. O. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenosine+triphosphatase+from+Trypanosoma+cruzi:+purification+and+properties.">Adenosine triphosphatase from Trypanosoma cruzi: purification and properties.</a> Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Comparative Biochemistry. 65 (1), 103-109 (1980).</li><li>Williams, N., Frank, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrial+ATP+synthase+of+Trypanosoma+brucei:+isolation+and+characterization+of+the+intact+F1+moiety.">The mitochondrial ATP synthase of Trypanosoma brucei: isolation and characterization of the intact F1 moiety.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. 43 (1), 125-132 (1990).</li><li>Higa, A. I., Cazzulo, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mg2+-activated+adenosine+triphosphatase+from+Crithidia+fasciculata:+purification+and+inhibition+by+suramin+and+efrapeptin.">Mg2+-activated adenosine triphosphatase from Crithidia fasciculata: purification and inhibition by suramin and efrapeptin.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. 3 (6), 357-367 (1981).</li><li>Walker, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+structure+and+subunit+stoichiometry+of+F1-ATPase+from+bovine+mitochondria.">Primary structure and subunit stoichiometry of F1-ATPase from bovine mitochondria.</a> Journal of Molecular Biology. 184 (4), 677-701 (1985).</li><li>Mueller, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ni-chelate-affinity+purification+and+crystallization+of+the+yeast+mitochondrial+F1-ATPase.">Ni-chelate-affinity purification and crystallization of the yeast mitochondrial F1-ATPase.</a> Protein Expression and Purification. 37 (2), 479-485 (2004).</li><li>Gahura, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+F1-ATPase+from+Trypanosoma+brucei+is+elaborated+by+three+copies+of+an+additional+p18-subunit.">The F1-ATPase from Trypanosoma brucei is elaborated by three copies of an additional p18-subunit.</a> The FEBS Journal. 285 (3), 614-628 (2018).</li><li>Montgomery, M. G., Gahura, O., Leslie, A. G. W., Zikova, A., Walker, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATP+synthase+from+Trypanosoma+brucei+has+an+elaborated+canonical+F1-domain+and+conventional+catalytic+sites.">ATP synthase from Trypanosoma brucei has an elaborated canonical F1-domain and conventional catalytic sites.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (9), 2102-2107 (2018).</li><li>Schneider, A., Charriere, F., Pusnik, M., Horn, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+mitochondria+from+procyclic+Trypanosoma+brucei.">Isolation of mitochondria from procyclic Trypanosoma brucei.</a> Methods in Molecular Biology. 372, 67-80 (2007).</li><li>Smith, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+protein+using+bicinchoninic+acid.">Measurement of protein using bicinchoninic acid.</a> Analytical Biochemistry. 150 (1), 76-85 (1985).</li><li>Wirtz, E., Leal, S., Ochatt, C., Cross, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tightly+regulated+inducible+expression+system+for+conditional+gene+knock-outs+and+dominant-negative+genetics+in+Trypanosoma+brucei.">A tightly regulated inducible expression system for conditional gene knock-outs and dominant-negative genetics in Trypanosoma brucei.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. 99 (1), 89-101 (1999).</li><li>Speijer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+respiratory+chain+from+cultured+Crithidia+fasciculata.">Characterization of the respiratory chain from cultured Crithidia fasciculata.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. 85 (2), 171-186 (1997).</li><li>Nelson, R. E., Aphasizheva, I., Falick, A. M., Nebohacova, M., Simpson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+I-complex+in+Leishmania+tarentolae+is+an+uniquely-structured+F1-ATPase.">The I-complex in Leishmania tarentolae is an uniquely-structured F1-ATPase.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. 135 (2), 221-224 (2004).</li><li>Carbajo, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+the+N-terminal+domain+of+the+OSCP+subunit+of+bovine+F1Fo-ATP+synthase+interacts+with+the+N-terminal+region+of+an+alpha+subunit.">How the N-terminal domain of the OSCP subunit of bovine F1Fo-ATP synthase interacts with the N-terminal region of an alpha subunit.</a> Journal of Molecular Biology. 368 (2), 310-318 (2007).</li><li>Bowler, M. W., Montgomery, M. G., Leslie, A. G., Walker, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ground+state+structure+of+F1-ATPase+from+bovine+heart+mitochondria+at+1.9+&#197;+resolution.">Ground state structure of F1-ATPase from bovine heart mitochondria at 1.9 &#197; resolution.</a> The Journal of Biological Chemistry. 282 (19), 14238-14242 (2007).</li></ol>

הפרוטוקול עבור F1-ATPase טיהור מ ט brucei פותחה על בסיס שיטות שפורסמו קודם לכן עבור בידודו של F1-ATPase קומפלקסים של מינים אחרים,13,14. השיטה אינה דורשת כל שינוי גנטי (למשל, תיוג) ותשואות מתחם פעיל מלא עם כל subunits הנוכחי. צעד קריטי הוא שחרור הקלו כלורופ?...

Synthases F-type ATP הם מאוגד-ממברנה סיבוב קומפלקסים multiprotein רוברטסונית פרוטון זה זוג מעבר אנרגיה-transducing ממברנות של חיידקים, המיטוכונדריה מהכלורופלסט עם היווצרות של ATP. הפרטים מולקולרית של מנגנון סיבובי של סינתזת ATP ידועים בעיקר בשל לימודי המבנית של מטוהרים בקטריאליים ו מיטוכונדריאלי synthases ATP ושלהם subcomplexes1. F-type ATP סינתאז שמאורגנים moieties ממברנה-פנימי, חיצוני-ממברנה. החלק ממברנה-חיצוני, המכונה F1-ATPase, מכיל שלושה אתרים קטליטי, שבו מתרחשת זירחון של אדנוזין diphosphate (ADP) ATP או התגובה הפוכה. F1-ATPase יכול להשתחרר השפעול של moiety קרום-מהותי תוך שמירה על היכולת שלה hydrolyze, אבל לא לסנתז, ATP. המגזר מאוגד-ממברנה, שנקרא Fo, ומתווך רוברטסונית חלבון, אשר מניע את הסיבוב של החלק המרכזי של האנזים. F1 ו- Fo . סקטורים מחוברים באמצעות מרכזי והיקפי הגבעול.
הראשון מנסה לטהר את F1-ATPase ניצני שמרים, הלב שור המיטוכונדריה תאריך חזרה לשנות ה-60. פרוטוקולים אלה נעשה שימוש שחולצו המיטוכונדריה, אשר היו מובסים sonication, fractionated על ידי משקעים סולפט אמוניום או מה לעזאזל קרה, ואחריו כרומטוגרפיה אופציונלי step(s) וטיפול בחום2,3,4 5, ,6. הטיהור היה מאוד השתפר, פשוטה על ידי השימוש בכלורופורם, אשר משחרר בקלות את F1-ATPase מן קרום מיטוכונדריאלי שברים7. החילוץ כלורופורם שימש אז כדי לחלץ נ1- ATPases וממקורות שונים בעלי חיים, צמחים, חיידקי (למשל, עכברוש כבד8, תירס9, אראם maculatum10ו Escherichia coli 11). עוד טיהור של F שפורסמו כלורופורם1-ATPase מאת זיקה או גודל-הדרה כרומטוגרפיה (שניות) הניב חלבון טהור מאוד מורכבת, אשר היה מתאים מכשור לקביעת קשיות ומבנה ברזולוציה גבוהה על ידי קריסטלוגרפיה באמצעות קרני רנטגן, כמו שתיעד את המבנים של F1-ATPase מן הלב שור12,13 ו האפייה14. F1-ATPase מבנים נקבעו גם של אורגניזמים שקשה לטפח, לפיכך, כמות החומר הביולוגי הראשוני היה מוגבל. במקרה זה, ה-F1-ATPase subunits היו באופן מלאכותי הביע ומצורפים המתחם ב e. coliוטיהרו האנזים heterologous כל היה מאת זיקה כרומטוגרפיה דרך של יחידת משנה מתויגות. גישה כזו הובילו הקביעה של F1-ATPase מבני שני המינים חיידקי לרום, Geobacillus stearothermophilus15 , Caldalkalibacillus thermarum16, 17. עם זאת, מתודולוגיה זו הוא מעדיף מצוייה F האיקריוטים1- ATPases מאז זה מסתמך על מכשיר prokaryotic protheosynthetic, עיבוד posttranslational, מכלול מורכבים.
החילוץ מבוססי כלורופורם השתמשת קודם לכן כדי לבודד F1- ATPases Trypanosoma cruziפרזיטים חד־תאיות digenetic18 ו brucei ט19, חשוב פתוגנים בתרבית של גורם אמריקאי ו Trypanosomiases אפריקאי, בהתאמה, ומתוך monogenic חרק טפיל Crithidia fasciculata20. Purifications אלה הובילו רק תיאור פשוט של ה F-1- ATPases, מכיוון שאין יישומים במורד הזרם שימשו לאפיין באופן מלא את הרכב, מבנה ומאפייני אנזימטי של המתחם. מאמר זה מתאר שיטה ממוטב עבור F1-ATPase טיהור מהבמה מחזור חיי חרק בתרבית של brucei טי. השיטה מפותח בהתבסס על הפרוטוקולים הוקמה עבור בידוד של שור ושמרים F1- ATPases21,22. ההליך התשואות מאוד טהור, הומוגניות אנזים מתאים במבחנה אנזימטי או מעכבות מבחני, אפיון מפורט פרוטיאומיה מבנית באמצעות ספקטרומטר מסה23, קביעת מבנה24. פרוטוקול טיהור ואת הידע של F1-ATPase מבנה בשלב האטומי פותח אפשרות לעצב מסכים כדי לזהות מעכבי מולקולה קטנה, וסיוע בפיתוח של תרופות חדשות נגד trypanosomiases אפריקה. יתר על כן, הפרוטוקול ניתן להתאים לטהר F1-ATPase של אורגניזמים אחרים.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosin Diphosphate Disodium Salt (ADP)</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A0948</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amastatin Hydrochloride</td>
			<td>Glantham Life Sciences</td>
			<td>GA1330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aminocaproic Acid</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A2266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>ThermoFischer Scientific/Pierce</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzamidine Hydrochloride</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>199001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bestatin Hydrochloride</td>
			<td>Sigma Aldrich/Merck</td>
			<td>B8385</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete Tablets, Mini EDTA-free</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4693159001</td>
			<td>Protease inhibitor cocktail tablets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic Acid (EDTA)</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td></td>
			<td>For pH adjustment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ile-Pro-Ile</td>
			<td>Sigma Aldrich/Merck</td>
			<td>I9759</td>
			<td>Alias Diprotin A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leupeptin</td>
			<td>Sigma Aldrich/Merck</td>
			<td>L2884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate Heptahydrate</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pepstatin A</td>
			<td>Sigma Aldrich/Merck</td>
			<td>P5318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Electrophoresis System</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Consumables</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Tubes for SW60Ti, Polyallomer</td>
			<td>Beckman Coulture</td>
			<td>328874</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DounceTissues Homogenizer 2 mL</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Vacuum Filtration Device</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>516-7017</td>
			<td>Degasing solutions for liquid chromatography</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiTrap Q HP, 5 mL</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>17115401</td>
			<td>Anion exchange chromatography column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Regenaretad Cellulose Membrane Filters, pore size 0.45 &#956;m, diameter 47 mm</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>18406--47------N</td>
			<td>Degasing solutions for liquid chromatography</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superdex 200 Increase 10/300 GL</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>29091596</td>
			<td>Size-exclusion chromatography column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vivaspin 6 MWCO 100 kDa PES</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>VS0641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AKTA Pure 25</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>29018224</td>
			<td>Or similar FPLC system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer Shimadzu UV-1601</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td></td>
			<td>Or similar spectrophotometer with kinetic assay mode</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge Beckman Optima with SW60Ti Rotor</td>
			<td>Beckman Coulture</td>
			<td></td>
			<td>Or similar ultracentrifuge and rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic Homogenizer with Thin Probe, Model 3000</td>
			<td>BioLogics</td>
			<td>0-127-0001</td>
			<td>Or similar ultrasonic homogenizer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of f1-atpase from the parasitic protist trypanosoma brucei

F1-ATPase הוא subcomplex קטליטי ממברנה-חיצוני של F-type ATP סינתאז, אנזים העושה את הכוח המניע של פרוטון מעבר ממברנות ביולוגיות לייצר אדנוזין טריפוספט (ATP). בידודו של ה-F שלם1-ATPase ממקור מקורי שלו הוא תנאי חיוני לאפיון של האנזים חלבון קומפוזיציה קינטית פרמטרים, רגישות מעכבי. מאוד טהור, הומוגניות F1-ATPase יכול לשמש ללימודים מבניים, אשר מספקים תובנה המנגנונים המולקולריים של סינתזת ATP, הידרוליזה. מאמר זה מתאר הליך של הטיהור של F1-ATPase מן Trypanosoma brucei, סוכן סיבתי של אפריקה trypanosomiases. ה F1-ATPase מנותקת שלפוחית מיטוכונדריאלי, אשר מתקבלים על ידי פירוק היפוטוניק של trypanosomes במבחנה תרבותי. השלפוחיות המוגלתיות הן מכנית מפוצל על ידי sonication ו ה נ1-ATPase הוא שוחרר מן קרום מיטוכונדריאלי הפנימי על ידי החילוץ כלורופורם. המתחם אנזימטי מטוהר עוד יותר על ידי exchange אניון רצופים ו כרומטוגרפיה גודל-הדרה. ספקטרומטר מסה רגיש טכניקות הראה כי המתחם מטוהרים נטול מזהמים כמעט כל חלבון, לכן, מייצג חומר מתאים לקביעת מבנה על ידי קריסטלוגרפיה באמצעות קרני רנטגן או הקפאה-מיקרוסקופ. ה-F מבודד1-ATPase תערוכות פעילות hydrolytic ATP, אשר יכול להיות מעוכבים באופן מלא על ידי אזיד הנתרן, מעכב חזק של F-type ATP synthases. המתחם מטוהרים נשאר יציב ופעיל לפחות שלושה ימים בטמפרטורת החדר. משקעים על ידי אמוניום סולפט משמש לאחסון לטווח ארוך. נהלים דומים שימשו לטיהור של F1- ATPases רקמות מידע יונקים, שמרים או חיידקים. כך, הפרוטוקול שהוצגו יכול לשמש קו מנחה עבור ה F1-ATPase בידוד של אורגניזמים אחרים.

הוא לטיהור טיפוסי (איור 1) מתחיל עם שלפוחית מיטוכונדריאלי (mitoplasts) מבודד על המילוי ההדרגתי Percoll מ hypotonically lysed עונה 1 פרק 1011 כדי עונה 2 פרק 1011 procyclic ט brucei תאים25 תרבותי בתקן גלוקוז-עשיר SDM-79 בינוני27. Mitoplasts יש מפוצלים מאת son...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of F1-ATPase from the Parasitic Protist Trypanosoma brucei at JoVE.com

Isolation of F1-ATPase from the Parasitic Protist Trypanosoma brucei

פרוטוקול זה מתאר את הטיהור של F1-ATPase משלב חרקים בתרבית של Trypanosoma brucei. ההליך מניב מורכב מאוד טהור, הומוגנית, פעיל מתאימים ללימודי אנזימטי מבניים.

בידוד F1-ATPase מ פרוטיסטים טפילי Trypanosoma brucei

F1-ATPase is a membrane-extrinsic catalytic subcomplex of F-type ATP synthase, an enzyme that uses the proton motive force across biological membranes to ...

הטיהור של F1-ATPase מבוסס על שיטות ביוכימיות קלאסיות אשר הוכיח להיות חיוני להבנתנו את המנגנון של ייצור ATP על ידי סינתאזות ATP אחרות. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מייצרת אנזים טהור מאוד מתאים לקביעת מבנה על ידי קריסטלוגרפיה רנטגן או מיקרוסקופ קריו-אלקטרונים. למרות פרוטוקול זה מותאם לבידוד של F1-ATPase מ trypanosomes, זה יכול להיות מותאם למקורות אחרים, כגון רקמות או תאי תרבות, ו פרוטיסטים פתוגניים שונים.טכניקה זו עלולה להוביל לזיהוי תרופות חדשות לטיפול במחלות אנושיות קשות. לדוגמה, שחפת Mycobacterium F-ATPase היא יעד תרופה מאומתת לטיפול בשחפת. כדי להתחיל את הפרוטוקול, להפשיר בעדינות resicles המיטוכונדריה, הידוע גם בשם mitoplasts, מבודד בעבר על ידי תזה היפוטונית מ 1 פעמים 10 כדי 11 עד פעמיים 10 כדי 11 תאים של טריפנוסומה ברוסי פרוצליקלית בחמישה מיליליטר של חיץ קר כקרח A.Keep את המצונן.לאחר מכן, לקבוע את ריכוז החלבון בהשעיה על ידי חומצה ביצינצ'ונית, או BCA, מרשם חלבון על פי הוראות היצרן. בצע סדרת דילול BSA במים טהורים במיוחד כדי לבנות את העקומה הסטנדרטית. לדלל כמות קטנה של המדגם 20 עד 100 פעמים עם מים טהורים במיוחד כדי להתאים לטווח של תקני BSA.לאחר חישוב כמות החלבון הכוללת המדגם, להביא את ריכוז החלבון ל 16 מיליגרם למיליליטר על ידי דילול אותו עם חיץ נוסף A.Then לפצל את mitoplasts לתוך וטרינרים הפוכים חתיכות קרום על ידי sonication שבע פעמים במשך 15 שניות כל אחד, עם אנרגיה כוללת של 70 עד 100 joules לכל דחף עם microtip עם קוטר של 3.9 מילימטרים. תוך כדי פיצול, הדגירה את המדגם על קרח במשך 30 שניות בין דחפים. לאחר sonication, ההשעיה עשויה להיראות מעט כהה יותר.מכך את שברי הממברנה על ידי אולטרה מרכז ב 54, 000 גרם במשך 16 שעות או ב 98, 000 גרם במשך חמש שעות בארבע מעלות צלזיוס. תדקן את העל-טבעי ותמשיך בחילוץ הכלורופורם. חשב את אמצעי האחסון של מאגר ב' בהתבסס על הכמות הכוללת של מאגר א' בשימוש.מעבירים את המעים הקפואים מצינור הצנטריפוגה לתוך ההומוגנר. תן מחדש את גלולת הממברנות המיטוכונדריות במאגר B בעזרת הומוגניזר קטן של Dounce. העבר את ההשעיה לצינור חרוט 50 מיליליטר.הסר את הדגימה מקרח, ושמור את הדגימה ואת כל הפתרונות בטמפרטורת החדר עבור השלבים הנותרים. לאחר מכן הוסיפו כלורופורם רווי בשתי טריסות טוחנות המותאמות ל-HCl ל-pH 8.5, אחת לאחת. סגרו את המכסה בחוזקה, ונערו את הדגימה במרץ למשך 20 שניות בדיוק.מיד צנטריפוגה את התערובת ב 8, 400 גרם במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, להעביר את השלב העליון, מעונן מים ל 1.6 microtubes מיליליטר. הוסף מעכבי פרוטאז לדגימה כדי להחליף את המעכבים שהוסרו על ידי הטיפול chloroform.צנטריפוגה הדגימות ב 13, 000 גרם במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר הספין, מעבירים את העל-טבעי למיקרו-צינורות טריים, וחוזרים על הצנטריפוגה כדי להסיר כל חומר בלתי מסיס שנותר. לצייד את עמודת Q חילופי אניון חמישה מיליליטר מחובר למערכת כרומטוגרפיה נוזלית חלבון מהיר עם 50 מיליליטר של חיץ עמוד Q בקצב זרימה של חמישה מיליליטר לדקה עד הספיגה ב 280 ננומטר ואת המוליכות לייצב.טען את העל-טבעי בעמודה שנציידת בקצב זרימה של מיליליטר לדקה. המתן עד שהספיגה ב-280 ננומטר תתייצב ברקע. החל הדרגתי ליניארי של 25 מיליליטר של מאגר האלוטיון של עמודת Q מ- 0%-100% בקצב זרימה של 0.5 מיליליטר לדקה ואוסף שברים בודדים יותר.Assay 10 microliters של כל שבר בודד המתאים לשיא האלוציון העיקרי עבור פעילות הידרוליטית ATP לכל על מיליליטר של תערובת תגובה על ידי פולמן ATPase בדיקה ב pH 8.0. בריכת השברים המציגים פעילות ATPase. רכז את הדגימה המרוכזת על ידי סינון אולטרה-סינון של קרום באמצעות עמודת ספין עם מסנן PES של 100,000 ניתוק משקל מולקולרי ל- 200 עד 500 מיקרוליטר.לאחר מכן המשך כרומטוגרפיה אי-הכללה גודל. לצייד את עמודת Superose 6 הגדל המחוברת למערכת כרומטוגרפיה נוזלית עם לפחות 48 מיליליטר של מאגר SEC בקצב זרימה של 0.5 מיליליטר לדקה. החל את הדוגמה על העמודה.הפעל את הכרומטוגרפיה בקצב זרימה של 0.25 מיליליטר לדקה, תוך איסוף שברים של 0.25 מיליליטר. לאחר מכן, הפעל 10 microliters של שברים התואמים את הפסגות של עקבות ספיגת UV 280 ננומטר על SDS-PAGE. ואז להכתים את הדגימות עם כחול קומאסי.תזהו את השברים המתאימים לשיא הגדול הראשון המכיל את פסגת ה-F1 לפעילות ההידרוליטית של ATP ורגישות אזיד על ידי המחתחת פולמן ATPase. לאחר מכן לבצע בדיקה BCA כדי לקבוע את ריכוז החלבון. לבסוף, לשמור על F1-ATPase מטוהר בטמפרטורת החדר, ולהשתמש בו בתוך שלושה ימים לאחר טיהור עבור יישומים במורד הזרם.פרופיל אלוציה זה של כרומטוגרפיה חילופי אניון מציג את ספיגת UV ב 280 ננומטר וריכוז של נתרן כלורי במאגר אלוטיון. השברים שנבחרו הופרדו בג'ל SDS-PAGE והוכתמו בצבע כחול קומאסי. השברים התואמים את פסגת האלוטיון העיקרית מתוך כרומטוגרפיה של חילופי אניון המכילים את ה- F1-ATPase אורגנו, התרכזו והשתמשו בהם כקלט עבור כרומטוגרפיה של אי-הכללת גודל.מזהם העיקרי הוא דיהידרוליפויל דהידרוגנאז, אשר חמק מעמוד כרומטוגרפיה אי הכללת גודל כשיא דיסקרטי. ה-F1-ATPase גוועת בשיא הדומיננטי הראשון, במידה רבה סימטרי. הכתם הכחול קומאסי של תבנית רצועה טיפוסית לאחר ההפרדה של F1-ATPase מטוהרים באמצעות SDS-PAGE מראה להקות חלשות ספורדיות גלוי מעל יחידת המשנה בטא, המייצגים subcomplexes של אלפא שלוש בטא שלוש כיסוי ראש, דימרים ואוליגומרים של אלפא ו בטא subunits, והם נטולי כל מזהמים לגילוי על ידי ספקטרומטריית מסה.בעת ביצוע מיצוי כלורופורם, השלב הקריטי של הפרוטוקול, חיוני לנער את המדגם במרץ ולהמשיך להפרדה הצנטריפוגלית של השלבים האורגניים והמים באופן מיידי. בעקבות הליך זה, F1-ATPase מבודד יכול להיות מאופיין בפירוט על ידי ספקטרומטריית מסה. כמו כן, ניתן להשתמש בו בבדיקות פעילות או למחקרים מבניים, בכוחות עצמו או בנוכחות מעכבים שונים או אנלוגים מצע.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biochemistry

Isolation of F1-ATPase from the Parasitic Protist Trypanosoma brucei

Unit 1

Membrane Transport and Active Transporters

SCIENTISTS IN ACTION

Isolation of Cognate RNA-protein Complexes from Cells Using Oligonucleotide-directed Elution

בידוד של קומפלקסים RNA חלבון מאותו מקור מתאי שימוש Elution oligonucleotide מכוונת

Ribonucleoprotein particles direct the biogenesis and post-transcriptional regulation of all mRNAs through distinct combinations of RNA binding proteins. ...

An Efficient Method for the Isolation of Highly Purified RNA from Seeds for Use in Quantitative Transcriptome Analysis

שיטה יעילה עבור הבידוד של רנ&quot;א מאוד מטוהר מזרעים לשימוש ב כמוני transcriptome ניתוח

Plant seeds accumulate large amounts of storage reserves comprising biodegradable organic matter. Humans rely on seed storage reserves for food and as ...

Tandem Affinity Purification of Protein Complexes from Eukaryotic Cells

טיהור טנדם זיקה של קומפלקסי חלבונים מתאים איקריוטיים

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo ...

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

בידוד, מדידות הנשימה של המיטוכונדריה מ תודרנית לבנה

Mitochondria are essential organelles involved in numerous metabolic pathways in plants, most notably the production of adenosine triphosphate (ATP) from ...

Protein Digestion, Ultrafiltration, and Size Exclusion Chromatography to Optimize the Isolation of Exosomes from Human Blood Plasma and Serum

עיכול חלבון אולטראפילטרציה, גודל אי-הכללה של כרומטוגרפיה כדי למטב את ניתוקה של Exosomes פלזמה דם אנושי, סרום

Exosomes, a type of nanovesicle released from all cell types, can be isolated from any bodily fluid. The contents of exosomes, including proteins and ...

Rapid Isolation of the Mitoribosome from HEK Cells

בידוד מהיר של Mitoribosome מתאי HEK

The human mitochondria possess a dedicated set of ribosomes (mitoribosomes) that translate 13 essential protein components of the oxidative ...

Isolation of Tissue Extracellular Vesicles from the Liver

בידוד של מסחטות ושלפוחיות רקמה מהכבד

Extracellular vesicles (EVs) can be released from many different cell types and detected in most, if not all, body fluids. EVs can participate in ...

Isolation of Lipoprotein Particles from Chicken Egg Yolk for the Study of Bacterial Pathogen Fatty Acid Incorporation into Membrane Phospholipids

בידוד של חלקיקי ליפופרוטאין מעוף חלמון ביצה לחקר הפתוגן חומצות שומן בקטריאלי התאגדות לתוך ממברנה פוספוליפידים

Staphylococcus aureus and other Gram-positive pathogens incorporate fatty acids from the environment into membrane phospholipids. During infection, the ...

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

Translating Ribosome Affinity Purification TRAP for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

תרגום הריבוכמה אהדה לטיהור (מלכודת) לבידוד רנ א מתאי האנדותל בvivo

Many studies have been limited to using in vitro cellular assays and whole tissues or isolating of specific cell types from animals for in vitro analysis ...

Ready-To-Use qPCR for Detection of DNA from Trypanosoma cruzi or Other Pathogenic Organisms

Ready-To-Use qPCR for Detection of DNA from Trypanosoma cruzi or Other Pathogenic Organisms

qPCR מוכן לשימוש לזיהוי דנ"א מטריפנוזומה קרוזי או אורגניזמים פתוגניים אחרים

Real-time PCR (qPCR) is a remarkably sensitive and precise technique&#160;that allows for amplifying&#160;minute amounts of nucleic acid targets from a ...