Name: isolation of f1-atpase from the parasitic protist trypanosoma brucei
Uploaded: 2019-01-22T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of F1-ATPase from the Parasitic Protist Trypanosoma brucei at JoVE.com

Questo lavoro è stato finanziato dal Ministero di educazione ERC CZ concedere LL1205, la concessione di Grant Agency di Repubblica Ceca 18-17529S e dal FESR/FSE progetto centro per la ricerca di patogenicità e virulenza dei parassiti (No. CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_019/0000759).

1. tamponi e soluzioni
<ol><li>Preparare le soluzioni elencate di seguito. Degassare tutti i buffer per cromatografia liquida. Aggiungere gli inibitori di proteasi, benzamidine e ADP appena prima dell'uso.<ol>
<li>Preparare il tampone di buffer a: 50 mM Tris con acido cloridrico (Tris-HCl) pH 8.0, saccarosio 0,25 M, 5 mM benzamidine, 5mm aminocaproico acido (ACA) e proteasi inibitori (10 amastatin µM, 50 µM Bestatina, 50 µM pepstatina, 50 µM leupeptina e 50 µM diprotin A).</li>
		<li>Preparare di tampone b: 50 mM ...

<ol>
	<li>Walker, J. E., Wikstr&#246;m, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure,+mechanism+and+regulation+of+ATP+synthases.">Structure, mechanism and regulation of ATP synthases.</a> Mechanisms of Primary Energy Transduction in Biology. , 338-373 (2017).</li><li>Pullman, M. E., Penefsky, H. S., Datta, A., Racker, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partial+resolution+of+the+enzymes+catalyzing+oxidative+phosphorylation.+I.+Purification+and+properties+of+soluble+dinitrophenol-stimulated+adenosine+triphosphatase.">Partial resolution of the enzymes catalyzing oxidative phosphorylation. I. Purification and properties of soluble dinitrophenol-stimulated adenosine triphosphatase.</a> The Journal of Biological Chemistry. 235, 3322-3329 (1960).</li><li>Schatz, G., Penefsky, H. S., Racker, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partial+resolution+of+the+enzymes+catalyzing+oxidative+phosphorylation.">Partial resolution of the enzymes catalyzing oxidative phosphorylation.</a> XIV. The Journal of Biological Chemistry. 242 (10), 2552-2560 (1967).</li><li>Racker, E., Horstman, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partial+resolution+of+the+enzymes+catalyzing+oxidative+phosphorylation.+13.+Structure+and+function+of+submitochondrial+particles+completely+resolved+with+respect+to+coupling+factor.">Partial resolution of the enzymes catalyzing oxidative phosphorylation. 13. Structure and function of submitochondrial particles completely resolved with respect to coupling factor.</a> The Journal of Biological Chemistry. 242 (10), 2547-2551 (1967).</li><li>Senior, A. E., Brooks, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+the+mitochondrial+oligomycin-insensitive+ATPase.+I.+An+improved+method+of+purification+and+the+behavior+of+the+enzyme+in+solutions+of+various+depolymerizing+agents.">Studies on the mitochondrial oligomycin-insensitive ATPase. I. An improved method of purification and the behavior of the enzyme in solutions of various depolymerizing agents.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 140 (1), 257-266 (1970).</li><li>Tzagoloff, A., Meagher, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+the+mitochondrial+membrane+system.+V.+Properties+of+a+dispersed+preparation+of+the+rutamycin-sensitive+adenosine+triphosphatase+of+yeast+mitochondria.">Assembly of the mitochondrial membrane system. V. Properties of a dispersed preparation of the rutamycin-sensitive adenosine triphosphatase of yeast mitochondria.</a> The Journal of Biological Chemistry. 246 (23), 7328-7336 (1971).</li><li>Beechey, R. B., Hubbard, S. A., Linnett, P. E., Mitchell, A. D., Munn, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+rapid+method+for+the+preparation+of+adenosine+triphosphatase+from+submitochondrial+particles.">A simple and rapid method for the preparation of adenosine triphosphatase from submitochondrial particles.</a> Biochemical Journal. 148 (3), 533-537 (1975).</li><li>Tyler, D. D., Webb, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+properties+of+the+adenosine+triphosphatase+released+from+the+liver+mitochondrial+membrane+by+chloroform.">Purification and properties of the adenosine triphosphatase released from the liver mitochondrial membrane by chloroform.</a> Biochemical Journal. 178 (2), 289-297 (1979).</li><li>Hack, E., Leaver, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+alpha-subunit+of+the+maize+F1-ATPase+is+synthesised+in+the+mitochondrion.">The alpha-subunit of the maize F1-ATPase is synthesised in the mitochondrion.</a> The EMBO Journal. 2 (10), 1783-1789 (1983).</li><li>Dunn, P. P., Slabas, A. R., Moore, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+F1-ATPase+from+cuckoo-pint+(Arum+maculatum)+mitochondria.+A+comparison+of+subunit+composition+with+that+of+rat+liver+F1-ATPase.">Purification of F1-ATPase from cuckoo-pint (Arum maculatum) mitochondria. A comparison of subunit composition with that of rat liver F1-ATPase.</a> Biochemical Journal. 225 (3), 821-824 (1985).</li><li>Satre, M., Bof, M., Vignais, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+Escherichia+coli+adenosine+triphosphatase+with+aurovertin+and+citreoviridin:+inhibition+and+fluorescence+studies.">Interaction of Escherichia coli adenosine triphosphatase with aurovertin and citreoviridin: inhibition and fluorescence studies.</a> Journal of Bacteriology. 142 (3), 768-776 (1980).</li><li>Abrahams, J. P., Leslie, A. G., Lutter, R., Walker, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+at+2.8+&#197;+resolution+of+F1ATPase+from+bovine+heart+mitochondria.">Structure at 2.8 &#197; resolution of F1ATPase from bovine heart mitochondria.</a> Nature. 370 (6491), 621-628 (1994).</li><li>Lutter, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallization+of+F1-ATPase+from+bovine+heart+mitochondria.">Crystallization of F1-ATPase from bovine heart mitochondria.</a> Journal of Molecular Biology. 229 (3), 787-790 (1993).</li><li>Kabaleeswaran, V., Puri, N., Walker, J. E., Leslie, A. G., Mueller, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+features+of+the+rotary+catalytic+mechanism+revealed+in+the+structure+of+yeast+F1-ATPase.">Novel features of the rotary catalytic mechanism revealed in the structure of yeast F1-ATPase.</a> The EMBO Journal. 25 (22), 5433-5442 (2006).</li><li>Shirakihara, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+a+thermophilic+F1-ATPase+inhibited+by+an+epsilon-subunit:+deeper+insight+into+the+epsilon-inhibition+mechanism.">Structure of a thermophilic F1-ATPase inhibited by an epsilon-subunit: deeper insight into the epsilon-inhibition mechanism.</a> The FEBS Journal. 282 (15), 2895-2913 (2015).</li><li>Stocker, A., Keis, S., Cook, G. M., Dimroth, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification,+crystallization,+and+properties+of+F1-ATPase+complexes+from+the+thermoalkaliphilic+Bacillus+sp.+strain+TA2.A1.">Purification, crystallization, and properties of F1-ATPase complexes from the thermoalkaliphilic Bacillus sp. strain TA2.A1.</a> Journal of Structural Biology. 152 (2), 140-145 (2005).</li><li>Ferguson, S. A., Cook, G. M., Montgomery, M. G., Leslie, A. G., Walker, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+thermoalkaliphilic+F1-ATPase+from+Caldalkalibacillus+thermarum.">Regulation of the thermoalkaliphilic F1-ATPase from Caldalkalibacillus thermarum.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (39), 10860-10865 (2016).</li><li>Cataldi de Flombaum, M. A., Frasch, A. C. C., Stoppani, A. O. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenosine+triphosphatase+from+Trypanosoma+cruzi:+purification+and+properties.">Adenosine triphosphatase from Trypanosoma cruzi: purification and properties.</a> Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Comparative Biochemistry. 65 (1), 103-109 (1980).</li><li>Williams, N., Frank, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrial+ATP+synthase+of+Trypanosoma+brucei:+isolation+and+characterization+of+the+intact+F1+moiety.">The mitochondrial ATP synthase of Trypanosoma brucei: isolation and characterization of the intact F1 moiety.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. 43 (1), 125-132 (1990).</li><li>Higa, A. I., Cazzulo, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mg2+-activated+adenosine+triphosphatase+from+Crithidia+fasciculata:+purification+and+inhibition+by+suramin+and+efrapeptin.">Mg2+-activated adenosine triphosphatase from Crithidia fasciculata: purification and inhibition by suramin and efrapeptin.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. 3 (6), 357-367 (1981).</li><li>Walker, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+structure+and+subunit+stoichiometry+of+F1-ATPase+from+bovine+mitochondria.">Primary structure and subunit stoichiometry of F1-ATPase from bovine mitochondria.</a> Journal of Molecular Biology. 184 (4), 677-701 (1985).</li><li>Mueller, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ni-chelate-affinity+purification+and+crystallization+of+the+yeast+mitochondrial+F1-ATPase.">Ni-chelate-affinity purification and crystallization of the yeast mitochondrial F1-ATPase.</a> Protein Expression and Purification. 37 (2), 479-485 (2004).</li><li>Gahura, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+F1-ATPase+from+Trypanosoma+brucei+is+elaborated+by+three+copies+of+an+additional+p18-subunit.">The F1-ATPase from Trypanosoma brucei is elaborated by three copies of an additional p18-subunit.</a> The FEBS Journal. 285 (3), 614-628 (2018).</li><li>Montgomery, M. G., Gahura, O., Leslie, A. G. W., Zikova, A., Walker, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATP+synthase+from+Trypanosoma+brucei+has+an+elaborated+canonical+F1-domain+and+conventional+catalytic+sites.">ATP synthase from Trypanosoma brucei has an elaborated canonical F1-domain and conventional catalytic sites.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (9), 2102-2107 (2018).</li><li>Schneider, A., Charriere, F., Pusnik, M., Horn, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+mitochondria+from+procyclic+Trypanosoma+brucei.">Isolation of mitochondria from procyclic Trypanosoma brucei.</a> Methods in Molecular Biology. 372, 67-80 (2007).</li><li>Smith, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+protein+using+bicinchoninic+acid.">Measurement of protein using bicinchoninic acid.</a> Analytical Biochemistry. 150 (1), 76-85 (1985).</li><li>Wirtz, E., Leal, S., Ochatt, C., Cross, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tightly+regulated+inducible+expression+system+for+conditional+gene+knock-outs+and+dominant-negative+genetics+in+Trypanosoma+brucei.">A tightly regulated inducible expression system for conditional gene knock-outs and dominant-negative genetics in Trypanosoma brucei.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. 99 (1), 89-101 (1999).</li><li>Speijer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+respiratory+chain+from+cultured+Crithidia+fasciculata.">Characterization of the respiratory chain from cultured Crithidia fasciculata.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. 85 (2), 171-186 (1997).</li><li>Nelson, R. E., Aphasizheva, I., Falick, A. M., Nebohacova, M., Simpson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+I-complex+in+Leishmania+tarentolae+is+an+uniquely-structured+F1-ATPase.">The I-complex in Leishmania tarentolae is an uniquely-structured F1-ATPase.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. 135 (2), 221-224 (2004).</li><li>Carbajo, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+the+N-terminal+domain+of+the+OSCP+subunit+of+bovine+F1Fo-ATP+synthase+interacts+with+the+N-terminal+region+of+an+alpha+subunit.">How the N-terminal domain of the OSCP subunit of bovine F1Fo-ATP synthase interacts with the N-terminal region of an alpha subunit.</a> Journal of Molecular Biology. 368 (2), 310-318 (2007).</li><li>Bowler, M. W., Montgomery, M. G., Leslie, A. G., Walker, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ground+state+structure+of+F1-ATPase+from+bovine+heart+mitochondria+at+1.9+&#197;+resolution.">Ground state structure of F1-ATPase from bovine heart mitochondria at 1.9 &#197; resolution.</a> The Journal of Biological Chemistry. 282 (19), 14238-14242 (2007).</li></ol>

Il protocollo per F1-purificazione dell'atpasi da T. brucei è stato sviluppato precedentemente pubblicati basata su metodi per l'isolamento di F1-complessi di atpasi da altre specie13,14. Il metodo non richiede alcuna modificazione genetica (ad es., tagging) e produce un complesso completamente attivo con tutte le subunità presenti. Il punto cruciale è il rilascio di cloroformio-facilitato di F1-ATPasi dalla p...

I tipo F ATP sintasi sono membrana-limitano rotanti complessi multiproteici tale traslocazione del protone di coppia attraverso le membrane trasduzione di energia dei batteri, i mitocondri e cloroplasti con la formazione di ATP. Dettagli molecolari del meccanismo di rotazione di sintesi di ATP sono noti principalmente a causa di studi strutturali di purificato batterica e mitocondriale ATP sintasi e loro subcomplexes1. F-tipo trifosfato di adenosina synthase è organizzato in membrana-intrinseche ed estrinseche-membrana moiety. Parte della membrana-estrinseco, nota come F1-atpasi, contiene tre siti catalitici, dove si verifica la fosforilazione dell'adenosina difosfato (ADP) di ATP o la reazione inversa. F1-ATPasi possono essere rilasciato sperimentalmente da parte dell'intrinseca di membrana pur mantenendo la sua capacità di idrolizzare, ma non sintetizzare, ATP. Il settore di membrana-limita, chiamato Fo, media la traslocazione di proteine, che aziona la rotazione della parte centrale dell'enzima. La F1 e Fo settori sono collegati da steli centrali e periferici.
I primi tentativi di purificare la F1-atpasi da lievito e cuore bovino mitocondri data indietro al 1960. Questi protocolli utilizzati estratti di mitocondri, che sono stati interrotti di sonicazione, frazionato da precipitazione del solfato dell'ammonio o protamina, seguita da cromatografia opzionale passo (s) e trattamento termico2,3,4 ,5,6. La purificazione è stato notevolmente migliorata e semplificata mediante l'uso di cloroformio, che prontamente rilascia la F1-ATPasi dalla membrana mitocondriale frammenti7. L'estrazione di cloroformio è stato poi utilizzato per estrarre F1- atpasi da vari animali, vegetali e fonti batteriche (ad es., del fegato del ratto8, mais9, Arum maculatum10e Escherichia coli 11). Ulteriore purificazione del cloroformio-rilasciato F1-ATPasi mediante cromatografia di affinità o di esclusione (SEC) ha reso una proteina altamente pura complessa, che era adatta per la determinazione della struttura ad alta risoluzione di cristallografia a raggi x, come documentato dalle strutture di F1-atpasi da cuore bovino12,13 e14di Saccharomyces cerevisiae. F1-strutture dell'atpasi inoltre sono stati determinati da organismi che sono difficili da coltivare e, quindi, la quantità di materiale biologico iniziale era limitata. In questo caso, la F1-subunità ATPasi sono stati artificialmente espresso e assemblate per formare il complesso dentro e. colie l'enzima intero eterologa è stato purificato mediante cromatografia affinità tramite una subunità taggata. Tale approccio ha portato alla determinazione di F1-strutture di atpasi da due specie di batteri termofile, Geobacillus stearothermophilus15 e thermarum Caldalkalibacillus16, 17. Tuttavia, questa metodologia è piuttosto inadatta per eucariotica F1- ATPasi dato che si basa sull'apparato protheosynthetic procariote, elaborazione post-traduzionale e assiemi complessi.
L'estrazione basata su cloroformio utilizzato in precedenza per isolare F1- atpasi da unicellulari digenetic parassiti Trypanosoma cruzi18 e T. brucei19, importanti patogeni mammiferi causando americano e Trypanosomiases africano, rispettivamente e da malattie monogenica insetto parassita Crithidia fasciculata20. Queste purificazioni ha condotto soltanto a una semplice descrizione del F1- atpasi, poiché nessuna applicazione a valle sono stata usata per caratterizzare la composizione, struttura e proprietà enzimatiche del complesso. Questo articolo viene descritto un metodo ottimizzato per F1-purificazione dell'atpasi dalla fase del ciclo di vita dell'insetto colta di T. brucei. Il metodo è sviluppato basato su protocolli stabiliti per l'isolamento di bovini e lievito F1- ATPasi21,22. La procedura produce altamente puro e omogeneo enzima adatto in vitro enzimatico e inibitorio saggi, proteomica dettagliata caratterizzazione mediante spettrometria di massa23e struttura determinazione24. Il protocollo di purificazione e la conoscenza del F1-ATPasi struttura a livello atomico si apre la possibilità di progettare le schermate per identificare piccole molecole inibitori e facilitare lo sviluppo di nuovi farmaci contro trypanosomiases africano. Inoltre, il protocollo può essere adattato per purificare F1-atpasi da altri organismi.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosin Diphosphate Disodium Salt (ADP)</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A0948</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amastatin Hydrochloride</td>
			<td>Glantham Life Sciences</td>
			<td>GA1330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aminocaproic Acid</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A2266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>ThermoFischer Scientific/Pierce</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzamidine Hydrochloride</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>199001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bestatin Hydrochloride</td>
			<td>Sigma Aldrich/Merck</td>
			<td>B8385</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete Tablets, Mini EDTA-free</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4693159001</td>
			<td>Protease inhibitor cocktail tablets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic Acid (EDTA)</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td></td>
			<td>For pH adjustment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ile-Pro-Ile</td>
			<td>Sigma Aldrich/Merck</td>
			<td>I9759</td>
			<td>Alias Diprotin A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leupeptin</td>
			<td>Sigma Aldrich/Merck</td>
			<td>L2884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate Heptahydrate</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pepstatin A</td>
			<td>Sigma Aldrich/Merck</td>
			<td>P5318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Electrophoresis System</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Consumables</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Tubes for SW60Ti, Polyallomer</td>
			<td>Beckman Coulture</td>
			<td>328874</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DounceTissues Homogenizer 2 mL</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Vacuum Filtration Device</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>516-7017</td>
			<td>Degasing solutions for liquid chromatography</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiTrap Q HP, 5 mL</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>17115401</td>
			<td>Anion exchange chromatography column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Regenaretad Cellulose Membrane Filters, pore size 0.45 &#956;m, diameter 47 mm</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>18406--47------N</td>
			<td>Degasing solutions for liquid chromatography</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superdex 200 Increase 10/300 GL</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>29091596</td>
			<td>Size-exclusion chromatography column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vivaspin 6 MWCO 100 kDa PES</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>VS0641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AKTA Pure 25</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>29018224</td>
			<td>Or similar FPLC system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer Shimadzu UV-1601</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td></td>
			<td>Or similar spectrophotometer with kinetic assay mode</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge Beckman Optima with SW60Ti Rotor</td>
			<td>Beckman Coulture</td>
			<td></td>
			<td>Or similar ultracentrifuge and rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic Homogenizer with Thin Probe, Model 3000</td>
			<td>BioLogics</td>
			<td>0-127-0001</td>
			<td>Or similar ultrasonic homogenizer</td>
		</tr>
	</tbody>
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isolation of f1-atpase from the parasitic protist trypanosoma brucei

F1-atpasi è una membrana-estrinseca ossidrilasico catalitica del F-tipo ATP sintasi, un enzima che utilizza la forza motrice protonica attraverso le membrane biologiche per la produzione di adenosina trifosfato (ATP). L'isolamento del intatta F1-ATPasi dalla sorgente nativo è un prerequisito essenziale per caratterizzare la composizione proteica, parametri cinetici e sensibilità agli inibitori dell'enzima. Un altamente puro e omogeneo F1-ATPasi possono essere utilizzato per studi strutturali, che forniscono la comprensione nei meccanismi molecolari di sintesi di ATP e idrolisi. In questo articolo viene descritta una procedura per la purificazione del F1-ATPase dal Trypanosoma brucei, l'agente causativo di trypanosomiases africano. F1-atpasi è isolato dalle vescicole mitocondriale, che sono ottenute da Lisi ipotonica da in vitro coltivate trypanosomes. Le vescicole sono frammentate meccanicamente di sonicazione e la F1-ATPasi viene rilasciato dalla membrana mitocondriale interna mediante l'estrazione di cloroformio. Il complesso enzimatico viene ulteriormente purificato di scambio anionico consecutivi e la cromatografia di esclusione dimensionale. Tecniche di spettrometria di massa sensibile ha mostrato che il complesso purificato è privo di contaminanti virtualmente qualsiasi proteina e, pertanto, rappresenta il materiale adatto per la determinazione della struttura di cristallografia a raggi x o cryo-microscopia elettronica. L'isolato F1-ATPasi esibisce attività idrolitica di ATP, che può essere inibito completamente da sodio azide, un potente inibitore delle F-tipo ATP sintasi. Il complesso purificato rimane stabile e attiva per almeno tre giorni a temperatura ambiente. Precipitazione con solfato di ammonio è usato per immagazzinaggio a lungo termine. Procedure simili sono state usate per la purificazione di F1- atpasi da tessuti di mammiferi e vegetali, lieviti o batteri. Così, il protocollo presentato può servire come guida per la F1-isolamento dell'atpasi da altri organismi.

Una purificazione tipica (Figura 1) inizia con vescicole mitocondriale (mitoplasts) isolate sul gradiente di Percoll dal lisato hypotonically 1 x 1011 a 2 x 1011 prociclico di cellule di T. brucei 25 coltivate nello standard glucosio-ricco SDM-79 media27. I mitoplasts sono frammentati di sonicazione, filata, e il supernatante contenente matrice viene scartato. Le membrane mitocondr...

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Isolation of F1-ATPase from the Parasitic Protist Trypanosoma brucei

Questo protocollo descrive la purificazione di F1-ATPase dal palco dell'insetto colta di Trypanosoma brucei. La procedura produce un complesso altamente puro, omogeneo e attivo adatto per studi strutturali ed enzimatici.

Isolamento di F1-ATPasi dal Protista parassita Trypanosoma brucei

F1-ATPase is a membrane-extrinsic catalytic subcomplex of F-type ATP synthase, an enzyme that uses the proton motive force across biological membranes to ...

La purificazione dell'F1-ATPasi si basa su un classico metodo biochimico che si è rivelato cruciale per la nostra comprensione del meccanismo di produzione di ATP da parte di altre sintasi ATP. Il principale vantaggio di questa tecnica è che produce un enzima altamente puro adatto alla determinazione della struttura mediante cristallografia a raggi X o microscopia crioelettica. Sebbene questo protocollo sia ottimizzato per l'isolamento dell'F1-ATPasi dai tripanosomi, può essere adattato ad altre fonti, come cellule tissutali o di coltura, e a vari protisti patogeni.Questa tecnica può portare all'identificazione di nuovi farmaci per il trattamento di gravi malattie umane. Ad esempio, Mycobacterium tuberculosis F-ATPase è un obiettivo farmacologico autenticato per il trattamento della tubercolosi. Per iniziare il protocollo, scongelare e rimescolare delicatamente le vescicole mitocondriali, note anche come mitoplasti, precedentemente isolate dalla lisi ipotonica da una per 10 all'11-2 per 10 alle 11 cellule del prociclico Trypanosoma brucei in cinque millilitri di tampone A ghiacciato.Mantenere il campione refrigerato.Successivamente, determinare la concentrazione proteica nella sospensione da parte dell'acido bicinconico, o BCA, test proteico secondo le istruzioni del produttore. Eseguire una serie di diluizioni BSA in acqua ultra pura per costruire la curva standard. Diluire una piccola quantità del campione da 20 a 100 volte con acqua ultra pura per adattarsi alla gamma degli standard BSA.Dopo aver calcolato la quantità totale di proteine nel campione, portare la concentrazione proteica a 16 milligrammi per millilitro diluerla con tampone A aggiuntivo.Quindi frammentare i mitoplasti in vescicole invertite e pezzi di membrana per sonicazione sette volte per 15 secondi ciascuno, con un'energia totale da 70 a 100 joule per impulso con un microtip con un diametro di 3,9 millimetri. Durante la ingmatura, incubare il campione sul ghiaccio per 30 secondi tra gli impulsi. Dopo la sonicazione, la sospensione potrebbe apparire leggermente più scura.Sedimentare i frammenti della membrana per ultracentrifugazione a 54.000 g per 16 ore o a 98.000 g per cinque ore a quattro gradi Celsius. Decantare il supernatante e procedere con l'estrazione cloroformio. Calcolare il volume del buffer B in base alla quantità totale di buffer A utilizzata.Trasferire il sedimento congelato dal tubo di centrifuga nell'omogeneizzatore. Rimescolare il pellet delle membrane mitocondriali nel tampone B con l'aiuto di un piccolo omogeneizzatore Dounce. Trasferire la sospensione in un tubo conico da 50 millilitri.Rimuovere il campione dal ghiaccio e mantenere il campione e tutte le soluzioni a temperatura ambiente per i passaggi rimanenti. Quindi aggiungere cloroformio saturo di due tris molare regolati con HCl a pH 8,5, uno a uno. Chiudere saldamente il cappuccio e agitare vigorosamente il campione per esattamente 20 secondi.Centrifugare immediatamente la miscela a 8.400 g per cinque minuti a temperatura ambiente. Successivamente, trasferire la fase acquosa superiore e torbosa su microtubi da 1,6 millilitri. Aggiungere inibitori della proteasi al campione per sostituire gli inibitori rimossi dal trattamento cloroformio.Centrifugare i campioni a 13.000 g per 30 minuti a temperatura ambiente. Dopo lo spin, trasferire il supernatante su microtubi freschi e ripetere la centrifugazione per rimuovere qualsiasi materiale insolubile rimanente. Equilibrare la colonna Q di scambio ionico a cinque millilitri attaccata a un sistema di cromatografia liquida a proteine veloci con 50 millilitri di buffer di colonna Q ad una portata di cinque millilitri al minuto fino a quando l'assorbanza a 280 nanometri e la conduttività si stabilizzano.Caricare il supernatante sulla colonna equilibrata ad una portata di un millilitro al minuto. Attendere che l'assorbanza a 280 nanometri si stabilizzi sullo sfondo. Applicare un gradiente lineare di 25 millilitri del buffer di eluizione della colonna Q dallo 0% al 100% a una portata di 0,5 millilitri al minuto e raccogliere una frazione millilitro.Saggio 10 microlitri di ogni singola frazione corrispondenti al picco di eluizione maggiore per l'attività idrolitica ATP per millilitro di miscela di reazione da parte del saggio Pullman ATPase a pH 8.0. Mettere in comune le frazioni che mostrano l'attività ATPase. Concentrare il campione raggruppato per ultrafiltrazione a membrana utilizzando una colonna di spin con un filtro PES tagliato a peso molecolare da 100.000 a 200-500 microlitri.Quindi procedere alla cromatografia di esclusione delle dimensioni. Equilibrare la colonna Superose 6 Increase collegata a un sistema di cromatografia liquida con almeno 48 millilitri di tampone SEC ad una portata di 0,5 millilitri al minuto. Applicare l'esempio alla colonna.Eseguire la cromatografia a una portata di 0,25 millilitri al minuto, mentre si raccolgono frazioni di 0,25 millilitri. Successivamente, eseguire 10 microlitri delle frazioni che corrispondono ai picchi della traccia di assorbanza UV 280 nanometrica su SDS-PAGE. Quindi macchiare i campioni con Coomassie Blue.Saggio le frazioni corrispondenti al primo picco maggiore contenente il picco di F1 per l'attività idrolitica ATP e la sensibilità all'azide da parte del saggio Pullman ATPase. Quindi eseguire un test BCA per determinare la concentrazione proteica. Infine, mantenere l'F1-ATPasi purificato a temperatura ambiente e utilizzarlo entro tre giorni dalla purificazione per le applicazioni a valle.Questo profilo di eluizione di una cromatografia a scambio di anioni mostra l'assorbanza UV a 280 nanometri e la concentrazione di cloruro di sodio nel tampone di eluizione. Le frazioni selezionate sono state separate sul gel SDS-PAGE e macchiate con colorante Coomassie Blue. Le frazioni che corrispondono al picco di eluizione maggiore dalla cromatografia a scambio ionico e contengono l'F1-ATPasi sono state raggruppate, concentrate e utilizzate come input per la cromatografia ad esclusione di dimensioni.Il principale contaminante è la diidrolipoil deidrogenasi, che eluisce dalla colonna cromatografica ad esclusione di dimensioni come picco discreto. L'F1-ATPasi eluisce nel primo picco dominante, in gran parte simmetrico. La colorazione Blu Coomassie di un tipico modello di banda dopo la separazione dell'F1-ATPasi purificata tramite SDS-PAGE mostra sporadiche bande deboli visibili sopra la subunità beta, che rappresentano sottocomplessi dell'alfa tre beta tre copricapo, dimeri e oligomeri delle subunità alfa e beta, e sono privi di contaminanti rilevabili dalla spettrometria di massa.Durante l'esecuzione dell'estrazione cloroformio, fase critica del protocollo, è essenziale scuotere vigorosamente il campione e procedere immediatamente alla separazione centrifuga delle fasi organica e acquosa. Seguendo questa procedura, l'F1-ATPasi isolata può essere caratterizzata in dettaglio da spettrometria di massa. Inoltre, può essere utilizzato nei test di attività o per studi strutturali, da solo o in presenza di vari inibitori o analoghi del substrato.

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Isolation of F1-ATPase from the Parasitic Protist Trypanosoma brucei

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