Name: isolation of f1-atpase from the parasitic protist trypanosoma brucei
Uploaded: 2019-01-22T14:00:00
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教育省 ERC CZ によって資金が供給されたこの仕事 LL1205、18-17529S、チェコ共和国の助成機関補助金を付与し、ERDF/ESF プロジェクト (号の寄生虫の病原性と病原性の研究センターCZ.02.1.01/0.0/0.0/16_019/0000759)。

1. バッファーとソリューション
<ol><li>次に挙げたソリューションを準備します。液体クロマトグラフィーのすべてのバッファーをドガします。ちょうど使用する前に ADP、benzamidine、およびプロテアーゼ阻害剤を追加します。<ol>
<li>アミノカプロン酸 (ACA)、およびプロテアーゼ阻害剤 (10 μ M amastatin 50 μ M bestatin 50 μ M ペプスタチン、50 μ M leupeptin、50 μ M diprotin A) 塩酸 (トリス-HCl) ph 値 8.0 0.25 M...

<ol>
	<li>Walker, J. E., Wikstr&#246;m, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure,+mechanism+and+regulation+of+ATP+synthases.">Structure, mechanism and regulation of ATP synthases.</a> Mechanisms of Primary Energy Transduction in Biology. , 338-373 (2017).</li><li>Pullman, M. E., Penefsky, H. S., Datta, A., Racker, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partial+resolution+of+the+enzymes+catalyzing+oxidative+phosphorylation.+I.+Purification+and+properties+of+soluble+dinitrophenol-stimulated+adenosine+triphosphatase.">Partial resolution of the enzymes catalyzing oxidative phosphorylation. I. Purification and properties of soluble dinitrophenol-stimulated adenosine triphosphatase.</a> The Journal of Biological Chemistry. 235, 3322-3329 (1960).</li><li>Schatz, G., Penefsky, H. S., Racker, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partial+resolution+of+the+enzymes+catalyzing+oxidative+phosphorylation.">Partial resolution of the enzymes catalyzing oxidative phosphorylation.</a> XIV. The Journal of Biological Chemistry. 242 (10), 2552-2560 (1967).</li><li>Racker, E., Horstman, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partial+resolution+of+the+enzymes+catalyzing+oxidative+phosphorylation.+13.+Structure+and+function+of+submitochondrial+particles+completely+resolved+with+respect+to+coupling+factor.">Partial resolution of the enzymes catalyzing oxidative phosphorylation. 13. Structure and function of submitochondrial particles completely resolved with respect to coupling factor.</a> The Journal of Biological Chemistry. 242 (10), 2547-2551 (1967).</li><li>Senior, A. E., Brooks, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+the+mitochondrial+oligomycin-insensitive+ATPase.+I.+An+improved+method+of+purification+and+the+behavior+of+the+enzyme+in+solutions+of+various+depolymerizing+agents.">Studies on the mitochondrial oligomycin-insensitive ATPase. I. An improved method of purification and the behavior of the enzyme in solutions of various depolymerizing agents.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 140 (1), 257-266 (1970).</li><li>Tzagoloff, A., Meagher, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+the+mitochondrial+membrane+system.+V.+Properties+of+a+dispersed+preparation+of+the+rutamycin-sensitive+adenosine+triphosphatase+of+yeast+mitochondria.">Assembly of the mitochondrial membrane system. V. Properties of a dispersed preparation of the rutamycin-sensitive adenosine triphosphatase of yeast mitochondria.</a> The Journal of Biological Chemistry. 246 (23), 7328-7336 (1971).</li><li>Beechey, R. B., Hubbard, S. A., Linnett, P. E., Mitchell, A. D., Munn, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+rapid+method+for+the+preparation+of+adenosine+triphosphatase+from+submitochondrial+particles.">A simple and rapid method for the preparation of adenosine triphosphatase from submitochondrial particles.</a> Biochemical Journal. 148 (3), 533-537 (1975).</li><li>Tyler, D. D., Webb, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+properties+of+the+adenosine+triphosphatase+released+from+the+liver+mitochondrial+membrane+by+chloroform.">Purification and properties of the adenosine triphosphatase released from the liver mitochondrial membrane by chloroform.</a> Biochemical Journal. 178 (2), 289-297 (1979).</li><li>Hack, E., Leaver, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+alpha-subunit+of+the+maize+F1-ATPase+is+synthesised+in+the+mitochondrion.">The alpha-subunit of the maize F1-ATPase is synthesised in the mitochondrion.</a> The EMBO Journal. 2 (10), 1783-1789 (1983).</li><li>Dunn, P. P., Slabas, A. R., Moore, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+F1-ATPase+from+cuckoo-pint+(Arum+maculatum)+mitochondria.+A+comparison+of+subunit+composition+with+that+of+rat+liver+F1-ATPase.">Purification of F1-ATPase from cuckoo-pint (Arum maculatum) mitochondria. A comparison of subunit composition with that of rat liver F1-ATPase.</a> Biochemical Journal. 225 (3), 821-824 (1985).</li><li>Satre, M., Bof, M., Vignais, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+Escherichia+coli+adenosine+triphosphatase+with+aurovertin+and+citreoviridin:+inhibition+and+fluorescence+studies.">Interaction of Escherichia coli adenosine triphosphatase with aurovertin and citreoviridin: inhibition and fluorescence studies.</a> Journal of Bacteriology. 142 (3), 768-776 (1980).</li><li>Abrahams, J. P., Leslie, A. G., Lutter, R., Walker, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+at+2.8+&#197;+resolution+of+F1ATPase+from+bovine+heart+mitochondria.">Structure at 2.8 &#197; resolution of F1ATPase from bovine heart mitochondria.</a> Nature. 370 (6491), 621-628 (1994).</li><li>Lutter, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallization+of+F1-ATPase+from+bovine+heart+mitochondria.">Crystallization of F1-ATPase from bovine heart mitochondria.</a> Journal of Molecular Biology. 229 (3), 787-790 (1993).</li><li>Kabaleeswaran, V., Puri, N., Walker, J. E., Leslie, A. G., Mueller, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+features+of+the+rotary+catalytic+mechanism+revealed+in+the+structure+of+yeast+F1-ATPase.">Novel features of the rotary catalytic mechanism revealed in the structure of yeast F1-ATPase.</a> The EMBO Journal. 25 (22), 5433-5442 (2006).</li><li>Shirakihara, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+a+thermophilic+F1-ATPase+inhibited+by+an+epsilon-subunit:+deeper+insight+into+the+epsilon-inhibition+mechanism.">Structure of a thermophilic F1-ATPase inhibited by an epsilon-subunit: deeper insight into the epsilon-inhibition mechanism.</a> The FEBS Journal. 282 (15), 2895-2913 (2015).</li><li>Stocker, A., Keis, S., Cook, G. M., Dimroth, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification,+crystallization,+and+properties+of+F1-ATPase+complexes+from+the+thermoalkaliphilic+Bacillus+sp.+strain+TA2.A1.">Purification, crystallization, and properties of F1-ATPase complexes from the thermoalkaliphilic Bacillus sp. strain TA2.A1.</a> Journal of Structural Biology. 152 (2), 140-145 (2005).</li><li>Ferguson, S. A., Cook, G. M., Montgomery, M. G., Leslie, A. G., Walker, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+thermoalkaliphilic+F1-ATPase+from+Caldalkalibacillus+thermarum.">Regulation of the thermoalkaliphilic F1-ATPase from Caldalkalibacillus thermarum.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (39), 10860-10865 (2016).</li><li>Cataldi de Flombaum, M. A., Frasch, A. C. C., Stoppani, A. O. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenosine+triphosphatase+from+Trypanosoma+cruzi:+purification+and+properties.">Adenosine triphosphatase from Trypanosoma cruzi: purification and properties.</a> Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Comparative Biochemistry. 65 (1), 103-109 (1980).</li><li>Williams, N., Frank, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrial+ATP+synthase+of+Trypanosoma+brucei:+isolation+and+characterization+of+the+intact+F1+moiety.">The mitochondrial ATP synthase of Trypanosoma brucei: isolation and characterization of the intact F1 moiety.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. 43 (1), 125-132 (1990).</li><li>Higa, A. I., Cazzulo, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mg2+-activated+adenosine+triphosphatase+from+Crithidia+fasciculata:+purification+and+inhibition+by+suramin+and+efrapeptin.">Mg2+-activated adenosine triphosphatase from Crithidia fasciculata: purification and inhibition by suramin and efrapeptin.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. 3 (6), 357-367 (1981).</li><li>Walker, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+structure+and+subunit+stoichiometry+of+F1-ATPase+from+bovine+mitochondria.">Primary structure and subunit stoichiometry of F1-ATPase from bovine mitochondria.</a> Journal of Molecular Biology. 184 (4), 677-701 (1985).</li><li>Mueller, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ni-chelate-affinity+purification+and+crystallization+of+the+yeast+mitochondrial+F1-ATPase.">Ni-chelate-affinity purification and crystallization of the yeast mitochondrial F1-ATPase.</a> Protein Expression and Purification. 37 (2), 479-485 (2004).</li><li>Gahura, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+F1-ATPase+from+Trypanosoma+brucei+is+elaborated+by+three+copies+of+an+additional+p18-subunit.">The F1-ATPase from Trypanosoma brucei is elaborated by three copies of an additional p18-subunit.</a> The FEBS Journal. 285 (3), 614-628 (2018).</li><li>Montgomery, M. G., Gahura, O., Leslie, A. G. W., Zikova, A., Walker, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATP+synthase+from+Trypanosoma+brucei+has+an+elaborated+canonical+F1-domain+and+conventional+catalytic+sites.">ATP synthase from Trypanosoma brucei has an elaborated canonical F1-domain and conventional catalytic sites.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (9), 2102-2107 (2018).</li><li>Schneider, A., Charriere, F., Pusnik, M., Horn, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+mitochondria+from+procyclic+Trypanosoma+brucei.">Isolation of mitochondria from procyclic Trypanosoma brucei.</a> Methods in Molecular Biology. 372, 67-80 (2007).</li><li>Smith, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+protein+using+bicinchoninic+acid.">Measurement of protein using bicinchoninic acid.</a> Analytical Biochemistry. 150 (1), 76-85 (1985).</li><li>Wirtz, E., Leal, S., Ochatt, C., Cross, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tightly+regulated+inducible+expression+system+for+conditional+gene+knock-outs+and+dominant-negative+genetics+in+Trypanosoma+brucei.">A tightly regulated inducible expression system for conditional gene knock-outs and dominant-negative genetics in Trypanosoma brucei.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. 99 (1), 89-101 (1999).</li><li>Speijer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+respiratory+chain+from+cultured+Crithidia+fasciculata.">Characterization of the respiratory chain from cultured Crithidia fasciculata.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. 85 (2), 171-186 (1997).</li><li>Nelson, R. E., Aphasizheva, I., Falick, A. M., Nebohacova, M., Simpson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+I-complex+in+Leishmania+tarentolae+is+an+uniquely-structured+F1-ATPase.">The I-complex in Leishmania tarentolae is an uniquely-structured F1-ATPase.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. 135 (2), 221-224 (2004).</li><li>Carbajo, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+the+N-terminal+domain+of+the+OSCP+subunit+of+bovine+F1Fo-ATP+synthase+interacts+with+the+N-terminal+region+of+an+alpha+subunit.">How the N-terminal domain of the OSCP subunit of bovine F1Fo-ATP synthase interacts with the N-terminal region of an alpha subunit.</a> Journal of Molecular Biology. 368 (2), 310-318 (2007).</li><li>Bowler, M. W., Montgomery, M. G., Leslie, A. G., Walker, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ground+state+structure+of+F1-ATPase+from+bovine+heart+mitochondria+at+1.9+&#197;+resolution.">Ground state structure of F1-ATPase from bovine heart mitochondria at 1.9 &#197; resolution.</a> The Journal of Biological Chemistry. 282 (19), 14238-14242 (2007).</li></ol>

F1のプロトコル- t. グリコシルホスファチジルイノシトールからの atp アーゼの浄化は、F1の分離に基づいて以前に発行された法を開発した-他種13,14ATPase 複合体。遺伝的変更がメソッドに必要ない (例えば、タグ付け) と存在のすべてのサブユニットとの完全にアクティブな複合体が得られます。重要なステップは、F...

F 型 ATP 合成酵素は膜結合型細菌、ミトコンドリア、葉緑体の ATP の形成と膜をエネルギー伝達を渡るカップル プロトン透過経路が多蛋白質複合体を回転させます。ATP 合成の回転機構の分子の詳細は、精製された細菌やミトコンドリア ATP 合成酵素とその subcomplexes1の構造の研究のために主に知られています。F 型 ATP 合成酵素は膜組み込みと膜外因性基に編成されます。F1として知られている膜外因性部-atp アーゼ、ATP または逆の反応にアデノシン二リン酸 (ADP) のリン酸化が発生する 3 つの触媒部位が含まれています。F1-膜固有の部位から実験的 atp アーゼがリリースされる加水分解、しかしない、ATP を合成する能力を維持しながらことができます。Foと呼ばれる膜結合型部門は、酵素の中央部分の回転を駆動するタンパク質輸送を仲介します。F1と Foセクターは、中枢および末梢の茎によって接続されます。
1F を浄化するために、最初の試み-ATPase 出芽酵母とウシ心筋ミトコンドリア日付 1960 年代に戻る。これらのプロトコルが使用される抽出アンモニウムまたはプロタミン硫酸塩沈殿物、続いてオプション クロマトグラフィー ステップと熱処理2,3,4 分画の超音波によって中断されたミトコンドリア ,5,6。浄化は大幅改善、F1を容易に解放するクロロホルムの使用で簡素化-ミトコンドリア膜 ATPase の断片7。クロロホルム抽出、F1の抽出に使用された様々 な動物、植物、細菌の源 (例えばラット肝8トウモロコシ9アルムのニンジン10、および大腸菌大腸菌型 Atpase 11)。さらにクロロホルム リリース F1の精製-atp アーゼ アフィニティまたはサイズ排除クロマトグラフィー (SEC) で得られた x 線結晶構造解析による高分解能構造解析に適していた、非常に純粋なタンパク質複合体、として1F の構造によって文書化-ウシ心筋12,13と酵母14ATPase。F1-atp アーゼ構造も耕しにくい生物から決定した、したがって、最初の生物学的材料の量は限られていた。この場合は、F1-atp アーゼのサブユニットが人工的に表現し、エシェリヒア属大腸菌、複雑に組み立てし、全く異種酵素の親和性クロマトグラフィー経由でタグ サブユニットを精製しました。このようなアプローチは、F1の決定につながった-2 好熱性細菌種や株中等度好熱15 Caldalkalibacillus thermarum16,からの atp アーゼの構造17です。 ただし、この方法は適していませんむしろ真核生物の F1型 Atpase それは原核生物 protheosynthetic 装置、翻訳処理、および複雑なアセンブリに依存しているので。
クロロホルムを用いた抽出 F1を分離に使用していた型 Atpase 単細胞ミナミハタンポ寄生虫cruzi18とt. グリコシルホスファチジルイノシトール19アメリカを引き起こす重要な哺乳類の病原体から、アフリカの trypanosomiases、それぞれ、およびイネ昆虫寄生虫クリシジアファシクラータ20から。これらの浄化は、F1の簡単な説明だけに主導型 Atpase、組成、構造、および複合体の酵素学的性質を完全に特徴づける下流のアプリケーションが使われていませんので。F1の最適化方法について説明します- t. 血の培養昆虫のライフ サイクル段階から atp アーゼ浄化。メソッドは、ウシおよび酵母 F1型 Atpase21,22の隔離のための確立したプロトコルに基づいて開発です。プロシージャには、高純度、均一酵素体外酵素と阻害アッセイ、適した質量23、および構造決定24によって詳細なプロテオーム解析が得られます。浄化のプロトコルと F1の知識-atp アーゼ構造の原子レベルが低分子阻害剤を識別し、アフリカの trypanosomiases の新薬の開発を支援する画面をデザインする可能性を開きます。さらに、プロトコルが F1を浄化するために合わせることができる-他の生物から atp アーゼ。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosin Diphosphate Disodium Salt (ADP)</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A0948</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amastatin Hydrochloride</td>
			<td>Glantham Life Sciences</td>
			<td>GA1330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aminocaproic Acid</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A2266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>ThermoFischer Scientific/Pierce</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzamidine Hydrochloride</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>199001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bestatin Hydrochloride</td>
			<td>Sigma Aldrich/Merck</td>
			<td>B8385</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete Tablets, Mini EDTA-free</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4693159001</td>
			<td>Protease inhibitor cocktail tablets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic Acid (EDTA)</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td></td>
			<td>For pH adjustment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ile-Pro-Ile</td>
			<td>Sigma Aldrich/Merck</td>
			<td>I9759</td>
			<td>Alias Diprotin A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leupeptin</td>
			<td>Sigma Aldrich/Merck</td>
			<td>L2884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate Heptahydrate</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pepstatin A</td>
			<td>Sigma Aldrich/Merck</td>
			<td>P5318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Electrophoresis System</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Consumables</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Tubes for SW60Ti, Polyallomer</td>
			<td>Beckman Coulture</td>
			<td>328874</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DounceTissues Homogenizer 2 mL</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Vacuum Filtration Device</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>516-7017</td>
			<td>Degasing solutions for liquid chromatography</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiTrap Q HP, 5 mL</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>17115401</td>
			<td>Anion exchange chromatography column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Regenaretad Cellulose Membrane Filters, pore size 0.45 &#956;m, diameter 47 mm</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>18406--47------N</td>
			<td>Degasing solutions for liquid chromatography</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superdex 200 Increase 10/300 GL</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>29091596</td>
			<td>Size-exclusion chromatography column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vivaspin 6 MWCO 100 kDa PES</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>VS0641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AKTA Pure 25</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>29018224</td>
			<td>Or similar FPLC system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer Shimadzu UV-1601</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td></td>
			<td>Or similar spectrophotometer with kinetic assay mode</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge Beckman Optima with SW60Ti Rotor</td>
			<td>Beckman Coulture</td>
			<td></td>
			<td>Or similar ultracentrifuge and rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic Homogenizer with Thin Probe, Model 3000</td>
			<td>BioLogics</td>
			<td>0-127-0001</td>
			<td>Or similar ultrasonic homogenizer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of f1-atpase from the parasitic protist trypanosoma brucei

F1-atp アーゼは F 型 ATP 合成酵素、アデノシン三リン酸 (ATP) を生成する生物膜を渡るプロトン動機力を使用する酵素膜外因性触媒 subcomplex。そのまま F1の分離-ネイティブ ソースから atp アーゼは酵素のタンパク質組成、速度論的パラメーター、および阻害剤への感受性を特徴付けるための必須の前提条件です。高純度、均一の F1-atp アーゼは構造研究、ATP 合成と加水分解の分子メカニズムに洞察力を提供する使用ことができます。この資料は、F1の浄化のための手順を説明します-トリパノソーマ、アフリカ trypanosomiases の病原 ATPase。F1-atp アーゼは体外で培養した培養 trypanosomes から低張性溶解して得られるミトコンドリアの小胞から分離。小胞は超音波と F1により機械的に断片化されます-atp アーゼはクロロホルム抽出法によるミトコンドリア内膜から解放されます。酵素複合体は連続陰イオン交換とサイズ排除クロマトグラフィーによってさらに純化されます。高感度質量分析技術を示した浄化された複雑な事実上すべての蛋白質の汚染物を欠いているし、したがって、x 線結晶構造解析や電子顕微鏡による構造決定のための適した材料を表します。孤立した F1-ATPase は、ATP の加水分解活性は、アジ化ナトリウム、F 型 ATP 合成酵素の強力な阻害剤で完全に抑制することができますを展示します。精製した複合体は、室温で少なくとも 3 日間安定性とアクティブを維持します。アンモニウムの硫酸塩の沈殿物は、長期保存のために使用されます。同じようなプロシージャは、F1の浄化のために使用されている型 Atpase 細菌や酵母、哺乳類と植物組織から。したがって、提案するプロトコルは、F1のためのガイドラインとして使用できる-他の生物からの atp アーゼの隔離。

典型的な精製 (図 1) から始まるミトコンドリア小胞 (mitoplasts) 2 x 1011 procyclic に hypotonically 分離 1 x 1011からパーコールに分離された標準で培養したt. グリコシルホスファチジルイノシトールセル25グルコースが豊富な SDM 79 中27。スピン、超音波によって、mitoplasts が断片化しているし、行?...

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Isolation of F1-ATPase from the Parasitic Protist Trypanosoma brucei

このプロトコルを記述する F1の浄化-atp アーゼトリパノソーマの培養昆虫ステージから。手順により、高純度、均一な、アクティブな複合体の構造と酵素の研究に最適です。

F1の分離-寄生原生トリパノソーマから atp アーゼ

F1-ATPase is a membrane-extrinsic catalytic subcomplex of F-type ATP synthase, an enzyme that uses the proton motive force across biological membranes to ...

F1-ATPaseの精製は、他のATP合成酵素によるATP生産のメカニズムを理解するために重要であることが証明された古典的な生化学的方法に基づいています。この技術の主な利点は、X線結晶学やクライオ電子顕微鏡による構造決定に適した高純度酵素を生成することです。このプロトコルは、トリパノソームからのF1-ATPaseの分離のために最適化されているが、それは、組織や培養細胞などの他の供給源、および様々な病原性プロニストに適応することができる。この技術は、重篤なヒト疾患を治療するための新薬の同定につながる可能性がある。例えば、結核菌F-ATPaseは結核の治療のための認証された薬物標的である。プロトコルを開始するには、ミトプラストとも呼ばれるミトコンドリア小胞を解凍し、穏やかに再中断し、以前は低血圧リシスによって1回から10〜2倍の10倍から11倍の長周期トリパノソーマブルージーの11細胞に氷冷バッファーA.サンプルを冷やし続ける。次に、製造者の指示に従って、ビチンチオン酸、またはBCA、タンパク質アッセイによって懸濁液中のタンパク質濃度を決定する。BSA希釈シリーズを超純水で行い、標準曲線を構築します。少量のサンプルを、BSA規格の範囲に収まるように、超純水で20~100倍希釈する。サンプル中のタンパク質量の合計を計算した後、追加のバッファAで希釈して1ミリリットル当たり16ミリグラムにタンパク質濃度を持ち込み、その後、ミトプラストを反転小胞と膜片にそれぞれ15秒間超音波処理して7回断片化し、直径3.9ミリメートルのマイクロチップを持つマイクロチップを持つ1つの総エネルギーで70〜100ジュールの総エネルギーを使用します。断片化しながら、インパルスの間に30秒間氷上でサンプルをインキュベートします。超音波処理の後、サスペンションは少し暗く見えるかもしれません。膜断片を54,000gで16時間、摂氏4度で5時間98,000gで超遠心分離して沈下する。上清をデカントし、クロロホルム抽出を進める。使用するバッファAの合計量に基づいてバッファBのボリュームを計算します。冷凍沈水を遠心分離管からホモジナイザーに移します。小さなDounceホモジナイザーの助けを借りて、バッファBのミトコンドリア膜のペレットを再懸濁する。サスペンションを50ミリリットルの円錐チューブに移します。氷からサンプルを取り除き、残りのステップのためにサンプルとすべての溶液を室温で保ちます。その後、HClで調整した2つのモルトリスで飽和したクロロホルムをpH 8.5に1対1で加えます。キャップをしっかりと閉じ、サンプルを20秒間激しく振ります。直ちに混合物を室温で5分間8、400gで遠心する。次に、上側の濁水相を1.6ミリリットルマイクロチューブに移します。サンプルにプロテアーゼ阻害剤を加え、クロロホルム処理によって除去された阻害剤を置き換える。試料を室温で30分間13,000gで遠心分離する。スピン後、上清を新鮮なマイクロチューブに移し、遠心分離を繰り返して残りの不溶性物質を除去する。280ナノメートルの吸光度が安定するまで、Qカラムバッファの50ミリリットルを1分間に5ミリリットルの流量で高速タンパク質液体クロマトグラフィーシステムに取り付けた5ミリリットルのアニオン交換Qカラムを平衡化します。平衡カラムに上清を1分あたり1ミリリットルの流量で積み込みます。280ナノメートルの吸光度が背景で安定するまで待ちます。Q カラム溶出バッファーの 25 ミリリットル線形勾配を 0% ~ 100% の流量 0.5 ミリリットル/分で適用し、1 ミリリットル分数を収集します。pH8.0でプルマンATPaseアッセイによる反応混合物のミリリットル当たりATP加水分解活性に対するATP加水活性に対応する各個々の分画のアッセイ10マイクロリットル。ATPase アクティビティを示す分数をプールします。100,000分子量カットオフPESフィルターを用いたスピンカラムを用いて、膜外ろ過によってプールされたサンプルを200~500マイクロリットルに濃縮します。その後、サイズ排除クロマトグラフィーに進みます。1分間に0.5ミリリットルの流量で少なくとも48ミリリットルのSECバッファーを有する液体クロマトグラフィーシステムに取り付けられたスーパーオース6増加カラムを平衡化する。列にサンプルを適用します。0.25ミリリットルの分数を収集しながら、毎分0.25ミリリットルの流量でクロマトグラフィーを実行します。次に、SDS-PAGE上のUV280ナノメートル吸光度トレースのピークに対応する画分の10マイクロリットルを実行します。その後、クマシーブルーでサンプルを染色します。プルマンATPaseアッセイによるATP加水分解活性およびアジ化感度に対するF1ピークを含む第1の主要ピークに対応する分数をアッセイする。次いで、BCAアッセイを行い、タンパク質濃度を決定する。最後に、精製したF1-ATPaseを室温に保ち、下流用途に精製してから3日以内に使用します。この陰イオン交換クロマトグラフィーの溶出プロファイルは、溶出バッファー内の 280 ナノメートルの UV 吸光度と塩化ナトリウムの濃度を表示します。選択した分画をSDS-PAGEゲル上で分離し、クマシーブルー染料で染色した。アニオン交換クロマトグラフィーからの大溶出ピークに対応し、F1-ATPaseを含む画分をプールし、濃縮し、サイズ排除クロマトグラフィーの入力として使用した。主な汚染物質はジヒドロリポイルデヒドロゲナーゼであり、これは離散ピークとしてサイズ排除クロマトグラフィーカラムから溶出する。F1-ATPaseは、最初の支配的で、主に対称的なピークに溶出する。SDS-PAGEを介して精製されたF1-ATPaseを分離した後の典型的なバンドパターンのクマシーブルー染色は、アルファ3ベータ3ヘッドピース、ダイマーおよびオリゴマーのアルファ3つのヘッドピース、ダイマーおよびオリゴマーのサブ複合体を表すベータサブユニットの上に見える散発的な弱いバンドを示し、質量分析によって検出可能な汚染物質の欠損である。クロロホルム抽出を行いながら、プロトコルの臨界工程を、試料を激しく振り、有機相と水相の遠心分離に直ちに進むのが不可欠である。この手順に従って、分離されたF1-ATPaseは質量分析法によって詳細に特徴づけることができる。また、活性アッセイまたは構造研究において、単独で、または種々の阻害剤または基質類似体の存在下で使用することができる。

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Ready-To-Use qPCR for Detection of DNA from Trypanosoma cruzi or Other Pathogenic Organisms

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