Name: isolation of f1-atpase from the parasitic protist trypanosoma brucei
Uploaded: 2019-01-22T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of F1-ATPase from the Parasitic Protist Trypanosoma brucei at JoVE.com

이 작품은 교육 ERC CZ의 내각에 의해 투자 되었다 LL1205, 체코 공화국의 부여 기관 보조금 18-17529S, 부여 그리고 ERDF/ESF에 의해 프로젝트 pathogenicity의 기생충 (No.의 독성 연구를 위한 센터 CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_019/0000759)입니다.

1. 버퍼 및 솔루션
<ol><li>아래에 나열 된 솔루션을 준비 합니다. 액체 크로마토그래피에 대 한 모든 버퍼 드 그냥 사용 하기 전에 ADP, benzamidine, 및 프로 테아 제 억제제를 추가 합니다.<ol>
<li>Aminocaproic 산 (ACA), 그리고 프로 테아 제 억제제 (10 µ M amastatin, 50 µ M bestatin, 50 µ M pepstatin, 50 µ M leupeptin, 및 50 µ M diprotin A) 염 산 (Tris HCl) ph 8.0, 0.25 M 자당 5 m m benzamidine, 5mm 버퍼 a: 50 mM Tris 버퍼를 준비 합니다.<...

<ol>
	<li>Walker, J. E., Wikstr&#246;m, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure,+mechanism+and+regulation+of+ATP+synthases.">Structure, mechanism and regulation of ATP synthases.</a> Mechanisms of Primary Energy Transduction in Biology. , 338-373 (2017).</li><li>Pullman, M. E., Penefsky, H. S., Datta, A., Racker, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partial+resolution+of+the+enzymes+catalyzing+oxidative+phosphorylation.+I.+Purification+and+properties+of+soluble+dinitrophenol-stimulated+adenosine+triphosphatase.">Partial resolution of the enzymes catalyzing oxidative phosphorylation. I. Purification and properties of soluble dinitrophenol-stimulated adenosine triphosphatase.</a> The Journal of Biological Chemistry. 235, 3322-3329 (1960).</li><li>Schatz, G., Penefsky, H. S., Racker, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partial+resolution+of+the+enzymes+catalyzing+oxidative+phosphorylation.">Partial resolution of the enzymes catalyzing oxidative phosphorylation.</a> XIV. The Journal of Biological Chemistry. 242 (10), 2552-2560 (1967).</li><li>Racker, E., Horstman, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partial+resolution+of+the+enzymes+catalyzing+oxidative+phosphorylation.+13.+Structure+and+function+of+submitochondrial+particles+completely+resolved+with+respect+to+coupling+factor.">Partial resolution of the enzymes catalyzing oxidative phosphorylation. 13. Structure and function of submitochondrial particles completely resolved with respect to coupling factor.</a> The Journal of Biological Chemistry. 242 (10), 2547-2551 (1967).</li><li>Senior, A. E., Brooks, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+the+mitochondrial+oligomycin-insensitive+ATPase.+I.+An+improved+method+of+purification+and+the+behavior+of+the+enzyme+in+solutions+of+various+depolymerizing+agents.">Studies on the mitochondrial oligomycin-insensitive ATPase. I. An improved method of purification and the behavior of the enzyme in solutions of various depolymerizing agents.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 140 (1), 257-266 (1970).</li><li>Tzagoloff, A., Meagher, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+the+mitochondrial+membrane+system.+V.+Properties+of+a+dispersed+preparation+of+the+rutamycin-sensitive+adenosine+triphosphatase+of+yeast+mitochondria.">Assembly of the mitochondrial membrane system. V. Properties of a dispersed preparation of the rutamycin-sensitive adenosine triphosphatase of yeast mitochondria.</a> The Journal of Biological Chemistry. 246 (23), 7328-7336 (1971).</li><li>Beechey, R. B., Hubbard, S. A., Linnett, P. E., Mitchell, A. D., Munn, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+rapid+method+for+the+preparation+of+adenosine+triphosphatase+from+submitochondrial+particles.">A simple and rapid method for the preparation of adenosine triphosphatase from submitochondrial particles.</a> Biochemical Journal. 148 (3), 533-537 (1975).</li><li>Tyler, D. D., Webb, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+properties+of+the+adenosine+triphosphatase+released+from+the+liver+mitochondrial+membrane+by+chloroform.">Purification and properties of the adenosine triphosphatase released from the liver mitochondrial membrane by chloroform.</a> Biochemical Journal. 178 (2), 289-297 (1979).</li><li>Hack, E., Leaver, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+alpha-subunit+of+the+maize+F1-ATPase+is+synthesised+in+the+mitochondrion.">The alpha-subunit of the maize F1-ATPase is synthesised in the mitochondrion.</a> The EMBO Journal. 2 (10), 1783-1789 (1983).</li><li>Dunn, P. P., Slabas, A. R., Moore, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+F1-ATPase+from+cuckoo-pint+(Arum+maculatum)+mitochondria.+A+comparison+of+subunit+composition+with+that+of+rat+liver+F1-ATPase.">Purification of F1-ATPase from cuckoo-pint (Arum maculatum) mitochondria. A comparison of subunit composition with that of rat liver F1-ATPase.</a> Biochemical Journal. 225 (3), 821-824 (1985).</li><li>Satre, M., Bof, M., Vignais, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+Escherichia+coli+adenosine+triphosphatase+with+aurovertin+and+citreoviridin:+inhibition+and+fluorescence+studies.">Interaction of Escherichia coli adenosine triphosphatase with aurovertin and citreoviridin: inhibition and fluorescence studies.</a> Journal of Bacteriology. 142 (3), 768-776 (1980).</li><li>Abrahams, J. P., Leslie, A. G., Lutter, R., Walker, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+at+2.8+&#197;+resolution+of+F1ATPase+from+bovine+heart+mitochondria.">Structure at 2.8 &#197; resolution of F1ATPase from bovine heart mitochondria.</a> Nature. 370 (6491), 621-628 (1994).</li><li>Lutter, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallization+of+F1-ATPase+from+bovine+heart+mitochondria.">Crystallization of F1-ATPase from bovine heart mitochondria.</a> Journal of Molecular Biology. 229 (3), 787-790 (1993).</li><li>Kabaleeswaran, V., Puri, N., Walker, J. E., Leslie, A. G., Mueller, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+features+of+the+rotary+catalytic+mechanism+revealed+in+the+structure+of+yeast+F1-ATPase.">Novel features of the rotary catalytic mechanism revealed in the structure of yeast F1-ATPase.</a> The EMBO Journal. 25 (22), 5433-5442 (2006).</li><li>Shirakihara, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+a+thermophilic+F1-ATPase+inhibited+by+an+epsilon-subunit:+deeper+insight+into+the+epsilon-inhibition+mechanism.">Structure of a thermophilic F1-ATPase inhibited by an epsilon-subunit: deeper insight into the epsilon-inhibition mechanism.</a> The FEBS Journal. 282 (15), 2895-2913 (2015).</li><li>Stocker, A., Keis, S., Cook, G. M., Dimroth, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification,+crystallization,+and+properties+of+F1-ATPase+complexes+from+the+thermoalkaliphilic+Bacillus+sp.+strain+TA2.A1.">Purification, crystallization, and properties of F1-ATPase complexes from the thermoalkaliphilic Bacillus sp. strain TA2.A1.</a> Journal of Structural Biology. 152 (2), 140-145 (2005).</li><li>Ferguson, S. A., Cook, G. M., Montgomery, M. G., Leslie, A. G., Walker, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+thermoalkaliphilic+F1-ATPase+from+Caldalkalibacillus+thermarum.">Regulation of the thermoalkaliphilic F1-ATPase from Caldalkalibacillus thermarum.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (39), 10860-10865 (2016).</li><li>Cataldi de Flombaum, M. A., Frasch, A. C. C., Stoppani, A. O. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenosine+triphosphatase+from+Trypanosoma+cruzi:+purification+and+properties.">Adenosine triphosphatase from Trypanosoma cruzi: purification and properties.</a> Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Comparative Biochemistry. 65 (1), 103-109 (1980).</li><li>Williams, N., Frank, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrial+ATP+synthase+of+Trypanosoma+brucei:+isolation+and+characterization+of+the+intact+F1+moiety.">The mitochondrial ATP synthase of Trypanosoma brucei: isolation and characterization of the intact F1 moiety.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. 43 (1), 125-132 (1990).</li><li>Higa, A. I., Cazzulo, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mg2+-activated+adenosine+triphosphatase+from+Crithidia+fasciculata:+purification+and+inhibition+by+suramin+and+efrapeptin.">Mg2+-activated adenosine triphosphatase from Crithidia fasciculata: purification and inhibition by suramin and efrapeptin.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. 3 (6), 357-367 (1981).</li><li>Walker, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+structure+and+subunit+stoichiometry+of+F1-ATPase+from+bovine+mitochondria.">Primary structure and subunit stoichiometry of F1-ATPase from bovine mitochondria.</a> Journal of Molecular Biology. 184 (4), 677-701 (1985).</li><li>Mueller, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ni-chelate-affinity+purification+and+crystallization+of+the+yeast+mitochondrial+F1-ATPase.">Ni-chelate-affinity purification and crystallization of the yeast mitochondrial F1-ATPase.</a> Protein Expression and Purification. 37 (2), 479-485 (2004).</li><li>Gahura, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+F1-ATPase+from+Trypanosoma+brucei+is+elaborated+by+three+copies+of+an+additional+p18-subunit.">The F1-ATPase from Trypanosoma brucei is elaborated by three copies of an additional p18-subunit.</a> The FEBS Journal. 285 (3), 614-628 (2018).</li><li>Montgomery, M. G., Gahura, O., Leslie, A. G. W., Zikova, A., Walker, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATP+synthase+from+Trypanosoma+brucei+has+an+elaborated+canonical+F1-domain+and+conventional+catalytic+sites.">ATP synthase from Trypanosoma brucei has an elaborated canonical F1-domain and conventional catalytic sites.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (9), 2102-2107 (2018).</li><li>Schneider, A., Charriere, F., Pusnik, M., Horn, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+mitochondria+from+procyclic+Trypanosoma+brucei.">Isolation of mitochondria from procyclic Trypanosoma brucei.</a> Methods in Molecular Biology. 372, 67-80 (2007).</li><li>Smith, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+protein+using+bicinchoninic+acid.">Measurement of protein using bicinchoninic acid.</a> Analytical Biochemistry. 150 (1), 76-85 (1985).</li><li>Wirtz, E., Leal, S., Ochatt, C., Cross, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tightly+regulated+inducible+expression+system+for+conditional+gene+knock-outs+and+dominant-negative+genetics+in+Trypanosoma+brucei.">A tightly regulated inducible expression system for conditional gene knock-outs and dominant-negative genetics in Trypanosoma brucei.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. 99 (1), 89-101 (1999).</li><li>Speijer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+respiratory+chain+from+cultured+Crithidia+fasciculata.">Characterization of the respiratory chain from cultured Crithidia fasciculata.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. 85 (2), 171-186 (1997).</li><li>Nelson, R. E., Aphasizheva, I., Falick, A. M., Nebohacova, M., Simpson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+I-complex+in+Leishmania+tarentolae+is+an+uniquely-structured+F1-ATPase.">The I-complex in Leishmania tarentolae is an uniquely-structured F1-ATPase.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. 135 (2), 221-224 (2004).</li><li>Carbajo, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+the+N-terminal+domain+of+the+OSCP+subunit+of+bovine+F1Fo-ATP+synthase+interacts+with+the+N-terminal+region+of+an+alpha+subunit.">How the N-terminal domain of the OSCP subunit of bovine F1Fo-ATP synthase interacts with the N-terminal region of an alpha subunit.</a> Journal of Molecular Biology. 368 (2), 310-318 (2007).</li><li>Bowler, M. W., Montgomery, M. G., Leslie, A. G., Walker, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ground+state+structure+of+F1-ATPase+from+bovine+heart+mitochondria+at+1.9+&#197;+resolution.">Ground state structure of F1-ATPase from bovine heart mitochondria at 1.9 &#197; resolution.</a> The Journal of Biological Chemistry. 282 (19), 14238-14242 (2007).</li></ol>

F1에 대 한 프로토콜-ATPase 정화 T. brucei 에서 개발한 F1의 분리에 따라 이전에 게시 방법-ATPase 단지 다른 종13,14에서. 메서드에 유전 수정 필요 하지 않습니다 (예를 들어, 태그) 하 고 현재 모든 소 단위와 완전히 활성화 단지 생성. 중요 한 단계는 F1의 클로 프롬 촉진 릴리스-ATPase 효소의 막 연결 부분에서. 지금까지 ?...

F 타입 ATP synthases는 막 도약 ATP 형성 박테리아와 미토 콘 드리 아, 엽록체의 에너지 시험 막 걸쳐 multiprotein 단지 그 몇 양성자 전 좌를 회전. ATP 합성의 회전 메커니즘의 분자 세부 정화 박테리아와 미토 콘 드리 아 ATP synthases 및 그들의 subcomplexes1의 구조 연구 때문에 주로 알려져 있습니다. F 형 ATP synthase 막 내장 고 막 외부 moieties로 구성 됩니다. F1막 외부 부분-ATPase, 포함 ATP 또는 역방향 반응은 아데노신 diphosphate (ADP)의 인 산화 발생 3 촉매 사이트. F1-ATPase 공개 될 수 있는 실험적으로 막 내장 moiety에서은, 하지만 하지, ATP를 합성 하는 기능을 유지 하면서. Fo, 라고 막 도약 분야 중재 단백질 전 좌, 효소의 중앙 부분의 회전 드라이브. F1 과 Fo 분야 중앙과 주변 줄기로 연결 된다.
첫 번째는 F1을 정화 하려고-1960 년대에 다시 싹 트는 효 모 및 소 심장 미토 콘 드리 아에서 ATPase. 이러한 프로토콜 사용 추출 쥡니다, 암모늄 또는 protamine 황산 염 강 수, 옵션 크로마토그래피 단계 및 열 처리2,3,4로 분류 한에 의해 중단 되었다 미토 콘 드리 아 ,,56. 정화는 크게 개선 하 고 클로 프롬, F1를 쉽게 해제 사용 하 여 단순화-미토 콘 드 리아 멤브레인에서 ATPase 조각7. 클로 프롬 추출 했다 다음 F1을 추출 하는 데 사용 됩니다-ATPases 다양 한 동물, 식물 및 세균성 원본 (예를 들어, 쥐 간8, 옥수수9, 식물 maculatum10및 병원 성 대장균 11). 더 클로 프롬 발표 F1의 정화-ATPase 선호도 또는 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)에 의해 굴복 했다 엑스레이 결정학에 의해 고해상도 구조 결정을 위해 적당 한, 매우 순수한 단백질 복잡 한로 F1의 구조에 의해 문서화-소 심장12,13 를 Saccharomyces cerevisiae14ATPase. F1-ATPase 구조 또한 육성 하기 어려운 유기 체에서 결정 하 고, 따라서, 초기 생물 학적 물질의 양을 제한 했다. 이 경우에는 F1에서-ATPase subunits 인위적으로 표현 되었고, 대장균에 복잡 한에 조립 및 전체 분리 효소 태그 소 단위 친화성 크로마토그래피 를 통해 에 의해 순화 되었다. 이러한 접근 방식은 F1의 결정을 주도-ATPase 구조 두 thermophilic 박테리아 종, Geobacillus stearothermophilus15 Caldalkalibacillus thermarum16, 에서 그러나 17.,이 방법론은 오히려 진 핵 F1에 적합 하지 않습니다-ATPases 이후 간결한 protheosynthetic 장치, posttranslational 처리 및 복잡 한 어셈블리에 의존.
클로 프롬 기반 추출은 이전 F1을 분리 하는 데 사용 됩니다-ATPases 단 세포 digenetic 기생충 Trypanosoma cruzi18 와 토니 brucei19, 미국인을 일으키는 중요 한 포유류 병원 균 및 아프리카 trypanosomiases, 각각, 그리고 monogenic 곤충 기생충 Crithidia fasciculata20에서. 이 담긴 F1의 간단한 설명만 이끌어-ATPases, 다운스트림 응용 프로그램 완전히 구성, 구조, 및 복합물의 효소 속성을 특성화 하는 데 사용 했다. 이 문서에서는 설명 합니다 F1에 대 한 최적화 된 방법- 토니 brucei의 교양된 곤충 라이프 사이클 단계에서 ATPase 정화. 메서드는 소 및 효 모 F1-ATPases21,22의 격리에 대 한 설립된 프로토콜에 따라 개발 된다. 절차는 매우 순수 하 고 동종 효소 적합 체 외에서 효소 그리고 금지 분석 실험, 질량 분석23, 및 구조 결정24상세한 proteomic 특성화를 생성합니다. F1의 지식과 정화 프로토콜-ATPase 구조 원자 수준에서 화면 작은 분자 억제제, 식별 하 고 아프리카 trypanosomiases에 대 한 새로운 약물의 개발에 도움을 설계 하는 가능성을 엽니다. 또한, 프로토콜 정화 F1을 적용할 수 있습니다-다른 유기 체에서 ATPase.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosin Diphosphate Disodium Salt (ADP)</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A0948</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amastatin Hydrochloride</td>
			<td>Glantham Life Sciences</td>
			<td>GA1330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aminocaproic Acid</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A2266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>ThermoFischer Scientific/Pierce</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzamidine Hydrochloride</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>199001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bestatin Hydrochloride</td>
			<td>Sigma Aldrich/Merck</td>
			<td>B8385</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete Tablets, Mini EDTA-free</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4693159001</td>
			<td>Protease inhibitor cocktail tablets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic Acid (EDTA)</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td></td>
			<td>For pH adjustment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ile-Pro-Ile</td>
			<td>Sigma Aldrich/Merck</td>
			<td>I9759</td>
			<td>Alias Diprotin A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leupeptin</td>
			<td>Sigma Aldrich/Merck</td>
			<td>L2884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate Heptahydrate</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pepstatin A</td>
			<td>Sigma Aldrich/Merck</td>
			<td>P5318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Electrophoresis System</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Consumables</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Tubes for SW60Ti, Polyallomer</td>
			<td>Beckman Coulture</td>
			<td>328874</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DounceTissues Homogenizer 2 mL</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Vacuum Filtration Device</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>516-7017</td>
			<td>Degasing solutions for liquid chromatography</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiTrap Q HP, 5 mL</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>17115401</td>
			<td>Anion exchange chromatography column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Regenaretad Cellulose Membrane Filters, pore size 0.45 &#956;m, diameter 47 mm</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>18406--47------N</td>
			<td>Degasing solutions for liquid chromatography</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superdex 200 Increase 10/300 GL</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>29091596</td>
			<td>Size-exclusion chromatography column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vivaspin 6 MWCO 100 kDa PES</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>VS0641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AKTA Pure 25</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>29018224</td>
			<td>Or similar FPLC system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer Shimadzu UV-1601</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td></td>
			<td>Or similar spectrophotometer with kinetic assay mode</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge Beckman Optima with SW60Ti Rotor</td>
			<td>Beckman Coulture</td>
			<td></td>
			<td>Or similar ultracentrifuge and rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic Homogenizer with Thin Probe, Model 3000</td>
			<td>BioLogics</td>
			<td>0-127-0001</td>
			<td>Or similar ultrasonic homogenizer</td>
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isolation of f1-atpase from the parasitic protist trypanosoma brucei

F1-ATPase는 F 형 ATP synthase, 생물 막에 걸쳐 양성자 동기 힘을 사용 하 여 아데노신 3 인산 염 (ATP)를 생산 하는 효소의 막 외부 촉매 subcomplex. 그대로 F1의 절연-ATPase는 네이티브 소스에서 효소의 단백질 구성, 운동, 변수와 감도 억제제를 특성화 하는 필수적인 전제 조건입니다. 매우 순수 하 고 균질 F1-ATPase는 ATP 합성과 가수분해의 분자 메커니즘에 대 한 통찰력을 제공 하는 구조 연구에 사용할 수 있습니다. 이 문서에서는 설명 합니다 F1의 정화에 대 한 절차- Trypanosoma brucei, 아프리카 trypanosomiases의 원인이 되는 대리인에서에서 ATPase. F1-ATPase는 침투성 세포에 생체 외에서 배양 trypanosomes에서 여는 미토 콘 드 리아 vesicles에서 격리 됩니다. 소포는 기계적으로 쥡니다와 F1에 의해 조각-ATPase는 클로 프롬 적 출에 의해 내부 미토 콘 드 리아 멤브레인에서 발표. 효소 복합물은 추가 연속 음이온 교환 및 크기 배제 크로마토그래피에 의해 정화 된다. 중요 한 질량 분석 기술을 보여주었다는 순화 된 복잡 한 거의 모든 단백질 오염 물질 없는 이며, 따라서, 엑스레이 결정학 또는 cryo 전자 현미경 검사 법에 의해 구조 결심을 위한 적당 한 물자를 나타냅니다. 격리 된 F1-ATPase 전시 ATP 가수분해 활동, 나트륨 아 지 드, F 형 ATP synthases의 강력한 억제제에 의해 완전히 저해 될 수 있습니다. 순화 된 복잡 한 실내 온도에 적어도 3 일에 대 한 안정적이 고 활성 남아 있습니다. 황산 암모늄에 의해 강 수는 장기 저장을 위해 사용 됩니다. 유사한 절차는 F1의 정화 사용 되었습니다-ATPases 포유류 및 식물 조직, 효 모, 또는 박테리아. 따라서, 제시 프로토콜 F1에 대 한 지침으로 사용할 수 있습니다-다른 유기 체에서 ATPase 격리.

일반적인 정화 (그림 1) T. brucei 셀25 표준에서 양식 2 x 1011 procyclic hypotonically lysed 1 x 1011 Percoll 그라데이션에 고립 된 미토 콘 드 리아 소포 (mitoplasts)로 시작 포도 당-풍부한 SDM-79 중27. mitoplasts 쥡니다, 돌 다에 의해 조각화 되 고 포함 하는 매트릭스 상쾌한 삭제 됩니다. 미토 콘 드리 아 막 클?...

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Isolation of F1-ATPase from the Parasitic Protist Trypanosoma brucei

이 프로토콜 설명 F1의 정화- Trypanosoma brucei의 교양된 곤충 단계에서 ATPase. 프로시저 생성 매우 순수한, 균질, 고 활성 복잡 한 구조상과 효소 연구에 적합 합니다.

F1의 절연-ATPase 기생 원생 생물 Trypanosoma brucei 에서

F1-ATPase is a membrane-extrinsic catalytic subcomplex of F-type ATP synthase, an enzyme that uses the proton motive force across biological membranes to ...

F1-ATPase의 정제는 다른 ATP 신디사이저에 의해 ATP 생산메커니즘의 우리의 이해에 매우 중요한 것으로 입증 된 고전적인 생화학 적 방법을 기반으로합니다. 이 기술의 주요 장점은 X 선 결정학 또는 극저온 현미경 검사법에 의한 구조 결정에 적합한 매우 순수한 효소를 생성한다는 것입니다. 이 프로토콜은 trypanosomes에서 F1-ATPase의 격리에 최적화되어 있지만, 조직 또는 배양 세포와 같은 다른 소스와 다양한 병원성 선신에 적응할 수 있습니다.이 기술은 가혹한 인간적인 질병을 취급하기 위하여 새로운 약의 확인으로 이끌어 낼 수 있습니다. 예를 들어, 진균 결핵 F-ATPase는 결핵의 치료를 위한 인증된 약물 표적이다. 프로토콜을 시작하기 위해, 해동하고 부드럽게 미토콘드리아 소포를 다시 중단, 또한 미토콘라스로 알려진, 이전에 한 번 10에서 11 에 2 번 10에 11 에서 11 에 2 번 10 에 얼음 차가운 버퍼 A.의 5 밀리리터에 있는 미토콘드리아 소포를 다시 중단하십시오.다음으로, 제조사의 지시에 따라 비신천산 또는 BCA, 단백질 분석에 의한 현탁액의 단백질 농도를 결정한다. 표준 곡선을 구성하기 위해 초순수 수에서 BSA 희석 계열을 수행합니다. BSA 표준의 범위에 맞게 초순수물로 소량의 샘플을 20~100회 희석시 희석시.시료의 총 단백질 양을 계산한 후, 추가 버퍼 A.다음 마이크로플라스트를 15초 동안 7회 씩 소닉하여 반전된 소포와 멤브레인 조각으로 조각하여 밀리리터당 16밀리그램으로 단백질 농도를 가져와, 직경 이 3.9mm의 마이크로 팁으로 충동당 총 에너지70~100줄의 에너지를 섭취한다. 조각화하는 동안, 충동 사이의 30 초 동안 얼음에 샘플을 인큐베이션. 초음파 처리 후 서스펜션이 약간 더 어둡게 보일 수 있습니다.퇴적물 54에서 초음파 심립분리에 의해 멤브레인 파편, 16 시간 동안 000 g 또는 섭씨 4도에서 5 시간 동안 98, 000 g. 상류제를 데칭하고 클로로폼 추출을 진행한다. 사용된 버퍼 A의 총 양을 기준으로 버퍼 B의 볼륨을 계산합니다.원심분리기 튜브에서 균질화로 냉동 퇴적물을 옮기. 버퍼 B의 미토콘드리아 막의 펠릿을 작은 두스균제의 도움으로 재중단합니다. 서스펜션을 50밀리리터 원내 튜브로 옮는다.얼음에서 샘플을 제거하고 샘플과 모든 솔루션을 실온에서 유지하여 나머지 단계를 수행합니다. 그런 다음 HCl으로 조정된 두 개의 어어 트리로 포화된 클로로폼을 pH 8.5, 1대 1로 추가합니다. 캡을 단단히 닫고 정확히 20초 동안 샘플을 힘차게 흔들어 줍니다.즉시 실온에서 5 분 동안 8, 400g에서 혼합물을 원심 분리합니다. 다음으로, 상부, 흐린 수성 위상을 1.6 밀리리터 마이크로튜브로 옮기. 클로로폼 처리에 의해 제거된 억제제를 대체하기 위해 시료에 프로테아제 억제제를 첨가한다.원심 분리는 실온에서 30 분 동안 13, 000g에서 샘플을 원심 분리합니다. 스핀 후, 상체를 신선한 마이크로튜브로 옮기고 원심분리를 반복하여 남은 불용성 물질을 제거합니다. 280나노미터의 흡수도가 안정될 때까지 분당 5밀리리터의 유속으로 50밀리리터의 Q 컬럼 버퍼를 가진 빠른 단백질 액체 크로마토그래피 시스템에 부착된 5밀리리터 음이온 교환 Q 컬럼을 상형화한다.평형 컬럼에 분당 1밀리리터의 유량으로 상체를 적재합니다. 280 나노미터의 흡광도가 백그라운드에서 안정될 때까지 기다립니다. 분당 0.5 밀리리터의 유량으로 Q 컬럼 용출 버퍼의 25 밀리리터 선형 그라데이션을 0%에서 100%로 적용하고 1밀리리터 분획을 수집합니다.분석 10 pH 8.0에서 풀만 ATPase 분석에 의해 반응 혼합물의 밀리리터에 대한 ATP 가수분해 활성에 대한 주요 용출 피크에 대응하는 각 개별 분획의 마이크로리터. ATPase 활동을 나타내는 분수에 풀을 이수합니다. 100, 000 분자량 차단 PES 필터를 200 내지 500 마이크로리터로 스핀 컬럼을 사용하여 멤브레인 울트라 여과에 의한 풀이 된 샘플을 농축한다.그런 다음 크기 배제 크로마토그래피를 진행합니다. 분당 0.5 밀리리터의 유량으로 SEC 버퍼의 최소 48 밀리리터와 액체 크로마토그래피 시스템에 부착된 Superose 6 증가 컬럼을 평형화합니다. 샘플을 열에 적용합니다.0.25 밀리리터 분획을 수집하는 동안 분당 0.25 밀리리터의 유량으로 크로마토그래피를 실행합니다. 다음으로, SDS-PAGE에서 UV 280 나노미터 흡광도 추적의 피크에 해당하는 분획의 10마이크로리터를 실행한다. 그런 다음 쿠마시 블루로 샘플을 얼룩지게합니다.분석하여 풀만 ATPase 분석에 의한 ATP 가수분해 활성 및 아지드 감도에 대한 F1 피크를 포함하는 첫 번째 주요 피크에 해당하는 분획을 말합니다. 그런 다음 BCA 분석기를 수행하여 단백질 농도를 결정합니다. 마지막으로, 정화된 F1-ATPase를 실온에서 유지하고 다운스트림 응용 제품에 대한 정화 후 3 일 이내에 사용합니다.음이온 교환 크로마토그래피의 이러한 용출 프로파일은 용출 완충제에서 280 나노미터 및 염화나트륨 농도에서 UV 흡광도를 표시합니다. 선택된 분획은 SDS-PAGE 젤에 분리되고 쿠마시 블루 염료로 염색되었습니다. 음이온 교환 크로마토그래피로부터 의 주요 용출 피크에 대응하고 F1-ATPase를 포함하는 분획은 풀레이션, 농축 및 크기 배제 크로마토그래피를 위한 입력으로 사용되었다.주요 오염 물질은 디하이드로리포일 탈수소효소로, 크기 배제 크로마토그래피 컬럼에서 이산 피크로 엘레우트합니다. F1-ATPase는 첫 번째 지배적 인 대칭 피크에서 엘utes. SDS-PAGE를 통해 정제된 F1-ATPase를 분리한 후 전형적인 밴드 패턴의 쿠마시 블루 염색은 베타 서브유닛 위에 보이는 산발적인 약한 밴드를 나타내며, 이는 알파 3개의 베타 세 헤드피스, 알파 및 베타 서브유닛의 아편, 디머 및 올리고머의 서브콤함을 나타내며, 질량에 의한 오염 물질 검출이 없는 다.클로로폼 추출을 수행하는 동안, 프로토콜의 중요한 단계는, 시료를 적극적으로 흔들고 유기 및 수성 상의 원심 분리를 즉시 진행하는 것이 필수적이다. 이 절차에 따라 격리된 F1-ATPase는 질량 분석법에 의해 자세히 특성화될 수 있습니다. 또한, 활동 적 시도 나 구조 연구에 사용할 수 있습니다., 자체적으로 또는 다양 한 억제제 또는 기판 아날로그의 존재.

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Isolation of F1-ATPase from the Parasitic Protist Trypanosoma brucei

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Isolation of Cognate RNA-protein Complexes from Cells Using Oligonucleotide-directed Elution

올리고 뉴클레오티드 지시 용출을 사용하여 세포에서 동족 RNA 단백질 단지의 분리

Ribonucleoprotein particles direct the biogenesis and post-transcriptional regulation of all mRNAs through distinct combinations of RNA binding proteins. ...

연구

생화학

An Efficient Method for the Isolation of Highly Purified RNA from Seeds for Use in Quantitative Transcriptome Analysis

양 사체 (Transcriptome) 분석에있는 사용을위한 씨앗에서 매우 정제 된 RNA의 분리를위한 효율적인 방법

Plant seeds accumulate large amounts of storage reserves comprising biodegradable organic matter. Humans rely on seed storage reserves for food and as ...

Tandem Affinity Purification of Protein Complexes from Eukaryotic Cells

진핵 세포에서 단백질 복합체의 탠덤 선호도 정화

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo ...

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

절연 및 호흡 측정의 미토 콘 드리 아 애기 thaliana 에서

Mitochondria are essential organelles involved in numerous metabolic pathways in plants, most notably the production of adenosine triphosphate (ATP) from ...

Protein Digestion, Ultrafiltration, and Size Exclusion Chromatography to Optimize the Isolation of Exosomes from Human Blood Plasma and Serum

단백질 소화, 한, 및 크기 배제 크로마토그래피 인간의 혈장 및 혈 청에서 Exosomes의 절연을 최적화 하

Exosomes, a type of nanovesicle released from all cell types, can be isolated from any bodily fluid. The contents of exosomes, including proteins and ...

Rapid Isolation of the Mitoribosome from HEK Cells

HEK 세포에서 Mitoribosome의 신속한 격리

The human mitochondria possess a dedicated set of ribosomes (mitoribosomes) that translate 13 essential protein components of the oxidative ...

Isolation of Tissue Extracellular Vesicles from the Liver

간에서 조직 세포 외 소포의 격리

Extracellular vesicles (EVs) can be released from many different cell types and detected in most, if not all, body fluids. EVs can participate in ...

Isolation of Lipoprotein Particles from Chicken Egg Yolk for the Study of Bacterial Pathogen Fatty Acid Incorporation into Membrane Phospholipids

세균성 병원체 지방산 을 막 인지질로 통합하는 연구를 위해 닭 계란 노른자에서 지단백질 입자의 분리

Staphylococcus aureus and other Gram-positive pathogens incorporate fatty acids from the environment into membrane phospholipids. During infection, the ...

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

Translating Ribosome Affinity Purification TRAP for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

생체 내피 세포에서 RNA 격리를 위한 리보솜 친화성 정제(TRAP) 번역

Many studies have been limited to using in vitro cellular assays and whole tissues or isolating of specific cell types from animals for in vitro analysis ...

Ready-To-Use qPCR for Detection of DNA from Trypanosoma cruzi or Other Pathogenic Organisms

Ready-To-Use qPCR for Detection of DNA from Trypanosoma cruzi or Other Pathogenic Organisms

트리파노소마 크루지 또는 기타 병원성 유기체의 DNA 검출을 위한 즉시 사용 가능한 qPCR

Real-time PCR (qPCR) is a remarkably sensitive and precise technique&#160;that allows for amplifying&#160;minute amounts of nucleic acid targets from a ...