Name: isolation of f1-atpase from the parasitic protist trypanosoma brucei
Uploaded: 2019-01-22T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of F1-ATPase from the Parasitic Protist Trypanosoma brucei at JoVE.com

Dette arbeidet ble finansiert av departementet for utdanning ERC CZ gi LL1205, Grant Agency of Tsjekkia stipendet 18-17529S, og av ERDF/ESF prosjekt senter for forskning av virusets og virulens av parasitter (nr. CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_019/0000759).

1. buffere og løsninger
<ol><li>Forberede løsningene nedenfor. Degas alle buffere for flytende kromatografi. Legge til ADP, benzamidine og protease hemmere like før bruk.<ol>
<li>Forberede buffer A: 50 mM Tris buffer med saltsyre (Tris-HCl) pH 8.0, 0,25 M sukrose, 5 mM benzamidine, 5 mM aminocaproic syre (ACA) og protease hemmere (10 µM amastatin, 50 µM bestatin, 50 µM pepstatin, 50 µM leupeptin og 50 µM diprotin A).</li>
		<li>Forberede buffer B: 50 mM Tris-HCl pH 8.0, 0,25 M sukrose, 4 mM ethylenediaminetetra...

<ol>
	<li>Walker, J. E., Wikstr&#246;m, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure,+mechanism+and+regulation+of+ATP+synthases.">Structure, mechanism and regulation of ATP synthases.</a> Mechanisms of Primary Energy Transduction in Biology. , 338-373 (2017).</li><li>Pullman, M. E., Penefsky, H. S., Datta, A., Racker, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partial+resolution+of+the+enzymes+catalyzing+oxidative+phosphorylation.+I.+Purification+and+properties+of+soluble+dinitrophenol-stimulated+adenosine+triphosphatase.">Partial resolution of the enzymes catalyzing oxidative phosphorylation. I. Purification and properties of soluble dinitrophenol-stimulated adenosine triphosphatase.</a> The Journal of Biological Chemistry. 235, 3322-3329 (1960).</li><li>Schatz, G., Penefsky, H. S., Racker, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partial+resolution+of+the+enzymes+catalyzing+oxidative+phosphorylation.">Partial resolution of the enzymes catalyzing oxidative phosphorylation.</a> XIV. The Journal of Biological Chemistry. 242 (10), 2552-2560 (1967).</li><li>Racker, E., Horstman, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partial+resolution+of+the+enzymes+catalyzing+oxidative+phosphorylation.+13.+Structure+and+function+of+submitochondrial+particles+completely+resolved+with+respect+to+coupling+factor.">Partial resolution of the enzymes catalyzing oxidative phosphorylation. 13. Structure and function of submitochondrial particles completely resolved with respect to coupling factor.</a> The Journal of Biological Chemistry. 242 (10), 2547-2551 (1967).</li><li>Senior, A. E., Brooks, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+the+mitochondrial+oligomycin-insensitive+ATPase.+I.+An+improved+method+of+purification+and+the+behavior+of+the+enzyme+in+solutions+of+various+depolymerizing+agents.">Studies on the mitochondrial oligomycin-insensitive ATPase. I. An improved method of purification and the behavior of the enzyme in solutions of various depolymerizing agents.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 140 (1), 257-266 (1970).</li><li>Tzagoloff, A., Meagher, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+the+mitochondrial+membrane+system.+V.+Properties+of+a+dispersed+preparation+of+the+rutamycin-sensitive+adenosine+triphosphatase+of+yeast+mitochondria.">Assembly of the mitochondrial membrane system. V. Properties of a dispersed preparation of the rutamycin-sensitive adenosine triphosphatase of yeast mitochondria.</a> The Journal of Biological Chemistry. 246 (23), 7328-7336 (1971).</li><li>Beechey, R. B., Hubbard, S. A., Linnett, P. E., Mitchell, A. D., Munn, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+rapid+method+for+the+preparation+of+adenosine+triphosphatase+from+submitochondrial+particles.">A simple and rapid method for the preparation of adenosine triphosphatase from submitochondrial particles.</a> Biochemical Journal. 148 (3), 533-537 (1975).</li><li>Tyler, D. D., Webb, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+properties+of+the+adenosine+triphosphatase+released+from+the+liver+mitochondrial+membrane+by+chloroform.">Purification and properties of the adenosine triphosphatase released from the liver mitochondrial membrane by chloroform.</a> Biochemical Journal. 178 (2), 289-297 (1979).</li><li>Hack, E., Leaver, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+alpha-subunit+of+the+maize+F1-ATPase+is+synthesised+in+the+mitochondrion.">The alpha-subunit of the maize F1-ATPase is synthesised in the mitochondrion.</a> The EMBO Journal. 2 (10), 1783-1789 (1983).</li><li>Dunn, P. P., Slabas, A. R., Moore, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+F1-ATPase+from+cuckoo-pint+(Arum+maculatum)+mitochondria.+A+comparison+of+subunit+composition+with+that+of+rat+liver+F1-ATPase.">Purification of F1-ATPase from cuckoo-pint (Arum maculatum) mitochondria. A comparison of subunit composition with that of rat liver F1-ATPase.</a> Biochemical Journal. 225 (3), 821-824 (1985).</li><li>Satre, M., Bof, M., Vignais, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+Escherichia+coli+adenosine+triphosphatase+with+aurovertin+and+citreoviridin:+inhibition+and+fluorescence+studies.">Interaction of Escherichia coli adenosine triphosphatase with aurovertin and citreoviridin: inhibition and fluorescence studies.</a> Journal of Bacteriology. 142 (3), 768-776 (1980).</li><li>Abrahams, J. P., Leslie, A. G., Lutter, R., Walker, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+at+2.8+&#197;+resolution+of+F1ATPase+from+bovine+heart+mitochondria.">Structure at 2.8 &#197; resolution of F1ATPase from bovine heart mitochondria.</a> Nature. 370 (6491), 621-628 (1994).</li><li>Lutter, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallization+of+F1-ATPase+from+bovine+heart+mitochondria.">Crystallization of F1-ATPase from bovine heart mitochondria.</a> Journal of Molecular Biology. 229 (3), 787-790 (1993).</li><li>Kabaleeswaran, V., Puri, N., Walker, J. E., Leslie, A. G., Mueller, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+features+of+the+rotary+catalytic+mechanism+revealed+in+the+structure+of+yeast+F1-ATPase.">Novel features of the rotary catalytic mechanism revealed in the structure of yeast F1-ATPase.</a> The EMBO Journal. 25 (22), 5433-5442 (2006).</li><li>Shirakihara, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+a+thermophilic+F1-ATPase+inhibited+by+an+epsilon-subunit:+deeper+insight+into+the+epsilon-inhibition+mechanism.">Structure of a thermophilic F1-ATPase inhibited by an epsilon-subunit: deeper insight into the epsilon-inhibition mechanism.</a> The FEBS Journal. 282 (15), 2895-2913 (2015).</li><li>Stocker, A., Keis, S., Cook, G. M., Dimroth, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification,+crystallization,+and+properties+of+F1-ATPase+complexes+from+the+thermoalkaliphilic+Bacillus+sp.+strain+TA2.A1.">Purification, crystallization, and properties of F1-ATPase complexes from the thermoalkaliphilic Bacillus sp. strain TA2.A1.</a> Journal of Structural Biology. 152 (2), 140-145 (2005).</li><li>Ferguson, S. A., Cook, G. M., Montgomery, M. G., Leslie, A. G., Walker, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+thermoalkaliphilic+F1-ATPase+from+Caldalkalibacillus+thermarum.">Regulation of the thermoalkaliphilic F1-ATPase from Caldalkalibacillus thermarum.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (39), 10860-10865 (2016).</li><li>Cataldi de Flombaum, M. A., Frasch, A. C. C., Stoppani, A. O. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenosine+triphosphatase+from+Trypanosoma+cruzi:+purification+and+properties.">Adenosine triphosphatase from Trypanosoma cruzi: purification and properties.</a> Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Comparative Biochemistry. 65 (1), 103-109 (1980).</li><li>Williams, N., Frank, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrial+ATP+synthase+of+Trypanosoma+brucei:+isolation+and+characterization+of+the+intact+F1+moiety.">The mitochondrial ATP synthase of Trypanosoma brucei: isolation and characterization of the intact F1 moiety.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. 43 (1), 125-132 (1990).</li><li>Higa, A. I., Cazzulo, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mg2+-activated+adenosine+triphosphatase+from+Crithidia+fasciculata:+purification+and+inhibition+by+suramin+and+efrapeptin.">Mg2+-activated adenosine triphosphatase from Crithidia fasciculata: purification and inhibition by suramin and efrapeptin.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. 3 (6), 357-367 (1981).</li><li>Walker, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+structure+and+subunit+stoichiometry+of+F1-ATPase+from+bovine+mitochondria.">Primary structure and subunit stoichiometry of F1-ATPase from bovine mitochondria.</a> Journal of Molecular Biology. 184 (4), 677-701 (1985).</li><li>Mueller, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ni-chelate-affinity+purification+and+crystallization+of+the+yeast+mitochondrial+F1-ATPase.">Ni-chelate-affinity purification and crystallization of the yeast mitochondrial F1-ATPase.</a> Protein Expression and Purification. 37 (2), 479-485 (2004).</li><li>Gahura, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+F1-ATPase+from+Trypanosoma+brucei+is+elaborated+by+three+copies+of+an+additional+p18-subunit.">The F1-ATPase from Trypanosoma brucei is elaborated by three copies of an additional p18-subunit.</a> The FEBS Journal. 285 (3), 614-628 (2018).</li><li>Montgomery, M. G., Gahura, O., Leslie, A. G. W., Zikova, A., Walker, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATP+synthase+from+Trypanosoma+brucei+has+an+elaborated+canonical+F1-domain+and+conventional+catalytic+sites.">ATP synthase from Trypanosoma brucei has an elaborated canonical F1-domain and conventional catalytic sites.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (9), 2102-2107 (2018).</li><li>Schneider, A., Charriere, F., Pusnik, M., Horn, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+mitochondria+from+procyclic+Trypanosoma+brucei.">Isolation of mitochondria from procyclic Trypanosoma brucei.</a> Methods in Molecular Biology. 372, 67-80 (2007).</li><li>Smith, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+protein+using+bicinchoninic+acid.">Measurement of protein using bicinchoninic acid.</a> Analytical Biochemistry. 150 (1), 76-85 (1985).</li><li>Wirtz, E., Leal, S., Ochatt, C., Cross, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tightly+regulated+inducible+expression+system+for+conditional+gene+knock-outs+and+dominant-negative+genetics+in+Trypanosoma+brucei.">A tightly regulated inducible expression system for conditional gene knock-outs and dominant-negative genetics in Trypanosoma brucei.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. 99 (1), 89-101 (1999).</li><li>Speijer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+respiratory+chain+from+cultured+Crithidia+fasciculata.">Characterization of the respiratory chain from cultured Crithidia fasciculata.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. 85 (2), 171-186 (1997).</li><li>Nelson, R. E., Aphasizheva, I., Falick, A. M., Nebohacova, M., Simpson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+I-complex+in+Leishmania+tarentolae+is+an+uniquely-structured+F1-ATPase.">The I-complex in Leishmania tarentolae is an uniquely-structured F1-ATPase.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. 135 (2), 221-224 (2004).</li><li>Carbajo, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+the+N-terminal+domain+of+the+OSCP+subunit+of+bovine+F1Fo-ATP+synthase+interacts+with+the+N-terminal+region+of+an+alpha+subunit.">How the N-terminal domain of the OSCP subunit of bovine F1Fo-ATP synthase interacts with the N-terminal region of an alpha subunit.</a> Journal of Molecular Biology. 368 (2), 310-318 (2007).</li><li>Bowler, M. W., Montgomery, M. G., Leslie, A. G., Walker, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ground+state+structure+of+F1-ATPase+from+bovine+heart+mitochondria+at+1.9+&#197;+resolution.">Ground state structure of F1-ATPase from bovine heart mitochondria at 1.9 &#197; resolution.</a> The Journal of Biological Chemistry. 282 (19), 14238-14242 (2007).</li></ol>

Protokollen for F-1-ATPase rensing fra T. brucei ble utviklet basert på tidligere publiserte metoder for isolering av F-1-ATPase komplekser fra andre arter13,14. Metoden krever ikke noen genmodifisering (f.eksmerking) og gir et fullt aktive kompleks med alle underenheter stede. Det avgjørende skrittet er kloroform-tilrettelagt utgivelsen av F-1-ATPase fra membran-vedlagt del av enzymet. I rene fra alle eukaryot...

F-type ATP-synthases er membran-bundet roterende multiprotein komplekser som par proton translokasjon over energi-transducing membraner av bakterier og mitokondrier chloroplasts med dannelsen av ATP. Molekylær detaljer om roterende mekanisme ATP syntese er kjent hovedsakelig på grunn av strukturelle studier av renset bakteriell og mitokondrie ATP synthases og deres subcomplexes1. F-type ATP syntase er organisert i membran-egenverdi og membran-ytre moieties. Den membran-ytre delen, kjent som F-1-ATPase, inneholder tre katalytisk områder, der fosforylering av adenosindifosfat (ADP) ATP eller omvendt reaksjonen oppstår. F-1-ATPase kan frigis eksperimentelt fra membran-innebygde moiety samtidig som du beholder sin evne til å hydrolyze, men ikke syntetisere, ATP. Membran-bundet sektoren, kalt Fo, formidler protein translokasjon, som driver rotasjon av den sentrale delen av enzymet. Den F1 og Fo sektorer er forbundet med de sentrale og perifere stilkene.
Første forsøk på å rense F-1-ATPase fra spirende gjær og storfe hjertet mitokondrier dato tilbake til 1960. Disse protokollene brukes utdraget mitochondria, som ble forstyrret av sonication, fraksjonert av ammonium eller protamine sulfate nedbør, etterfulgt av valgfrie kromatografi trinn og varmebehandling2,3,4 ,5,6. Rensing var sterkt forbedret og forenklet ved bruk av kloroform, som lett utgivelser F-1-ATPase fra Mitokondrielt Membranen fragmenter7. Kloroform utvinning ble brukt til å trekke ut F1- ATPases fra forskjellige dyr, plante og bakteriell kilder (f.eks, rotte lever8, korn9, Arum maculatum10og Escherichia coli 11). Videre rensing av kloroform utgitt F1-ATPase ved affinity eller størrelse-utestenging kromatografi (SEC) gitt en svært ren protein kompleks som var egnet for høy oppløsning proteinstrukturer av Røntgenkrystallografi, som dokumentert av strukturer av F-1-ATPase fra storfe hjertet12,13 og Saccharomyces cerevisiae14. F-1-ATPase strukturer ble også bestemmes av organismer som er vanskelig å dyrke og dermed hvor mye det første biologisk materialet var begrenset. I dette tilfellet, F-1-ATPase underenheter var kunstig uttrykt og samlet inn i komplekset i E. coliog hele heterologous enzymet ble renset ved affinitet kromatografi via en merket delenhet. Slik tilnærming førte til fastsettelse av F-1-ATPase strukturer fra to varmekjære bakterie-art, Geobacillus stearothermophilus15 og Caldalkalibacillus thermarum16, 17. denne metoden er imidlertid ganske uegnet for eukaryote F-1- ATPases siden den er avhengig av prokaryote protheosynthetic apparater, posttranslational behandling og komplekse samlingen.
Kloroform-baserte utvinning ble tidligere brukt til å isolere F1- ATPases fra encellede digenetic parasitter Trypanosoma cruzi18 og T. brucei19, viktig pattedyr patogener forårsaker amerikanske og Afrikansk trypanosomiases, henholdsvis, og fra monogenic insekt parasitten Crithidia fasciculata20. Disse rene førte bare til en enkel beskrivelse av F-1- ATPases, siden ingen nedstrøms programmer ble brukt for fullt karakterisere komposisjon, strukturen og enzymatiske egenskaper av komplekset. Denne artikkelen beskriver en optimalisert metode for F-1-ATPase rensing fra kulturperler insekt livssyklus scenen av T. brucei. Metoden er utviklet basert på etablerte protokoller for isolering av storfe og gjær F1- ATPases21,22. Prosedyren gir svært rent og homogen enzym egnet for i vitro enzymatisk og inhibitory analyser, detaljert proteomic karakteristikk av massespektrometri23og struktur besluttsomhet24. Protokollen for rensing og kunnskap om F-1-ATPase strukturen på Atom-nivå åpnes mulighet til å utforme skjermer å identifisere små molekyl hemmere, og hjelpe til utvikling av nye legemidler mot afrikanske trypanosomiases. Videre protokollen kan tilpasses å rense F1-ATPase fra andre organismer.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosin Diphosphate Disodium Salt (ADP)</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A0948</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amastatin Hydrochloride</td>
			<td>Glantham Life Sciences</td>
			<td>GA1330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aminocaproic Acid</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A2266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>ThermoFischer Scientific/Pierce</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzamidine Hydrochloride</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>199001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bestatin Hydrochloride</td>
			<td>Sigma Aldrich/Merck</td>
			<td>B8385</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete Tablets, Mini EDTA-free</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4693159001</td>
			<td>Protease inhibitor cocktail tablets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic Acid (EDTA)</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td></td>
			<td>For pH adjustment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ile-Pro-Ile</td>
			<td>Sigma Aldrich/Merck</td>
			<td>I9759</td>
			<td>Alias Diprotin A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leupeptin</td>
			<td>Sigma Aldrich/Merck</td>
			<td>L2884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate Heptahydrate</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pepstatin A</td>
			<td>Sigma Aldrich/Merck</td>
			<td>P5318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Electrophoresis System</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Consumables</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Tubes for SW60Ti, Polyallomer</td>
			<td>Beckman Coulture</td>
			<td>328874</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DounceTissues Homogenizer 2 mL</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Vacuum Filtration Device</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>516-7017</td>
			<td>Degasing solutions for liquid chromatography</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiTrap Q HP, 5 mL</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>17115401</td>
			<td>Anion exchange chromatography column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Regenaretad Cellulose Membrane Filters, pore size 0.45 &#956;m, diameter 47 mm</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>18406--47------N</td>
			<td>Degasing solutions for liquid chromatography</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superdex 200 Increase 10/300 GL</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>29091596</td>
			<td>Size-exclusion chromatography column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vivaspin 6 MWCO 100 kDa PES</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>VS0641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AKTA Pure 25</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>29018224</td>
			<td>Or similar FPLC system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer Shimadzu UV-1601</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td></td>
			<td>Or similar spectrophotometer with kinetic assay mode</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge Beckman Optima with SW60Ti Rotor</td>
			<td>Beckman Coulture</td>
			<td></td>
			<td>Or similar ultracentrifuge and rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic Homogenizer with Thin Probe, Model 3000</td>
			<td>BioLogics</td>
			<td>0-127-0001</td>
			<td>Or similar ultrasonic homogenizer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of f1-atpase from the parasitic protist trypanosoma brucei

F-1-ATPase er en membran-ytre katalytiske subcomplex av F-type ATP syntase, et enzym som bruker proton motiv kraft over biologiske membraner for å produsere adenosin trifosfat (ATP). Isolasjon av intakt F1-ATPase fra opprinnelige kilden er en viktig forutsetning som karakteriserer enzymets protein komposisjon, kinetisk parametere og følsomhet for hemmere. En svært ren og homogen F-1-ATPase kan brukes til strukturell studier som gir innsikt i molekylære mekanismer av ATP syntese og hydrolyse. Denne artikkelen beskriver en fremgangsmåte for rensing av F-1-ATPase fra Trypanosoma brucei, den utløsende agenten for afrikanske trypanosomiases. F-1-ATPase er isolert fra Mitokondrielt blemmer, som er fremstilt ved hypotonisk lysis fra i vitro kultivert trypanosomes. Blemmer er mekanisk fragmentert av sonication og F1-ATPase frigjøres fra indre mitokondrie membranen av kloroform utvinning. Enzymatisk komplekset er ytterligere renset ved påfølgende anion utveksling og størrelse-utestenging kromatografi. Følsom massespektrometri teknikker viste at renset komplekset er blottet for nesten alle protein forurensninger og representerer derfor egnet materiale for proteinstrukturer Røntgenkrystallografi eller cryo-elektronmikroskop. Den isolerte F-1-ATPase viser ATP hydrolytisk aktivitet, som kan bli hemmet fullt av Natriumazid, en potent inhibitor av F-type ATP synthases. Den rensede komplekset forblir stabil og aktiv i minst tre dager ved romtemperatur. Nedbør av ammonium sulfate brukes for langtidslagring. Lignende fremgangsmåter som har blitt brukt for rensing av F-1- ATPases fra pattedyr og plante vev, gjær eller bakterier. Dermed presentert protokollen kan tjene som en retningslinje for F1-ATPase isolert fra andre organismer.

En typisk rensing (figur 1) starter med mitokondrie blemmer (mitoplasts) isolert på Percoll gradient fra hypotonically lysed 1 x 1011 til 2 x 1011 procyclic T. brucei celler25 kultivert i standard glukose-rik SDM-79 middels27. Mitoplasts er fragmentert av sonication, spunnet, og matrise inneholder nedbryting forkastes. Mitokondrielt membraner behandles med kloroform å slippe F-<s...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of F1-ATPase from the Parasitic Protist Trypanosoma brucei at JoVE.com

Isolation of F1-ATPase from the Parasitic Protist Trypanosoma brucei

Denne protokollen beskriver rensing av F-1-ATPase kulturperler insekt scenen Trypanosoma brucei. Prosedyren gir en svært ren, homogen og aktive kompleks egnet for strukturelle og enzymatiske studier.

Isolering av F-1-ATPase fra den parasittiske Protist Trypanosoma brucei

F1-ATPase is a membrane-extrinsic catalytic subcomplex of F-type ATP synthase, an enzyme that uses the proton motive force across biological membranes to ...

Rensingen av F1-ATPase er basert på en klassisk biokjemiske metoder som viste seg å være avgjørende for vår forståelse av mekanismen for ATP-produksjon av andre ATP-syntaser. Den største fordelen med denne teknikken er at den produserer et svært rent enzym egnet for strukturbestemmelse ved røntgenkrystallografi eller kryoelektronmikroskopi. Selv om denne protokollen er optimalisert for isolering av F1-ATPase fra trypanosomer, kan den tilpasses andre kilder, for eksempel vev eller kulturceller, og til ulike patogene protister.Denne teknikken kan føre til identifisering av nye legemidler for å behandle alvorlige menneskelige sykdommer. For eksempel er Mycobacterium tuberculosis F-ATPase et godkjent legemiddelmål for behandling av tuberkulose. For å starte protokollen, tine og forsiktig resuspend mitokondrie vesikler, også kjent som mititoplaster, tidligere isolert av hypotonisk lysis fra en gang 10 til 11 til to ganger 10 til 11 celler av prosyklisk Trypanosoma brucei i fem milliliter iskald buffer A.Hold prøven avkjølt.Deretter bestemmer proteinkonsentrasjonen i suspensjonen av bicinchoninsyre, eller BCA, proteinanalyse i henhold til produsentens instruksjoner. Utfør en BSA-fortynningsserie i ultra rent vann for å konstruere standardkurven. Fortynn en liten mengde av prøven 20 til 100 ganger med ultra rent vann for å passe inn i rekkevidden av BSA-standardene.Etter beregning av den totale proteinmengden i prøven, bringe proteinkonsentrasjonen til 16 milligram per milliliter ved å fortynne den med ekstra Buffer A.Deretter fragmentere mitoplastene i inverterte vesikler og membranbiter ved sonikering syv ganger i 15 sekunder hver, med en total energi på 70 til 100 joule per impuls med en mikrotupp med en diameter på 3,9 millimeter. Mens fragmentering, inkuber prøven på is i 30 sekunder mellom impulser. Etter sonikeringen kan suspensjonen virke litt mørkere.Sediment membranen fragmenter ved ultracentrifugation på 54, 000 g i 16 timer eller ved 98, 000 g i fem timer ved fire grader Celsius. Dekanter det overnaturante og fortsett med kloroformekstraksjonen. Beregn volumet av buffer B basert på den totale mengden buffer A som brukes.Overfør det frosne sedimentet fra sentrifugerøret til homogenisatoren. Resuspend pellet av mitokondriemembraner i Buffer B ved hjelp av en liten Dounce homogenisator. Overfør suspensjonen til et konisk rør på 50 milliliter.Fjern prøven fra is, og hold prøven og alle løsningene ved romtemperatur for de resterende trinnene. Tilsett deretter kloroform mettet med to molar tris justert med HCl til pH 8.5, en til en. Lukk hetten tett, og rist prøven kraftig i nøyaktig 20 sekunder.Sentrifuger blandingen umiddelbart ved 8, 400 g i fem minutter ved romtemperatur. Deretter overfører du den øvre, overskyede vandige fasen til 1,6 milliliter mikrorør. Legg proteasehemmere til prøven for å erstatte hemmerne fjernet av kloroformbehandlingen.Sentrifuger prøvene ved 13.000 g i 30 minutter ved romtemperatur. Etter spinnet overfører du det overnaturlige til friske mikrorør, og gjentar sentrifugeringen for å fjerne gjenværende uoppløselig materiale. Likevekt av den fem milliliter anionutvekslingen Q-kolonnen festet til et raskt protein flytende kromatografisystem med 50 milliliter Q-kolonnebuffer med en strømningshastighet på fem milliliter per minutt til absorbansen ved 280 nanometer og konduktiviteten stabiliserer seg.Legg supernatanten på den likevektede kolonnen med en strømningshastighet på én milliliter per minutt. Vent til absorbansen ved 280 nanometer stabiliserer seg i bakgrunnen. Bruk en 25 milliliter lineær gradering av Q-kolonnens elutionbuffer fra 0 % til 100 % med en strømningshastighet på 0,5 milliliter per minutt og samle inn én milliliter brøker.Analyse 10 mikroliter av hver enkelt brøk tilsvarende den store elution toppen for ATP hydrolytisk aktivitet per på milliliter reaksjonsblanding av Pullman ATPase analyse ved pH 8.0. Pool brøkene som viser ATPase aktivitet. Konsentrer den samlede prøven ved membran ultrafiltrering ved hjelp av en spin-kolonne med et 100 000 molekulært vektkutt PES-filter til 200 til 500 mikroliter.Deretter går du videre til størrelse eksklusjon kromatografi. Likevekt Superose 6 Øk kolonnen festet til et flytende kromatografisystem med minst 48 milliliter SEC-buffer med en strømningshastighet på 0,5 milliliter per minutt. Bruk eksemplet på kolonnen.Kjør kromatografien med en strømningshastighet på 0,25 milliliter per minutt, mens du samler 0,25 milliliter fraksjoner. Deretter kjører du 10 mikroliter av brøkene som tilsvarer toppene i UV 280 nanometer absorbansspor på SDS-PAGE. Deretter flekker prøvene med Coomassie Blue.Analyser fraksjonene som tilsvarer den første store toppen som inneholder F1-toppen for ATP hydrolytisk aktivitet og amidfølsomhet ved Pullman ATPase-analysen. Utfør deretter en BCA-analyse for å bestemme proteinkonsentrasjonen. Til slutt, holde renset F1-ATPase ved romtemperatur, og bruke den innen tre dager etter rensing for nedstrøms applikasjoner.Denne elutionprofilen til en anionutvekslingskromatografi viser UV-absorbansen ved 280 nanometer og konsentrasjon av natriumklorid i elutionbufferen. De valgte brøkene ble separert på SDS-PAGE gel og farget med Coomassie Blue fargestoff. Fraksjonene som tilsvarer den store elution toppen fra anion utveksling kromatografi og inneholder F1-ATPase ble samlet, konsentrert, og brukt som inngang for størrelse-ekskludering kromatografi.Den viktigste kontaminanten er dihydrolipoyldehydrogenase, som elutes fra størrelse-ekskludering kromatografi kolonnen som en diskret topp. F1-ATPase elutes i den første dominerende, i stor grad symmetrisk topp. Coomassie Blue farging av et typisk bånd mønster etter separasjon av renset F1-ATPase via SDS-PAGE viser sporadiske svake bånd synlig over beta subunit, som representerer underkomplekser av alfa tre beta tre headpiece, dimers og oligomers av alfa og beta underenheter, og er blottet for eventuelle forurensninger påviselig av massespektrometri.Mens du utfører kloroformekstraksjonen, det kritiske trinnet i protokollen, er det viktig å riste prøven kraftig og gå videre til sentrifugalseparasjonen av de organiske og vandige fasene umiddelbart. Etter denne prosedyren kan den isolerte F1-ATPase karakteriseres i detalj av massespektrometri. Videre kan den brukes i aktivitetsanalyser eller for strukturelle studier, enten alene eller i nærvær av ulike inhibitorer eller substratanaloger.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biochemistry

Isolation of F1-ATPase from the Parasitic Protist Trypanosoma brucei

Unit 1

Membrane Transport and Active Transporters

SCIENTISTS IN ACTION

Isolation of Cognate RNA-protein Complexes from Cells Using Oligonucleotide-directed Elution

Isolering av beslektede RNA-proteinkomplekser fra celler under anvendelse av oligonukleotid-rettet Eluering

Ribonucleoprotein particles direct the biogenesis and post-transcriptional regulation of all mRNAs through distinct combinations of RNA binding proteins. ...

An Efficient Method for the Isolation of Highly Purified RNA from Seeds for Use in Quantitative Transcriptome Analysis

En effektiv metode for Isolering av høyt renset RNA fra frø for bruk i Quantitative Analysis transcriptome

Plant seeds accumulate large amounts of storage reserves comprising biodegradable organic matter. Humans rely on seed storage reserves for food and as ...

Tandem Affinity Purification of Protein Complexes from Eukaryotic Cells

Tandem Affinity Rensing av protein komplekser fra eukaryote celler

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo ...

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolasjon og respiratoriske målinger av mitokondrier fra Arabidopsis thaliana

Mitochondria are essential organelles involved in numerous metabolic pathways in plants, most notably the production of adenosine triphosphate (ATP) from ...

Protein Digestion, Ultrafiltration, and Size Exclusion Chromatography to Optimize the Isolation of Exosomes from Human Blood Plasma and Serum

Protein fordøyelse, ultrafiltrasjon og størrelse utelukkelse kromatografi å optimalisere isolering av Exosomes fra menneskelig blod Plasma og Serum

Exosomes, a type of nanovesicle released from all cell types, can be isolated from any bodily fluid. The contents of exosomes, including proteins and ...

Rapid Isolation of the Mitoribosome from HEK Cells

Rask isolering av Mitoribosome fra HEK celler

The human mitochondria possess a dedicated set of ribosomes (mitoribosomes) that translate 13 essential protein components of the oxidative ...

Isolation of Tissue Extracellular Vesicles from the Liver

Isolering av tissue ekstracellulære blemmer fra leveren

Extracellular vesicles (EVs) can be released from many different cell types and detected in most, if not all, body fluids. EVs can participate in ...

Isolation of Lipoprotein Particles from Chicken Egg Yolk for the Study of Bacterial Pathogen Fatty Acid Incorporation into Membrane Phospholipids

Isolering av lipoprotein partikler fra Chicken egg eggeplomme for studier av bakteriell patogen fatty acid innlemmelse i membran fosfolipider

Staphylococcus aureus and other Gram-positive pathogens incorporate fatty acids from the environment into membrane phospholipids. During infection, the ...

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

Translating Ribosome Affinity Purification TRAP for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

Oversette ribosom affinitet rensing (TRAP) for RNA Isolation fra endothelial celler in vivo

Many studies have been limited to using in vitro cellular assays and whole tissues or isolating of specific cell types from animals for in vitro analysis ...

Ready-To-Use qPCR for Detection of DNA from Trypanosoma cruzi or Other Pathogenic Organisms

Ready-To-Use qPCR for Detection of DNA from Trypanosoma cruzi or Other Pathogenic Organisms

Klar til bruk qPCR for påvisning av DNA fra Trypanosoma cruzi eller andre patogene organismer

Real-time PCR (qPCR) is a remarkably sensitive and precise technique&#160;that allows for amplifying&#160;minute amounts of nucleic acid targets from a ...